Name: Desthiobiotin ストレプトアビジンの親和性による中皮腫細胞の RNA 結合タンパク質の精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 学ぶ中皮腫細胞におけるRNA結合タンパク質の精製法。デスチオビオチン標識RNAオリゴとストレプトアビジン磁性ビーズを用いて、AREモチーフに結合する細胞質タンパク質を特異的に捕獲・同定する技術です。

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この作品は、スイス国立科学財団 Sinergia グラント CRSII3 147697、財団毛皮アメリカ Krebsforschung、チューリッヒ Krebsliga によって支えられました。

1. ゾル性細胞質、核タンパク質画分の調製
<ol><li>プレート 4 × 106 ACC-メソ-4 RPMI - 1640 媒体で育つ T150 細胞培養用フラスコ細胞 10 %fbs、1 x ペニシリン/ストレプトマイシン (100 x) 2 mM L-グルタミン (200 mM) と補われます。細胞が 80-90% (~5-5.5 x 106セル) の合流点に達したら、核と細胞質画分の蛋白質の抽出を続行します。 注: ACC-メソ-4 セルの行は、理化学研究所バイオ リソース センター11から得られました。</li>
	<li>培地を吸引、洗浄し、15 mL の 1x PBS を追加することによって、セル、プレートを軽く数回に傾け、1 × PBS を吸引します。0.25% の 3 mL を加えてトリプシン-EDTA と 3 分の 37 ° C で培養用フラスコを孵化させなさい。 注: 剥離の顕微鏡で細胞を見てください。タップをまだ接続 3 の手の手のひらにフラスコは回します。</li>
	<li>10 %fbs、1 x ペニシリン/ストレプトマイシン (100 x) 2 mM L-グルタミン (200 mM) と RPMI 1640 培の 7 mL を追加し、15 mL チューブに細胞を収集し、5 分の 200 x g でスピンダウンします。</li>
	<li>培地を吸引し、1.5 ml の 1x PBS の細胞ペレットを再懸濁します、1.5 mL 遠心チューブにセルを転送します。スピン ・ ダウン 500 × g で 5 分破棄上清の 4 ° C。 注: このステップから 4 ° C で遠心分離手順をすべて実行して、氷の上すべての試薬。</li>
	<li>冷たい 1.5 ml の 1x PBS の細胞ペレットを再懸濁します、スピン ・ ダウン (500 g) x および 4 ° C で 3 分間のセルは、上澄みを廃棄します。 注: CER の必要量 I、CER II、および NER 試薬、10、0.55、ボリュームをそれぞれパック推定細胞ペレットの 5 冊次のプロトコルは、20 μ L のボリュームを想定しています。CER の試薬の必要量のみを準備をお勧めします私。</li>
	<li>冷たい細胞質抽出試薬を 200 μ l 添加 (CER 私) 100 x の在庫を入手するために水を 500 μ l 添加のプロテアーゼ阻害剤 (EDTA 無添加) 1 タブレットを希釈プロテイナーゼ阻害剤、例えば、x 1 の 2 μ L で補われます。この試薬 CER の量私は 20 μ L のボリューム満載細胞ペレットを溶解するのに十分です。<ol>
<li>細胞ペレット充填量を見積もるには、10、20、50、100 μ L の 1x PBS でいっぱい 1.5 mL チューブ管内細胞ペレットを比較します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>精力的にボルテックス 15 管細胞ペレットを再懸濁します s 管、積極的に 5 の渦に冷たい細胞質抽出試薬 (CER II) の 10 分追加 11 μ L の氷のチューブをインキュベートし、s、氷で 1 分を孵化させなさいと。</li>
	<li>5 s と g x 16,000 でチューブを遠心分離機は積極的に渦と 4 ° C、5 分は、氷の上きれいな中古冷蔵チューブに上清を転送します。上清はさらに細胞質画分は、RNA プルダウン実験で使用されます。</li>
	<li>プロティナーゼの抑制剤 (100 x) と精力的に 15 の渦の 1 μ L を添加した氷核抽出試薬 (NER) の 100 μ L の残りのペレットを再懸濁します s。プロテアーゼ阻害剤を添加した NER 試薬の必要量のみの準備をお勧めします。</li>
	<li>15 時折ボルテックスと 40 分の氷のサンプルをインキュベート s (10 分毎)。</li>
	<li>きれいな中古冷蔵チューブに (これは核タンパク質画分) 清 16,000 x g で 10 分間転送でチューブを遠心します。</li>
	<li>ビシンコニン (BCA) 法を用いたタンパク質の濃度を測定することによってすぐに進む (材料の表を参照してください)。各フラクションのタンパク質の純度を制御するためには、α-チューブリン (細胞質画分にのみ肯定的な検出) とポリ ADP リボース ポリメラーゼ - PARP (核分画でのみ検出) 免疫ブロット (図 1) を実行します。蛋白質の視覚化、セクション 4 を参照してください。</li>
	<li>蛋白質の活動と自分の本来の状態を維持するために細胞質および核エキスの因数の 25 μ L を準備します。5 s-80 ° C で直接ストアに液体窒素でそれらを配置することによってこれらの因数に凍結</li>
</ol>2. Desthiobiotin をもつ RNA のラベリング
