Name: 分離と大人住血吸虫から細胞外小胞のキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 学ぶ大人Schistosoma japonicumから細胞外小胞を効率的に分離する方法。短期間のin vitro培養でストレスを最小限に抑え、生理学的なEV分泌を維持しながら分離できます。寄生虫生物学研究に有用です。

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本研究は、一部または全部、国家自然科学基金、中国の (31472187 および 31672550) および農業科学と中国農業科学院の技術革新プログラムでサポートされています。

上海中国農業科学院獣医研究所倫理委員会で承認されたすべての動物実験 (許可番号: SHVRIAU-14-0101)。
1住の体外培養。
注:住は、バイオハザードを表しています。労働者は関連生物学的材料をワーム、感染後懸濁液、または他を処理する場合もすべてのラテックス手袋を着用ください。ニュージーランドのウサギは、腹部の被曝経由~ 2,000 セルカリアに感染していた。肝の段階で住は肝臓と腸間膜静脈の血流で 28 日後の感染症で米住血吸虫セルカリアに感染ウサギから収集されました。ワーム コレクションのプロシージャは、マウス18研究報告以前の出版物で参照されています。
<ol><li>500 mL ビーカーに寄生虫を収集します。それらを徹底的に洗浄し、200 ml の軽く 3 倍予熱 (37 ° C) PBS (pH 7.4)。</li>
	<li>各 90 mm のシャーレの ~ 200 ワームのペアを区切ります。寄生虫を徹底的に洗うし、軽く 2 倍の 50 mL の予熱 (37 ° C) RPMI 1640 培養液中のペニシリンとストレプトマイシンの 100 mg/mL 100 U。</li>
	<li>37 ° C 未満 5 %90 mm ペトリで h 2 〜 5 ワームのペア/mL の密度で CO2皿で抗生物質なし予熱した RPMI 1640 培養液 40 mL に寄生虫を維持します。 ノート:RPMI 1640 培地に血清を含めることはできません、それ以外の場合、外因性細胞小胞が導入されます。</li>
</ol>2. 前処理条件メディア
<ol><li>培養液を収集し、2,000 × g の卵を削除し、被蓋の破片をワーム 30 分で 4 ° C にある媒体を遠心分離します。</li>
	<li>新鮮なチューブに上清を転送し、0.22 μ m シリンジ フィルターを使用して、ソリューションをフィルターします。</li>
	<li>透析バッグ フィルタ リング ソリューションを収集 (分子量カットオフ: 3.5kD)、一晩 4 ° C で 8 %peg8000 溶液を使用して、ソリューションを dialyze と。 ノート:この手順は、SjEVs 分離の収量を高めるため SjEVs を豊かにすることが重要です。</li>
</ol>3. SjEVs の単離
<ol><li>透析のソリューションを新しいチューブに転送し、0.5 合計エキソソーム分離試薬量を追加します。</li>
	<li>ボルテックスやソリューションの均一性を確保するため、上下ピペッティングでよくソリューションをミックスします。</li>
	<li>2 の ° C ~ 8 ° C で混合物を一晩インキュベートします。</li>
	<li>2 の ° C ~ 8 ° C で 1 時間 15,000 × g で混合物を遠心分離します。</li>
	<li>吸引し、上澄みを廃棄します。 ノート:EVs は、(ほとんどの場合に表示されません) の管の下部にペレットに含まれています。</li>
	<li>2 mL の PBS で EVs ペレットを再懸濁し、詳細な分析まで-80 ° C で EVs ソリューションします。</li>
</ol>4 西部にしみが付くことによって Ev の特性
<ol><li>例えば、 BCA アッセイで SjEVs サンプルのタンパク質濃度を決定します。</li>
