分離と大人住血吸虫から細胞外小胞のキャラクタリゼーション
2018年5月22日
ここでは、アダルト住血吸虫から培養体外細胞小胞 (Ev) の分離を記述するプロトコルを提案する.
この手順の全体的な目標は、in vitro培養された成体日本住血吸虫の培地から細胞外小胞を分離することです。この方法により、成虫の日本住血吸虫からin vitro培養培地でEVを効率的に分離できます。この技術の主な利点は、短期間のin vitro培養培地から細胞外小胞を効率的に分離できることであり、これにより、非生理的なEV分泌を引き起こす可能性のあるストレスを最小限に抑えることができます。
デモンストレーションは、私の研究室の技術者であるJuntao Liu氏が行います。寄生虫を500ミリリットルのビーカーに集め、200ミリリットルの温かいPBSを使用して、十分に、しかし優しく3回洗います。洗浄は短くし、重力沈殿物を使用して寄生虫を分離します。
次に、90ミリ皿に、1皿あたり約200ペアのワームを皿に盛り付けます。皿の中で、重力沈殿を使用して寄生虫をさらに2回洗います。これらの洗浄には、ペン連鎖球菌を添加した温かいRPMI培地を使用してください。
2回目の洗浄を抗生物質を含まない40ミリリットルの培地と交換します。次に、寄生虫を摂氏37度で5%の二酸化炭素の下で2時間培養します。2時間後、培地をプレートから遠心分離管に移し、卵とワームの破片を摂氏4度で30分間2, 000gでプールします。
次に、上清を収集して新しいチューブに移します。次に、0.22ミクロンのシリンジフィルターで上清をろ過し、ろ過した溶液を分子量カットオフ3.5キロダルトンの透析バッグに集めます。次に、8%PEG8000溶液を使用して、摂氏4度で溶液を一晩透析します。
このステップは、細胞外小胞の収量を増やすために重要です。翌日、透析溶液を新しいチューブに移し、全エキソソーム単離試薬を0.5容量追加します。溶液が均一になるまで混合し、摂氏約5度で一晩インキュベートします。
翌朝、混合物を15, 000 gで摂氏約5度で1時間遠心分離します。次に、上澄みを吸引して廃棄し、EVのペレットを2ミリリットルのPBSに再懸濁します。ペレットはおそらく見えません。
ウェスタンブロット解析では、まずBCAアッセイなどを用いてサンプルのタンパク質濃度を決定します。次に、22.5マイクロリットルのRIPAバッファーに10〜20マイクログラムのEVを準備します。次に、7.5マイクロリットルの4Xローディングバッファーを追加し、混合物を摂氏95度で5分間加熱します。
熱処理後、12%SDS-PAGEゲル上で細胞外小胞タンパク質を分離します。ゲルを泳動させた後、タンパク質はPVDFメンブレンに移されます。抗CD63抗体で膜を1対1, 000希釈でプローブします。
次に、膜を抗ウサギIgG-HRPで1〜5, 000希釈で処理します。次に、ECL検出試薬を使用してメンブレンを開発し、続いて化学発光イメージングシステムでの分析を行います。まず、5マイクログラムのサンプルをポリプロピレン製超遠心チューブに移し、RPMI-1640培地で容量を12ミリリットルに調整します。
次に、サンプルを110, 000gで摂氏4度で90分間遠心分離します。遠心分離後、上清を慎重に吸引して廃棄します。次に、ペレットに1ミリリットルの希釈剤Cを加えて、2X細胞外小胞懸濁液を調製します。
ペレットを穏やかなピペッティングで再懸濁します。次に、新しい2X色素溶液を調製します。マイクロチューブ内の1ミリリットルの希釈剤Cに2マイクロリットルのPKH67エタノール染料を加え、よく混合します。
次に、2つの溶液を混合し、室温で4分間インキュベートしてサンプルを染色します。次に、4ミリリットルのFBSを加えて染色を止め、さらに1分待ちます。次に、RPMI-1640培地を加えて容量を12ミリリットルに調整し、懸濁液をスピンダウンして染色した小胞を分離します。
上清を取り除き、廃棄します。次に、ペレット化したPKH67標識EVを12ミリリットルのRPMI-1640培地に再懸濁します。その後、遠心分離を繰り返しますが、今回は1ミリリットルのPBSに小胞を回収します。
取り込みアッセイでは、哺乳類細胞の一晩培養物を6ウェルプレートで調製します。翌朝、各ウェルに5マイクログラムのPKH67標識小胞を加え、培養を2〜4時間続けます。インキュベーション後、培地を取り出し、細胞をPBSで2回洗浄します。
その後、細胞を15分間固定し、PBSで2回洗浄し、DAPIで染色してからイメージングします。肝臓段階の住血吸虫は、感染後28日目にウサギから採取されました。次に、住血吸虫から細胞外小胞を採取し、分析しました。
マルバーンのナノ粒子分析によって決定されたそれらの粒子サイズは、100〜400ナノメートルの範囲であり、人口の大部分は220ナノメートル近くでした。透過型電子顕微鏡により、細胞外小胞は丸く、直径が100〜200ナノメートルであることが明らかになりました。ウェスタンブロッティング分析により、単離された細胞外小胞は、典型的な細胞外小胞マーカーであるCD63抗体を使用して認識されることが示されました。
NCTCクローン1469細胞によって内在化されたPKH67標識細胞外小胞の蛍光顕微鏡法は、細胞外小胞が主にレシピエント細胞の細胞質に分布していることを示しました。このビデオを見れば、成虫の日本住血吸虫からin vitro培養液でEVを単離する方法を十分に理解できるはずです。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本プロトコルでは、成体の中日血吸虫（Schistosoma japonicum）のインビトロ培養液から細胞外小胞（EVs）を単離する方法について概説します。この手法は、非生理的な分泌を誘発するストレスを最小限に抑えつつ、EVsを効率的に抽出することを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物学
- 寄生虫学
背景
- 細胞外小胞は、細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たしています。
- 日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）は、ヒトの健康に影響を及ぼす重要な寄生虫です。