<ol><li>市販合成 RNA プローブと HPLC 精製があります。ヌクレアーゼ フリー水 10 μ M を再懸濁します。 メモ: プローブの順序は、表 1に表示されます。</li>
	<li>RNA プルダウン反応あたり RNA の 50 pmol を使用します。氷上のペグ 30%、RNA オリゴのラベル 3' 末端に使用される点を除いてすべての試薬を解凍しています。</li>
	<li>CALB2 としてラベル 3' UTR は 10 μ M RNA プローブの 5 μ L を転送、CALB2 3' UTR (mtARE) と無関係な RNA (怒り) に 0.5 mL 薄肉・遠心管し氷のチューブの場所すぐに 5 分の 85 ° C で PCR 機で孵化させなさい。 注: この手順は重要ですが、リラクゼーションと標識 RNA プローブのアクセシビリティを推進。</li>
	<li>RNA を含むチューブ、次の 10 μ L ミックスに追加シングル 30 μ L 反応: ヌクレアーゼ フリー水の 3 μ L、3 μ L の RNA リガーゼの反応バッファー、RNase 阻害剤の 1 μ L x 10 (40 U/μ L)、Desthiobiotinylated シチジン二リン酸 (1 mM) の 1 μ L、と T4 RNA リガーゼ (20 U/μ L) の 2 μ L。 注: マスター ミックス A 過剰 (3.2) に 3 サンプルで、ミックスを準備するヌクレアーゼの 9.6 μ L 無料水、9.6 μ L の RNA リガーゼの反応バッファー、RNase 阻害剤 3.2 μ x 10 (40 U/μ L)、Desthiobiotinylated シチジン二リン酸 (1 mM) の 3.2 μ L と T4 RNA リガーゼ (20 U/μ L) の 6.4 μ L。</li>
	<li>慎重に 15 μ L の反応に 30% のペグを追加します。別のヒントを使用して、反応をミックスします。16 ° C で一晩反応を孵化させなさい</li>
	<li>次の日、次の準備: 5 M の NaCl (新鮮な/ヌクレアーゼ フリー)、クロロホルム: イソアミル アルコール (例えば反応 - 96 μ L のクロロホルム ・ イソアミル アルコールの 4 μ L あたり)、24:1 の比率で冷たい 100% エタノールと氷 70% エタノール。</li>
	<li>RNA 標識反応管にヌクレアーゼ フリー水の 70 μ L を追加します。100 μ L のクロロホルムを追加: イソアミル アルコールと渦を簡潔に。スピンダウン 13,000 x g で 3 分は慎重に上部段階と; 新しいヌクレアーゼ フリー 1.5 mL チューブへの転送のみを削除下相は触れないでください。</li>
	<li>5 M NaCl、グリコーゲンの 1 μ L と冷えた 100% エタノールの 300 μ L の 10 μ L を追加します。2 時間-20 ° C でチューブを配置します。 注: この手順では、次の日に実験を継続できます。</li>
	<li>13,000 g x と 4 ° C で 15 分間遠心する慎重にペレットを乱すことがなく上澄みを廃棄します。冷たい 70% エタノールや 5 分間遠心する 13,000 x g で再度、4 ° C の 300 μ L を追加します。</li>
	<li>完全に上澄みを廃棄し、空気乾燥ペレット (15 分)。ヌクレアーゼ フリー水の 20 μ L にペレットを再懸濁します。 注: は、同じ日に RNA プルダウンに進みます。</li>
	<li>2 分間 90 ° C で RNA を孵化し、氷の場所します。ストレプトアビジン磁気ビーズの前洗浄の次のステップの間に氷の上標識 RNA を配置します。 注: 長いインキュベーション時間は、RNA プローブを損傷があります。</li>
</ol>3. RNA 蛋白質プルダウン
<ol><li>
前洗浄ストレプトアビジン磁気ビーズと desthiobiotin RNA の孵化
	<ol>
<li>ストレプトアビジン磁気ビーズ 50 pmol RNA あたりの 50 μ L を使用します。ただし、これは、実験によって最適化する必要があります。</li>
		<li>渦 15 s、かつ迅速にきれいな 1.5 mL 安全ロック チューブに削除 200 μ L (マスター ミックス; 3 + 1 の反応を十分) のストレプトアビジン磁気ビーズのチューブは、ピペット チップをカットしました。マグネット スタンドにチューブを置き、ビーズ、チューブの側で収集し、1 分削除再懸濁液を待ちます。</li>
		<li>ビーズを洗浄、マグネット スタンドからチューブを削除、0.1 M NaOH、0.05 M の食塩、ピペットで移しなさい優しく数回上下の 400 μ L を追加します。マグネット スタンドにチューブを置きます。1 分を待ち、上澄みを収集します。この手順をもう一度繰り返します。</li>
		<li>100 mM の NaCl の 200 μ L でビーズを洗浄します。上澄みを除去します。</li>
		<li>トリス (pH 7.5)、ピペッティングでビードを再停止しなさい、マグネット スタンドにチューブを配置、1 分待つ、上澄みを除去 20 mm 200 μ L を追加します。手順を繰り返します。</li>
		<li>マグネット スタンドからチューブを削除 200 μ L の RNA キャプチャ バッファー x 1 を追加して、簡単にボルテックス ストレプトアビジン磁気ビーズを再懸濁します。ストレプトアビジン磁気ビーズの 50 μ L を削除し、各標識 RNA チューブのカットのピペット チップを使用して追加します。チューブ ローラーに室温で 30 分間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA に蛋白質の結合