	<li>22.5 μ L RIPA バッファー内の EVs の 10-20 μ g を準備します。バッファーおよび 95 ° C で 5 分間熱ロード x 4 の 7.5 μ L を追加します。</li>
	<li>SjEVs タンパク質を 12 %sds ページのゲルに区切ります。</li>
	<li>PVDF 膜に蛋白質を転送および抗うさぎ IgG HRP (1:5, 000 希釈) に調査続く反 CD63 抗体 (1:1, 000 の希釈) をプローブします。</li>
	<li>膜開発の ECL 検出試薬を使用し、化学発光イメージング システムによって信号を検出します。</li>
</ol>5. 電子顕微鏡による Ev の特性
<ol><li>200 メッシュ ホルムバール コーティング グリッドに孤立した SjEVs の 2 μ l 添加し、室温で乾燥すること。</li>
	<li>1 分リンタングステン酸 2% で染色し、室温で乾燥します。</li>
	<li>透過型電子顕微鏡の試料ホルダーの上にグリッドをロードし、イメージのキャプチャ用 80 kV 電子ビームにさらされています。</li>
</ol>6. SjEVs ラベル PKH67 と細胞取り込みアッセイ
ノート:これ以降の手順は、特に明記しない限り周囲温度 (20-25 ° C) で行われました。
<ol><li>円錐底部ポリプロピレン チューブに 5 μ g SjEVs ソリューションを転送し、RPMI 1640 媒体を追加して 12 mL にボリュームを調整します。</li>
	<li>SjEVs のペレットへの 4 ° C で 90 分 110,000 × g で SjEVs を遠心します。</li>
	<li>遠心分離の後上澄みを慎重に吸引します。 注:これは異種染色および減らされた細胞生存率になると、SjEV ペレットに直接 PKH67 アルコール染料を追加しないでください。</li>
	<li>SjEV ペレット; に 1 mL の希釈剤 C を追加して 2 x EV 停止ソリューションを準備します。完全な分散するように、穏やかなピペッティングで再懸濁します。</li>
	<li>希釈ハ染色直前に希釈 C の 1 ml ポリプロピレン製遠心管に PKH67 エタノール色素溶液 2 μ L を追加し、分散させるためによく混合色素溶液 x 新鮮な 2 を準備します。</li>
	<li>EV 停止 (ステップ 6.4) 2 x の染料の解決 (手順 6.5) とすぐに 1 mL にピペットでサンプルをミックス 2 x の 1 mL を急速に追加します。</li>
	<li>4 分間室温で混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>FBS の 4 つの mL を追加することによって染色を停止し、1 分間インキュベートします。</li>
	<li>12 mL にボリュームを調整して、90 分の 4 ° C で 110,000 × g で遠心分離 RPMI1640 培地を追加します。</li>
	<li>上澄みを除去し、PKH67 ラベル SjEV ペレットを再懸濁しますに RPMI1640 培地を追加します。</li>
	<li>90 分 1 回洗浄し、SjEVs ペレットを再懸濁しますに PBS を追加するための 4 ° C で 110,000 × g で遠心分離機します。</li>
</ol>7. SjEVs 細胞取り込みアッセイ
<ol><li>NCTC など種の哺乳類細胞 1469 セルまたは 6 ウェル プレート (2 × 105細胞/ウェル) HEK293T 細胞を複製し、一晩培養します。</li>
	<li>5 μ g PKH67 ラベル SjEVs を追加し、37 ° C 2-4 h での細胞の培養します。</li>
	<li>インキュベーション後、メディアを取り出して、PBS のセルを 2 回洗います。</li>
	<li>4% ホルムアルデヒド溶液中 15 分間とセルを修正し、PBS で 2 回洗浄します。</li>
	<li>4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) と細胞核を染色します。</li>
	<li>蛍光顕微鏡を用いた細胞を観察します。</li>
</ol>