- EVを単離することで、寄生虫の生物学的特性に関する知見を得ることができます。
- 従来の手法では寄生虫にストレスを与える可能性があり、EVの分泌に影響を及ぼすことがあります。
研究の目的
- Schistosoma japonicumからEVを単離するための信頼性の高いプロトコルを開発すること。
- 単離プロセス中の寄生虫へのストレスを最小限に抑えること。
- 寄生虫生物学におけるEVの役割への理解を深めること。
使用方法
- ビーカー内で成虫のSchistosoma japonicumを回収する。
- 温めたPBSで寄生虫を洗浄し、不純物を除去する。
- 重力沈降法を用いて寄生虫を分離する。
- 培養液からEVを単離する。
主な結果
- 本プロトコルにより、培養液からEVを正常に単離することができます。
- 寄生虫へのストレスを最小限に抑えることで、より生理的なEV分泌が促されます。
- ラボ環境における効率性が実証されています。
- Schistosoma japonicumのEVに関するさらなる研究の基盤を提供します。
結論
- 開発されたプロトコールは、Schistosoma japonicumからEVを単離するのに有効である。
- 今後の研究において、この手法に基づきEVの機能を探索することが可能である。
- 本技術は、寄生虫の相互作用および生物学的特性の理解に寄与する可能性がある。
よくある質問
業界における重要性
寄生性病原体から細胞外小胞（EV）を単離することで、宿主と病原体の相互作用研究におけるメカニズム上のリスクを低減することが可能になります。本プロトコルは、機能解析のために住血吸虫由来のEVを単離する再現性のある手法を提供することで、ターゲットの妥当性確認を支援します。このアプローチは、ダウンストリームのスクリーニングやバイオマーカー研究を妨げる可能性のある培養由来のアーティファクトを最小限に抑え、初期探索における予測の信頼性を高めます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索とターゲットバリデーション
- 科学的価値：EV介在性シグナリングを介した住血吸虫と宿主のコミュニケーション経路の解析を可能にする。
- 実用的価値：下流のオミクス解析や抗体プロファイリングと互換性のある、標準化された分離ワークフローを提供する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 哺乳類細胞モデルにおける取り込みアッセイに適した、定量可能なEV調製物を生成します。
- 実用的価値： PKH67標識を用いることで、アッセイの標準化に向けたEV内部移行の蛍光追跡を可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： 生理的条件下で培養した成体住血吸虫由来のEVを特性評価することにより、疾患に関連するシステム研究を支援します。
- 運用的価値： 定義されたEVサイズ範囲（100-400 nm）およびCD63陽性バイオマーカーの検出を通じて、部門横断的な連携を促進します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、機能解析のための単離EVを提供することにより、ターゲットバリデーションから前臨床モデル開発に至るディスカバリー・コンティニュアムに適合します。
- 発見生物学：ホストの免疫応答を調節する住血吸虫由来因子の仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：ホスト・病原体相互作用モデルにおける化合物スクリーニングのため、標準化されたEVインプットの調製を可能にします。
- 分析：ナノ粒子トラッキング、TEM、およびウェスタンブロットにより、EV特性評価のための定量的な出力を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：組織侵入段階に関連する哺乳類細胞取り込みアッセイの使用を通じて、前臨床への連続性を繋げます。
- エンタープライズ再利用：最小限の再最適化で他の寄生虫系にも適応可能な、再利用可能な分離プラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 生理学的に関連のあるEVを単離することで、住血吸虫の病原性研究におけるメカニズムの曖昧さを軽減します。
- 運用上の価値： 定義された遠心分離、ろ過、および透析ステップを通じて、バッチ間のばらつきを最小限に抑え、再現性を確保します。
- 戦略的価値： EV介在性の作用機序を明確にすることで、抗寄生虫標的選択におけるgo/no-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響： EVに関連する免疫調節能に基づいて、住血吸虫標的のリスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 寄生虫の培養および細胞外小胞（EV）のハンドリング技術に関する専門知識が必要です。
- 超遠心分離機、TEM、および蛍光イメージング設備へのアクセスに依存します。
- EVの回収量と純度評価の一貫性を保つため、チーム間での標準化が必要です。
- 本プロトコルを他の住血吸虫種やライフステージに適用する場合、調整が必要になります。
- 実用上の制限として、透析工程におけるEVの損失の可能性や、一晩のインキュベーション時間への依存が挙げられます。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:04
Title
0:46
Isolating SjEVs from Schistosoma japonicum Cultures
3:00
Characterization of EVs by Western Blotting and TEM
4:01
Labeling Schistosoma japonicum Extracellular Vesicles with PKH67 Followed by Cell Uptake
6:15
Results: Schistosoma japonicum Extracellular Vesicle Characterization
7:17
Conclusion