	<ol>
<li>マグネット スタンドにチューブを置き、1 分待って、上澄みを除去します。</li>
		<li>ビーズに 20 mM トリス (pH 7.5) の 50 μ L を追加し、ピペッティングで再懸濁します。マグネット スタンドにチューブを置き、1 分待って、上清を除去します。この手順を繰り返します。</li>
		<li>ビーズにタンパク質-RNA 結合バッファー x 1 の 100 μ L を追加し、ピペッティングで再懸濁します。</li>
		<li>一方で、次のミックスを準備: タンパク質-RNA 結合バッファー、50% のグリセロールの 30 μ L、50 μ g 細胞質蛋白質のヌクレアーゼ フリー x 10 の 10 μ L の水に 100 μ L。 注: 次のように超過分 (3.3) の 3 サンプルのマスター ミックス B の準備: タンパク質-RNA 結合バッファー x 10 の 33 μ L、50% のグリセロールの 99 μ L、細胞質タンパク質とヌクレアーゼ フリー水 330 μ L. までの 165 μ g マスター ミックス B 氷の上の管を維持します。</li>
		<li>マグネット スタンドにチューブを置いて、1 分待って、上清を収集します。マスター ミックス B の 100 μ L を加えて優しく上下、ピペッティングで再懸濁します泡を作成しないように。ローラーに 4 ° C で 60 分の反応管を孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
洗うと溶出
	<ol>
<li>マグネット スタンドにチューブを配置 (これは流れる - FT) 上清を収集し、新しいチューブに移します。 注意: この FT より遅い分析のための氷の上。</li>
		<li>ビーズの洗浄バッファー x 1 の 100 μ L をピペット、優しく再懸濁します、マグネット スタンドに戻す、1 分を待ち、上澄みを廃棄します。この手順を 2 回繰り返します。</li>
		<li>磁気ビーズに 40 μ L の溶出バッファーを追加、上下、ピペッティングで混ぜる、37 ° C で 30 分間チューブ シェーカー (950 rpm) で孵化させなさい。</li>
		<li>マグネット スタンドにチューブを配置、1 分待ってし、(これは溶出液 - E) 溶出のサンプルを収集します。氷の場所し、下流の分析に使用します。 注: この手順では、各テストの RNA プローブ フロースルー (フィート) と (E) 溶出液のサンプルから成ります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ポリアクリルアミド電気泳動および西部のしみの分析
注: このセクションで使用されるバッファーのためのレシピの表 2 を参照してください。西洋を実行塩化物方法12によるとしみ。
<ol><li>Handcast 12% の SDS ページのゲル (10 井戸、1.5 mm のスペーサー、66 μ L)。実行中のゲル ミックスを準備: 4 mL 原液 30% アクリルアミド-bisacrylamide、低いトリスの 2.4 mL のバッファー、dH2O、TEMED 96 μ 10% アンモニア過硫酸 (APS) の 9.6 μ L の 3.2 mL。スタッキングのゲルのミックスを準備: 3.25 mL dH2O、30% アクリルアミド - bisacrylamide 原液 1.3 mL の上部 Tris バッファーの 0.5 mL、TEMED、10% の 20 μ L の 10 μ L の AP。</li>
	<li>6 x Laemmli バッファーの 16.6 μ L を追加 (例えばトリス/塩酸/SDS pH 6.8 14 mL (上部 Tris バッファー)、SDS、地デジ、6 mL、グリセリン、0.012% ブロモフェノール ブルー; 1.86 g の 2 g-20 ° C で保存) FT サンプルとサンプル E 6 x Laemmli バッファーの 6.6 μ L に。95 ° C で 5 分間のサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>(20 μ L フィートと全体の溶出 〜 40 μ L) サンプルをロードし、60 V、20 V を一晩続行で 30 分間実行します。</li>
	<li>半乾式電気的ブロッティング法を用いた、15 V で 80 分の PVDF 膜に蛋白質を転送します。 注: PVDF 膜はタンパク質の転送を実行する前にアクティブ化する必要があります。1 分、超純水で 2 分間インキュベーションによって続いて 100% メタノールで膜を孵化させなさい。</li>
	<li>タンパク質の転送後は、Coomassie ソリューション各 30 分、超純水で洗浄の 3 つのステップに続いて、3 h の SDS ページのゲルを孵化させなさい。</li>
	<li>タンパク質の転送の終わりに、4.5 の手順で示されているように、1 h. は膜を再アクティブ化のための乾燥 PVDF 膜ができます。膜 1 h と 1 x TTBS 5 %bsa をブロックします。</li>
	<li>最初の抗体を持つ膜を孵化させなさい: ハーや mesothelin、両方の希釈 4 時間室温でまたは一晩 4 ° C で 1 x TTBS で 5 %bsa で 1: 1000</li>
	<li>1 x TTBS で 3 回は 7 分間膜を洗浄し、ウサギ抗マウス ペルオキシダーゼ (HRP) を孵化させなさい-共役二次抗体希釈 5 %bsa、1 x TTBS、1: 10,000。</li>
	<li>化学発光、デジタル イメージャを用いたタンパク質を視覚化します。</li>
</ol>