<ol><li>Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+an+emerging+mechanism+of+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication.</a> Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).</li>
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<li>Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+endurance+exercise-derived+exosomes+to+treat+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases.</a> Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).</li>
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</ol>

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Ev に関する最近の研究は、EVs は、宿主-病原体相互作用3,9,12,16で重要な役割を果たす、住血吸虫を実証しています。さらにアドレスに規制機能のそれは住から EVs を分離するため不可欠であります。ここでは、SjEV の分離のための代替方法をについて説明します。このメソッドは、100 から、SjEVs の広い範囲のサイズを生成 nm ~ 400 nm、アダルトs. ササユリ。次の細胞取り込みアッセイでは、EVs の記述の議定書の下で分離された正常に受信者の細胞によって内面化されたことと、関連付けられている Mirna が潜在的規制の役割17を再生を示されています。
EVs は、可能性がありますは、さまざまな種類の細胞によって分泌され、体液<sup clas...

細胞小胞 (Ev) は、様々 なタンパク質、脂質、核酸でカプセル化されます小さな膜結合型ベシクルの人口です。EVs が細胞間の情報伝達に重要な役割を果たして、細胞の分化、免疫調節、血管新生、セル移行2など多数の生理学的なプロセスの規則にかかわる最近の研究を実証 3,4,5。証拠の蓄積は、EVs を, 循環エクソソーム、および miRNA 貨物が特定疾患6の潜在的なバイオ マーカーを表すことを示します。
トリコモナス、 cruzi トリパノソーマの原因、リーシュ マニア属などのいくつかの原生動物、EVs; を分泌することができることが示されている。寄生虫が見つかってまた7をホストの生活に EVs を分泌します。寄生 EVs 感染、病原性8、および免疫調節9の維持に関与することが示されています。住での最近の調査は両方のマンソン住血吸虫(マンソン住血吸虫など) 10、11 S. ササユリ12アダルト住がありますエキソソームのような小胞を分泌することが示されています。特定の生物学的プロセスの機能の規則にかかわる。
日には、超遠心法、限外濾過法13イムノアフィニティーカラム分離、サイズ排除クロマトグラフィー, ポリマー ベースの試薬の使用など、細胞の小胞を分離するいくつかの方法を使用されています。これらの異なる方法では、独自の利点と制限14を所有しています。一般的に、遠心は小胞の分離のためのゴールド スタンダード メソッドと見なされます。ただし、このメソッドは、潜在的な EV 集計14の制限に苦しみます。
住、いくつかのメソッドは、EV の分離報告されている: 遠心11,12,10といくつかの段階 (卵16、商用 EV 分離キット16の利用が含まれますschistosomula11, アダルト住10,12,17)。ベンチの遠心分離機、限外濾過から EVs を分離するための市販 EV 分離キットの使用を組み合わせた代替法を開発した機構の解明は、1000 ナノメートル数百ナノメートルからのサイズの広い範囲が、アダルト日本住血吸虫。分離の EVs は、通常 100-400 nm の直径を所有し、正常に受信者の細胞によって内面化されました。

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>4478359</td><td>S. japonicum細胞外小胞の単離用</td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-aldrich</td><td>MINI67</td><td>ラベリング用</td></tr><tr><td>Evs RPMI 1640 Medium</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11875119</td><td>寄生虫培養用</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャー SCIENTIFIC</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>0.22&mu;mシリンジフィルター</td><td>Merck</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>68035</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100159&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Beyotime</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>EMDミリポア&trade;イモビロン&トレード;ウェスタン化学発光HRP基質(ECL)</td><td>Fisher scientific</td><td>WBKLS0100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>BCAキット</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>CD63抗体</td><td>Sangon Biotech</td><td>D160973-0025</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>1704273</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 400メッシュ</td><td>Ted Pella</td><td>01754-F</td><td></td></tr><tr><td>Phosphotungstic Acid</td><td>Ted Pella</td><td>19402</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスIgG-HRP</td><td>CWBIO</td><td>CW0102</td><td></td></tr><tr><td>NCTCクローン1469細胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg;CCL-9.1&トレード;</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SV30087.02</td><td></td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE 化学発光イメージングシステム</td><td>GE</td><td>ImageQuant LAS4000mini</td><td></td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>Hitachi</td><td>H-7600</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>Milli-Q</td><td>Milli-Q Elix</td><td></td></tr><tr><td>Eppendor遠心分離機&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>遠心分離機 5804R</td><td></td></tr><tr><td>ゼータサイザー ナノ</td><td>マルバーン</td><td>ゼータサイザー ナノ ZS&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>Beckman</td><td>Optima L-100 XP 超遠心</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>ESCO</td><td>CCL-107B</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axin Observer Z1</td><td></td></tr></tbody></table>

