黒色腫切片 3 D 回転楕円体の皮膚モデル

この 3D 器官型黒色腫スフェロイド皮膚モデルの全体的な目標は、体系的な実験的介入に対応しながら、生体内の臓器または腫瘍の構造と多細胞の複雑さの両方を再現することです。この方法は、腫瘍と宿主の相互作用や治療的介入など、黒色腫研究の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、in vivo で血管新生されていない転移の 3D 構造を模倣できることです。

この技術の意味は、腫瘍の不均一性を反映しているため、黒色腫のどの治療法にまで及びます。一般に、この方法に不慣れな個人は、初代細胞の品質が決定的であり、細胞プロセス中に抗生物質を使用しないため、苦労する可能性があります。この技術の意味は、腫瘍の不均一性を反映しているため、黒色腫のどの治療法にまで及びます。

3Dメラノーマ皮膚モデルの適切な取り扱いが非常に重要であるため、この方法を視覚的に示せることが重要です。まず、一般的な細胞培養プロトコルに従って、10%FCSを含有するRPMI培地を使用してメラノーマ細胞451LUを培養する。メラノーマスフェロイドを作製するには、培養したメラノーマ細胞をPBSで洗浄します。

次に、PBSに1回トリプシンEDTAの5ミリリットルを追加します。室温で3〜5分間インキュベートします。トリプシンを中和するために、10%FCSを含む5ミリリットルのRPMIを追加します。

次に、細胞懸濁液を遠心分離チューブに移します。200 g で 5 分間遠心分離し、細胞を回収します。細胞ペレットを10%FCSを含むRPMIに再懸濁します。

次に、細胞を数え、細胞懸濁液を1ミリリットルあたり10, 000細胞の最終濃度に希釈します。電動マルチピペットを使用して、滅菌された非接着性の10cm細胞培養皿の蓋の内面に25マイクロリットルの細胞懸濁液を40個作成します。次に、素早く滑らかな動きで蓋を裏返し、5ミリリットルのPBSが入った細胞培養皿に置きます。

吊り下げ式のドロップディッシュを摂氏37度で5%の二酸化炭素で10〜14日間培養します。最初のドロップスポッティングから5日後に、電子ディスペンサーを使用して、10%FCSを含む10マイクロリットルのRPMIを各ドロップに追加します。10〜15日後、PBSで蓋からスフェロイドをやさしく洗い流して、スフェロイドを採取します。

スフェロイドを新鮮な非接着性の細胞培養皿に集めます。皮膚再建物の真皮対応物を生成するには、8マイクロメートルの細孔サイズのメンブレンインサートを24ウェル細胞培養プレートに配置します。各インサートについて、100, 000個の線維芽細胞をゲル中和溶液に再懸濁します。

次に、線維芽細胞懸濁液をコラーゲンタイプ1とコラーゲンタイプ1を、気泡を形成せずに最終容量500マイクロリットルに1対3の割合ですばやく混合します。次に、ピペットを使用して、サスペンションを各インサートに追加します。滅菌フードの内側に、インサートを培地なしで室温で30分間置き、真皮ゲルが沈殿するまで待ちます。

次に、ゲルをDMEMで覆い、摂氏37度で一晩インキュベートします。一晩のインキュベーション後、真皮ゲルからDMEMを取り出し、EGMで摂氏37度で2時間平衡化して、皮膚再建の表皮対応物を生成します。次に、ピペットを使用してゲルからEGMを取り出します。

次に、100, 000個のケラチノサイトを慎重に播種し、各ゲルの上に100マイクロリットルのEGMに再懸濁します。再構築物を摂氏37度で1時間半インキュベートして、ケラチノサイトが真皮ゲルに付着することを確認します。ピペットチップを使用して、インサート壁から残留ゲルを慎重に取り除きます。

次に、各再構築物を800マイクロリットルのEGMで覆い、5%二酸化炭素で摂氏37度で7日間培養します。小さくて幅の広いピペットチップで内壁から残留ゲルを慎重に取り除きます。8日目に、インサートを6ウェルプレートの別々のウェルに入れます。

次に、1.2〜1.4の転移性黒色腫培地を各ウェルに追加して、皮膚再建物の基部のみを覆います。次に、5%二酸化炭素中で摂氏37度で10〜17日間インキュベートします。各ウェルに1.2〜1.4 mLの転移性黒色腫培地のみを追加して、ウェルの底から皮膚再建物に培地が供給されるようにしますが、培地で覆われていません。

メラノーマスフェロイドをフルスキン再構築の真皮対応物に組み込むには、PBSを使用して、吊り下げ式ドロップセル培養皿の蓋からスフェロイドを慎重に洗い流します。完全な皮膚再建物ごとに、10〜20個のスフェロイドを無菌の非接着性細胞培養皿に集めます。パスツールピペットを使用して、余分なPBSを慎重に取り除きます。

次に、スフェロイドを最小量のEGMで吸引します。次に、それらを100, 000個の線維芽細胞を含む必要量のゲル中和溶液に移します。各インサートについて、スフェロイド懸濁液をコラーゲンタイプ1個と1個ずつ、最終容量500マイクロリットルで1対3の比率で混合します。

最後に、前述のプロトコルで概説されているように、器官型のフルスキン再構築物を生成する。正常なヒトの皮膚を皮膚再建と比較し、3D 器官型の皮膚再建を検証します。パラフィン切片のヘマトキシリンエオシン染色は、皮膚再構成の真皮と表皮が正常な皮膚のものと同等であることを示しています。

正常なヒトの皮膚と皮膚再建体を免疫組織化学的に分析し、表皮の分化を比較します。表皮層別化マーカー、すなわちケラチン14、ケラチン10、インボルクリンおよびフィラグリンに対する免疫染色は、皮膚再建体と正常な皮膚との間のケラチナシド分化のレベルが同程度であることを示しています。ラミニンファイブに対する免疫染色は、基底ラミナが正常な皮膚と同様に、皮膚再建体の表皮と真皮の対応物を生理学的に結合するために形成されることを示しています。

メラノーマスフェロイド皮膚再構築物のパラフィン切片のヘマトキシリンエオシン染色は、メラノーマスフェロイドの細胞分布が、in vivoでの血管新生されていないヒトメラノーマ皮膚転移の細胞分布と類似していることを示しています。組織学的検査により、メラノーマ細胞の末梢増殖性亜集団および中枢壊死性亜集団の存在が明らかになります。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば、約40日で行うことができます。

この手順を試みるときは、最高品質の初代細胞を使用することが重要です。開発後、この技術は、メラノーマの研究者がin vivo模倣環境でin vitroの応答性を探求する道を開きました。このビデオを見た後、人間の3D器官型黒色腫皮膚モデルを生成する方法をよく理解しているはずです。