<ol><li>Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+and+post-transcriptional+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation.</a> FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).</li>
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</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

3' UTRs は非コーディング ゲノム3に属し、すべての非コード Rna 蛋白質7彼らの機能を発揮するために対話できます。哺乳類のゲノムは行き渡って転写されることがわかったし、長鎖非コード Rna16のかなりの部分を生成、これらの長い非コード Rna 機能と対話する遺伝子発現を調節することを示した証拠を新興クロマチン再構築複合体17。この知識は、活用した RNA プルダウン分析によって得られました。したがって、特定の RNA のインターアクターを解読するには、最初のステップかもしれない RNA プルダウンなどの in vitro生化学的アッセイを簡単に実行であります。
注記のうち、シーケンス モチーフだけでなく、RNA の二次構造役割を果たしている重要な RNA 機能のタンパク質との相互作用に不可欠なドメインを形成します。二次構造は生理学的に変わることができるし、の...

MRNA の安定性と mRNA 翻訳レート1に影響を与える遺伝子の発現と遺伝子産物の最後のレベルをしっかりと調節できます。非コーディングの RNA や RNA 結合タンパク質 (Rbp) の標的 mRNA との対話を通じてこれらの転写後調節機構が加わる。それは通常 (3' UTR -2ゲノムの非コーディングの部分に属する) 特定cisを含む mRNA の 3' 非翻訳領域-トランスによって認識される規制要素 (CRE)-miRNA や Rbp などの要因を演技3最高研究cis-3' UTR、内の要素は、アデニンの豊富な要素 (は) モチーフには、特定の AU 結合蛋白質 (AUBP) し、順番が認識誘導か mRNA の分解/deadenylation (は崩壊) または。mRNA 安定4。
サイズ 3' UTR カルレチニンの mRNA (CALB2) は 573 長い bp、AREsite2、bioinformatic ツール5によって予測された、推定 AUUUA いくつが含まれます。推定はモチーフの存在と一貫性のある、pmirGLO ベクトル レポーターアッセイ CALB2 mRNA6要素の安定化の役割を示した。最後にの in vitro RNA プルダウン カルレチニンが安定 AUBP を識別するために使用された mRNA はモチーフを。
すべての非コーディングの Rna とタンパク質7の対話、以来体外RNA プルダウンは分子メカニズムの解読を支援するための良い方法と RNA インターアクターを識別するための最初の選択の試金。この RNA プルダウン法市販合成 RNA プローブは、RNA 鎖の 3' 末端をビオチン (desthiobiotin) の修正された形で付けられましたが使用されていました。RNA desthiobiotin が特に関心のバインド RNA と相互作用するタンパク質をプルダウンに使用される磁気ビーズのストレプトアビジンとの相互作用を介して固定します。中皮腫細胞の細胞質画分から非変性とアクティブな蛋白質は蛋白質のソースとして使用されます。このような RNA 結合タンパク質は、12 %sds ページのゲルを実行、膜に転送され、異なる抗体をプローブの磁気ビーズから溶出されます。
過酷な変性条件は8バインドされたタンパク質を溶出への強力な不可逆的なビオチン ストレプトアビジン結合を破壊するために必要な標準的なストレプトアビジン-ビオチン アフィニティ精製手順での解離を引き起こす可能性蛋白質の複合体。異なり、ビオチン、desthiobiotin は可逆的ストレプトアビジンにバインド、ビオチン、蛋白質の穏やかな溶出を可能にして当然のことながらビオチン化分子の9分離を回避するバッファー溶液で避難は競争力のあります。技法が原産の条件の下でネイティブ蛋白質の複合体を分離するために理想的なことを示唆しています。
体外結合条件と逼迫、塩濃度、還元剤、洗剤の割合によって決定されますが真生体内での相互作用を識別するために携帯電話のコンテキストで現在のものに近いはずです。本実装バインド条件実証されている以前 AU 結合タンパク質10として、ハーを識別するために適切です。このアプローチは、適切な結合条件の最適化は時間がかかり、挑戦をすることができますので、時間を節約できます。さらに、このメソッドは、任意の RNA プルダウン実験開始プロトコルとして使用することができる、塩と洗剤の濃度を変化させ、グリセリンの割合を変更して他の塩を追加することによって徐々 に最適化することができます。さらに、こともいくつをかくまっている短い 25 ヌクレオチド RNA プローブはモチーフに使える特定の AUBP との相互作用を示すデモンストレーションを行った。