分離と大人住血吸虫から細胞外小胞のキャラクタリゼーション

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

細胞小胞 (Ev) は、膜小胞の細胞外微小環境に様々 な細胞によって放出です。EVs は、異種の小胞の人口は 40 と 1,000 nm 間のサイズの範囲を表しています。蓄積された証拠は、EVs がホスト病原体の相互作用で重要な規制の役割を果たすことを示した。住血吸虫の EVs の深い理解は、住血吸虫ホスト相互作用、住血吸虫症に対する新しい戦略の開発を有効にするメカニズムに洞察力を提供しなければなりません。ここでは、さらにアダルト日本住血吸虫(S. ササユリ) から分離・同定 EVs のためのプロトコルを提示による住で EVs 機能を研究を目指しています。EVs は体外培養液遠心商業エキソソーム分離キットと組み合わせての使用から分離しました。分離されたs. ササユリEVs (SjEVs) は通常 100-400 nm の直径を持つし、透過電子顕微鏡と西部にしみが付くことによって特徴付けられます。PKH67 色素標識 SjEVs の使用は、SjEVs は受信者の細胞によって内面化を実証しています。全体として、我々 のプロトコルは大人住; から EVs を分離するための代替方法を提供します。分離 SjEVs の機能解析が適さない場合があります。

記述のプロトコルを使用して孤立した SjEVs の収量を定量化するには、28 日アダルト住から分離された SjEVs の蛋白質の集中をアクセスするのに BCA タンパク質アッセイを使用しました。表 1に示すように、SjEV 蛋白質の集中は媒体 (表 1) の 100 mL あたり 250 μ g 208 μ g からであった。粒子サイズ モールヴァン ナノ粒子解析によって決定される表示分離 SjEVs が 100 であった nm ~ 400 nm、最高の人口約 220 nm の (図 1)。透過電子顕微鏡による SjEVs のさらなる特性 (図 2) の直径の約 100-200 nm の丸い小胞に EVs を明らかにしました。ウエスタンブロット分析表示、分離 SjEVs 認め CD63 抗体を用いた典型的な EV マーカー (図 3</stron...

ここでは、アダルト住血吸虫から培養体外細胞小胞 (Ev) の分離を記述するプロトコルを提案する.