<table><tbody><tr><td>NE-PER 核・細胞質抽出キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>78833</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32965</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>20164</td><td>磁気ビーズが含まれているため、キットは 4 °C で保管する必要があります。C</td></tr><tr><td>ピアス RNA 3'デスチオビオチン化キットの終了&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20163</td><td>このキットは「Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit」の一部であり、-20°Cで保管する必要があります。Cプルダウンキット(4°C;C)。</td></tr><tr><td>DynaMag-2,&nbsp; 磁気スタンド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>抗 - HuR (MOUSE) モノクローナル抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td> <td>-</td> <td>抗体は Pierce 磁気 RNA-タンパク質プルダウンキットに含まれています&nbsp; - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - ウサギ 抗マウス二次抗体 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>アンチ - & α; - チューブリン (MOUSE) モノクローナル抗体</td><td>サンタクルス</td><td>8035</td><td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - ウサギ抗マウス二次抗体 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - PARP (RABBIT) ポリクローナル抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9542</td><td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - ヤギ抗ウサギ二次抗体 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>アンチ - メソセリン (MOUSE) モノクローナル抗体&nbsp;</td><td>Rockland</td><td>200-301-A87</td><td></td></tr><tr><td>二次ヤギ抗ウサギ抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>二次ウサギ抗マウス抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI - 1640 medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>FBS - 濾過ウシ血清</td><td>Pan Biotech&nbsp;</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン (100x)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン溶液(200 mM)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA (1x)</td><td>Gibco by Life technologies&nbsp;</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>ミニプロティアン 3 セル</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1653301</td><td></td></tr><tr><td>ミニプロティアンシステムガラスプレート&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN スペーサープレート 1.5 mm 一体型スペーサー</td><td>Bio-Rad</td><td>1653312</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Comb、10 ウェル、1.5 mm、66 & micro;L</td><td>Bio-Rad</td><td>1653365</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules</td><td>Bio-Rad</td><td>1658050</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>ロチフォアーゼゲル 30 - 30% アクリルアミドおよびビスアクリルアミド水溶液 37.5:1 の比率で</td><td>Roth</td><td>3029</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS&nbsp;</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3942</td><td></td></tr><tr><td>PVDF転写膜&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEF1002</td><td>純粋なメタノールで1分間インキュベートした後、水で2分間洗浄することにより活性化する必要があります。</td></tr><tr><td>トランスブロットSDセミドライトランスファーセル&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate</td><td>Bio-Rad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>FusionFX&nbsp;デジタルイメージ</td><td>ャーVilber-RNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オリゴ合成</td><td>Mycrosynth AG、スイス</td><td>-</td><td>合成スケール - 0.04 &micro;mol - HPLC精製</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>塩酸 (HCl) 6 M</td><td>PanReac AppliChem</td><td>182883.1211</td><td></td></tr><tr><td>超高純度 1 M トリス、pH 7.5&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17904</td><td>-20°Cで保存する50%滅菌アリコート;C</td></tr><tr><td>ピアスストレプトアビジン磁気ビーズ&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>88817</td><td>これらの磁気ビーズの平均直径は1&マイクロであることに注意してください。m(0.5〜1.5の範囲&マイクロ;さらに、Dynabeads-M280ストレプトアビジンは、ホモジネーズサイズ2.8&microのビーズです。mは、RNAプルダウンにも使用されますが、これは精製プロセスに影響を与える可能性があることに注意してください。</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム&nbsp;</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>クーマシーG-250</td><td>アプリケーションケム</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>硫酸アルミニウム-(14-18)-水和物&nbsp;</td>オルトリン酸<td>368458</td><td></td> <td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>アプリケム</td><td>A0637</td><td></td></tr></tbody></table>

desthiobiotin ストレプトアビジンの親和性による中皮腫細胞の rna 結合タンパク質の精製

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

In vitro RNA プルダウン、まだ主目的で特定の RNA の構造とモチーフを認識 RNA 結合蛋白質を識別するプロトコルの最初の手順で使用されます。この RNA プルダウン プロトコルで市販合成 RNA プローブがビオチン、ストレプトアビジンに可逆的に結合しより下で蛋白質の溶出がように rna の 3' 末端に、desthiobiotin の変更されたフォームと分類される生理条件。RNA desthiobiotin が特に関心の RNA と相互作用するタンパク質をプルダウンに使用される磁気ビーズのストレプトアビジンとの相互作用を介して固定します。中皮腫細胞の細胞質画分から非変性とアクティブな蛋白質は蛋白質のソースとして使用されます。ここで説明する方法は、知られている RNA 結合タンパク質との興味のシーケンスを含む 25 ヌクレオチド (nt) 長い RNA プローブ間の相互作用の検出に適用できます。これは安定しているか不安定要素ベクトル レポーターアッセイを使用して達成する RNA 分子の存在の機能の解析を完了するのに役立ちます。

この実験では、カルレチニン 3' UTR 遺伝子がモチーフ (CALB2 3' UTR (は) 25 nt) の 25 nt 長いフラグメントはそれは既知 mRNA 安定人間抗原 R (ハー) 蛋白質にとりわけ結合するかどうかをテストするため使用されました。25 nt RNA は要素の特異性をテストするには、プローブ CALB2 3' UTR (mtARE) がモチーフの安定化効果を廃止する以前に示されて、あるモチーフの突然変異を含むだった使用される6。3 番目の RNA プローブ 28 nt である否定的な制御は無関係ゾル性細胞質の鉄応答性タンパク質13,14と結合する明確に定義された鉄応答性エレメント (無関係な RNA (IRE)) を含む RNA を表す。ハーは主に細胞質15mRNA 安定剤として核が関数内でローカライズ、活性タンパク質を細胞質から取得す...

Desthiobiotin ラベル アデニンの豊富な要素 (は) モチーフが含まれている、合成 25 ヌクレオチド RNA oligo のゾル性細胞質が結合タンパク質の特異的結合をことができます。