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

この手順の全体的な目標は、in vitro培養された成体日本住血吸虫の培地から細胞外小胞を分離することです。この方法により、成虫の日本住血吸虫からin vitro培養培地でEVを効率的に分離できます。この技術の主な利点は、短期間のin vitro培養培地から細胞外小胞を効率的に分離できることであり、これにより、非生理的なEV分泌を引き起こす可能性のあるストレスを最小限に抑えることができます。デモンストレーションは、私の研究室の技術者であるJuntao Liu氏が行います。寄生虫を500ミリリットルのビーカーに集め、200ミリリットルの温かいPBSを使用して、十分に、しかし優しく3回洗います。洗浄は短くし、重力沈殿物を使用して寄生虫を分離します。次に、90ミリ皿に、1皿あたり約200ペアのワームを皿に盛り付けます。皿の中で、重力沈殿を使用して寄生虫をさらに2回洗います。これらの洗浄には、ペン連鎖球菌を添加した温かいRPMI培地を使用してください。2回目の洗浄を抗生物質を含まない40ミリリットルの培地と交換します。次に、寄生虫を摂氏37度で5%の二酸化炭素の下で2時間培養します。2時間後、培地をプレートから遠心分離管に移し、卵とワームの破片を摂氏4度で30分間2, 000gでプールします。次に、上清を収集して新しいチューブに移します。次に、0.22ミクロンのシリンジフィルターで上清をろ過し、ろ過した溶液を分子量カットオフ3.5キロダルトンの透析バッグに集めます。次に、8%PEG8000溶液を使用して、摂氏4度で溶液を一晩透析します。このステップは、細胞外小胞の収量を増やすために重要です。翌日、透析溶液を新しいチューブに移し、全エキソソーム単離試薬を0.5容量追加します。溶液が均一になるまで混合し、摂氏約5度で一晩インキュベートします。翌朝、混合物を15, 000 gで摂氏約5度で1時間遠心分離します。次に、上澄みを吸引して廃棄し、EVのペレットを2ミリリットルのPBSに再懸濁します。ペレットはおそらく見えません。ウェスタンブロット解析では、まずBCAアッセイなどを用いてサンプルのタンパク質濃度を決定します。次に、22.5マイクロリットルのRIPAバッファーに10〜20マイクログラムのEVを準備します。次に、7.5マイクロリットルの4Xローディングバッファーを追加し、混合物を摂氏95度で5分間加熱します。熱処理後、12%SDS-PAGEゲル上で細胞外小胞タンパク質を分離します。ゲルを泳動させた後、タンパク質はPVDFメンブレンに移されます。抗CD63抗体で膜を1対1, 000希釈でプローブします。次に、膜を抗ウサギIgG-HRPで1〜5, 000希釈で処理します。次に、ECL検出試薬を使用してメンブレンを開発し、続いて化学発光イメージングシステムでの分析を行います。まず、5マイクログラムのサンプルをポリプロピレン製超遠心チューブに移し、RPMI-1640培地で容量を12ミリリットルに調整します。次に、サンプルを110, 000gで摂氏4度で90分間遠心分離します。遠心分離後、上清を慎重に吸引して廃棄します。次に、ペレットに1ミリリットルの希釈剤Cを加えて、2X細胞外小胞懸濁液を調製します。ペレットを穏やかなピペッティングで再懸濁します。次に、新しい2X色素溶液を調製します。マイクロチューブ内の1ミリリットルの希釈剤Cに2マイクロリットルのPKH67エタノール染料を加え、よく混合します。次に、2つの溶液を混合し、室温で4分間インキュベートしてサンプルを染色します。次に、4ミリリットルのFBSを加えて染色を止め、さらに1分待ちます。次に、RPMI-1640培地を加えて容量を12ミリリットルに調整し、懸濁液をスピンダウンして染色した小胞を分離します。上清を取り除き、廃棄します。次に、ペレット化したPKH67標識EVを12ミリリットルのRPMI-1640培地に再懸濁します。その後、遠心分離を繰り返しますが、今回は1ミリリットルのPBSに小胞を回収します。取り込みアッセイでは、哺乳類細胞の一晩培養物を6ウェルプレートで調製します。翌朝、各ウェルに5マイクログラムのPKH67標識小胞を加え、培養を2〜4時間続けます。インキュベーション後、培地を取り出し、細胞をPBSで2回洗浄します。その後、細胞を15分間固定し、PBSで2回洗浄し、DAPIで染色してからイメージングします。肝臓段階の住血吸虫は、感染後28日目にウサギから採取されました。次に、住血吸虫から細胞外小胞を採取し、分析しました。マルバーンのナノ粒子分析によって決定されたそれらの粒子サイズは、100〜400ナノメートルの範囲であり、人口の大部分は220ナノメートル近くでした。透過型電子顕微鏡により、細胞外小胞は丸く、直径が100〜200ナノメートルであることが明らかになりました。ウェスタンブロッティング分析により、単離された細胞外小胞は、典型的な細胞外小胞マーカーであるCD63抗体を使用して認識されることが示されました。NCTCクローン1469細胞によって内在化されたPKH67標識細胞外小胞の蛍光顕微鏡法は、細胞外小胞が主にレシピエント細胞の細胞質に分布していることを示しました。このビデオを見れば、成虫の日本住血吸虫からin vitro培養液でEVを単離する方法を十分に理解できるはずです。

isolation-characterization-extracellular-vesicles-from-adult

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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セルカリア変換と in vitroで</emの>栽培マンソン住血吸虫 Schistosomules

マンソン住血吸虫の卵は、Tヘルパー2型（Th2型）免疫応答、寄生虫感染症、喘息とアレルギー性炎症の特性の強力な刺激剤である。このプロトコルはS.を利用卵の周りの肺肉芽腫形成、好酸球とマクロファージの代替活性化により特徴付けられる肺のCD4 Th2サイトカインによって誘導される炎症反応を生成するために、...

から卵を使用して、<em&gt;マンソン住血吸虫</em&gt;として<emインビボ&gt;</em蠕虫によって誘発される肺の炎症の&gt;モデル

学ぶ大人Schistosoma japonicumから細胞外小胞を効率的に分離する方法。短期間のin vitro培養でストレスを最小限に抑え、生理学的なEV分泌を維持しながら分離できます。寄生虫生物学研究に有用です。

分離と大人住血吸虫から細胞外小胞のキャラクタリゼーション

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