Desthiobiotin ストレプトアビジンの親和性による中皮腫細胞の RNA 結合タンパク質の精製

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

この手順の全体的な目標は、中皮腫細胞のRNA分子にある特定の配列に結合する細胞質タンパク質を捕捉することです。この方法は、予測されたRNA結合タンパク質が転写産物のアデノシンまたはウリジンリッチ配列に結合できるかどうかなど、RNA生物学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、レポーターアッセイによって評価された安定化または不安定化要素の機能特性評価を補完することです。この技術を実演するのは、私の研究室のポスドクであるJelena Kresoja-Rakic博士です。プロトコールを開始するには、80〜90%のコンフルエンスを持つ事前に調製したACC-MESO-4細胞を入手します。培地を吸引し、15ミリリットルの1Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄し、PBSを吸引します。次に、0.25%トリプシン-EDTAを3ミリリットル加え、培養フラスコを摂氏37度で3分間インキュベートします。7ミリリットルのRPMI-1640培地を添加し、細胞を15ミリリットルのチューブに集め、200倍gで5分間スピンダウンします。次に、培地を吸引し、細胞ペレットを1.5ミリリットルの1X PBSで再懸濁します。次に、細胞を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。細胞を再びgの500倍、摂氏4度で5分間スピンダウンします。スピン後、上清を捨て、細胞ペレットを氷冷した1X PBS1.5ミリリットルで再懸濁し、細胞をgの500倍、摂氏4度で3分間スピンダウンします。上清を捨て、細胞ペレットを含むチューブと10、20、50、および100マイクロリットルの1X PBSを含む1.5ミリリットルのチューブと比較して、細胞ペレットの充填量を推定します。200マイクロリットルの氷冷細胞質抽出試薬(CER I)を添加し、2マイクロリットルの1Xプロテイナーゼ阻害剤を補充します。ペレットを15秒間激しくボルテックスし、チューブを氷上で10分間インキュベートします。11マイクロリットルの氷冷細胞質抽出試薬II(CER II)を5秒間激しく渦巻かせ、チューブを氷上で1分間インキュベートします。サンプルを5秒間激しくボルテックスし、チューブを16, 000倍gで5分間遠心分離します。上清を氷上の清潔で事前に冷やしたチューブに移します。残りのペレットを100マイクロリットルの氷冷核抽出試薬(NER)に再懸濁し、1マイクロリットルのプロテイナーゼ阻害剤を補充し、15秒間激しくボルテックスします。サンプルを氷上で40分間インキュベートし、10分ごとに15秒間ボルテックスします。チューブを16, 000倍gで10分間遠心分離します。核タンパク質画分である上清を、事前に冷却した清潔なチューブに移します。すぐにビシンコニン法を使用してタンパク質濃度を測定します。次に、25マイクロリットルの細胞質抽出物と核抽出物のアリコートを準備します。これらのアリコートを液体窒素に5秒間入れて急速冷凍し、マイナス80°Cで直接保存します。5マイクロリットルの10マイクロモルRNAプローブを0.5ミリリットルの薄肉マイクロ遠心チューブに移し、摂氏85度のPCRマシンで5分間インキュベートします。チューブをすぐに氷の上に置きます。30マイクロリットルの反応を1回行うには、あらかじめ調製した混合物10マイクロリットルをRNA含有チューブに加えます。反応に15マイクロリットルのPEG 30%を慎重に加え、新しいチップを使用して反応を混合します。反応を摂氏16度で一晩インキュベートします。翌日、試薬を準備します。70マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水をRNA標識反応チューブに加えます。100マイクロリットルのクロロホルム - イソアミルアルコールを加え、短時間ボルテックスしてサンプルを13, 000倍gで3分間回転させます。上相のみを慎重に取り外します。下の位相には触れないでください。新しいヌクレアーゼフリーの1.5ミリリットルチューブに移します。10マイクロリットルの5モル塩化ナトリウム、1マイクロリットルのグリコーゲン、および300マイクロリットルの氷冷100%エタノールを追加します。チューブをマイナス20°Cに2時間置きます。2時間後、13, 000倍のgと摂氏4度で15分間遠心分離します。ペレットを乱さないように上清を慎重に捨てます。氷冷した70%エタノールを300マイクロリットル加え、13, 000倍のgと摂氏4度で5分間再度遠心分離します。上清を完全に捨て、ペレットを15分間風乾します。ペレットを20マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に再懸濁します。RNAを摂氏90度で2分間インキュベートし、氷の上に置きます。ストレプトアビジン磁気ビーズの予備洗浄の次のステップで、標識されたRNAを氷上に置きます。RNAの50ピコモルあたり50マイクロリットルのストレプトアビジン磁気ビーズを予め洗浄します。ストレプトアビジン磁気ビーズでチューブを15秒間ボルテックスします。すばやくボルテックスした後、カットされたピペットチップを使用して、200マイクロリットルを清潔な1.5ミリリットルのSafe-Lockチューブに移します。次に、チューブを磁気スタンドに置き、ビーズがチューブの側面に集まるようにし、1分間待ちます。再懸濁液を取り除きます。ビーズを洗浄するには、チューブを磁気スタンドから取り外し、400マイクロリットルの0.1モル水酸化ナトリウム、0.05モルの塩化ナトリウム溶液を追加し、数回静かに上下させます。チューブをマグネットスタンドに戻し、1分間待ちます。次に、上清を収集します。ビーズを200マイクロリットルの100ミリモル塩化ナトリウムで洗い、上清を取り除きます。200マイクロリットルの20ミリモルトリスを加え、ピペッティングでビーズを再懸濁し、チューブを磁気スタンドに置きます。1分後、上清を取り除きます。次に、チューブをマグネティックスタンドから取り外し、200マイクロリットルの1X RNAキャプチャバッファーを加え、短時間ボルテックスしてストレプトアビジン磁気ビーズを再懸濁します。50マイクロリットルのストレプトアビジン磁気ビーズを取り出し、カットしたピペットチップを使用して各標識RNAチューブに加えます。チューブをローラー上で室温で30分間インキュベートします。チューブが磁気スタンドに1分間置かれた後、上清を取り除きます。ビーズに50マイクロリットルの20ミリモルトリスを加え、再懸濁します。次に、チューブを磁気スタンドに入れます。1分後、上清を取り除きます。100 μLの1X protein RNA結合バッファーをビーズに加え、再懸濁します。次に、チューブを磁気スタンドに戻します。チューブがスタンドに1分間入ったら、上清を回収します。100マイクロリットルのマスターミックスBを加え、ピペッティングで静かに上下させて再懸濁し、気泡が発生しないようにします。反応チューブをローラー上で摂氏4度で60分間インキュベートします。洗浄と溶出のステップに進みます。チューブを磁気スタンドに入れ、流れを集めて新しいチューブに移します。ビーズに100マイクロリットルの1X洗浄バッファーをピペットで移し、穏やかに再懸濁し、スタンドに戻し、1分間待ってから上清を捨てます。この手順を 2 回繰り返します。40マイクロリットルの溶出バッファーを磁気ビーズに加え、ピペッティングで上下に混合し、チューブシェーカーでインキュベートします。チューブをマグネットスタンドに入れ、1分間待って溶出液サンプルを採取します。氷上に置いて、下流の分析に使用します。核/細胞質画分の純度を実証するために、タンパク質をウェスタンブロットで分析したところ、α-チューブリンは細胞質画分でのみ検出され、PARPタンパク質は核分画でのみ検出されることが示されました。CALB2 3プライムUTR AREプローブからの溶出液は、ヒトRの結合を示し、変異プローブおよび鉄応答性タンパク質に結合する無関係なRNAプローブからの溶出液には存在しませんでした。CALBの3プライムUTRとヒトRとの間の特異性をさらに実証するために、メンブレンを抗メソセリン抗体でプローブしたところ、3つの溶出物サンプルすべてにメソセリンの存在は示されず、CALB2 3プライムUTR内の安定化AREモチーフがヒトRタンパク質に特異的に結合できることが示されました。ゲルのクマシー染色は、3つの異なるRNAプローブとのインキュベートに同量のタンパク質が使用されたことを示しています。この手順に続いて、特定のタンパク質の免疫沈降のようなタンパク質中心の追加の方法を実行して、どの配列がそれに結合するかなどの追加の問題に対処することができます。その開発後、この技術は、RNA生物学の分野の研究者が特定のRNAの相互作用可能なパートナーを探求する道を開きました。

desthiobiotin-streptavidin-affinity-mediated-purification-rna

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

ペプチジル- tRNAの初期段階を含むリボソームの生化学的解析への大きな障害は、同じサンプル中の他のリボソーム、解析対象の特定のmRNA配列の翻訳に関与していないリボソームの存在となっています。我々は、排他的に、興味の発生期のペプチジル-...

機能と構造解析のためにペプチジル- tRNAを含む翻訳リボソームの分離

このビデオでは、mRNAのアデニル酸ウリジル酸リッチエレメント(ARE)配列と相互作用するRNA結合タンパク質(RBP)を同定するためのin vitro...

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急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

Rhipicephalus microplus腸組織から上皮細胞を単離するために、改変密度遠心分離勾配に基づく方法論を利用した。表面結合タンパク質をビオチン化し、下流の用途に利用するためにストレプトアビジン磁気ビーズで精製した。...

ビオチン化細胞表面タンパク質の精製<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt;上皮腸細胞

このレポートでは、高速かつ信頼性の高い携帯電話の miRNAs の mRNA ターゲットの検証方法について説明します。合成ビオチン化核酸 LNA のロックを用いた miRNA を模倣をキャプチャする使用していた方法は、mRNA をターゲットします。プルダウンにストレプトアビジン コートした磁気ビーズを採用するその後、ターゲット mRNA qPCR...

ビオチン ベース プルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs

内生的に形成された mRNA 蛋白質複合体の回復のためのタンデムの RNA 分離手順 (旅行) を説明します。具体的には、RNA 蛋白質の複合体は、生体内で架橋 polyadenylated Rna ランダムプライマー ビーズ抽出物から分離された、特定の Mrna が変更された RNA アンチセンス オリゴヌクレオチドでキャプチャされます。イムノブロット解析による蛋白質の Mrna...

真核生物 mRNA 蛋白質複合体を回復するオリゴヌクレオチド系タンデム型 RNA の隔離プロシージャ

Botin ストレプトアビジン戦略を使用して精製した RNA ・ タンパク質複合体は、更なる精製および機能解析の不適切なフォームで変性条件下に溶出されます。ここでは、ネイティブと完全に機能 RNA ・ タンパク質複合体をもたらす RNA と穏やかな...

ビオチンと写真分解リンカーに接続されている RNA を用いた高分子複合体のシングル ステップ浄化

ここに示すビオチン標識を用いてインビトロ生化学アッセイを用い、タンパク質-核酸相互作用の研究に広く適用可能なプロトコルを示す。...

ビオチン標識を用いてタンパク質核酸相互作用を研究するインビトロ生化学アッセイ

ここでは、哺乳類細胞におけるRNA結合タンパク質(RRB)のRNA標的を決定するために、フラグビオチンタンデム精製を用いて...

FLAG-ビオチンタンデム精製による架橋と免疫沈降によるタンパク質RNA相互作用のトランスクリプトーム全体プロファイリング

ここでは、ヒト細胞からの総タンパク質抽出物、ビオチン化RNAでコーティングされたストレプトアビジンビーズ、および質量分析を使用して、特定のRNA配列のタンパク質相互作用因子を発見、定量、および検証するための最適化された in vitro メソッドを紹介します。...

短いビオチン化RNAを用いたRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語)

この記事では、ストレプトアビジンベースの生体層干渉法(BLI)システムを使用してDNA-タンパク質相互作用を研究するためのプロトコルについて説明します。本稿では、相互作用の平衡結合親和性(KD)を決定するために、基本的または高度な結合動力学を利用するための基本的なステップと考慮事項を概説しています。...

ストレプトアビジンベースの生体層干渉法によるDNA-タンパク質相互作用の解析

学ぶ中皮腫細胞におけるRNA結合タンパク質の精製法。デスチオビオチン標識RNAオリゴとストレプトアビジン磁性ビーズを用いて、AREモチーフに結合する細胞質タンパク質を特異的に捕獲・同定する技術です。

Desthiobiotin ストレプトアビジンの親和性による中皮腫細胞の RNA 結合タンパク質の精製

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