Desthiobiotin ストレプトアビジンの親和性による中皮腫細胞の RNA 結合タンパク質の精製

この手順の全体的な目標は、中皮腫細胞のRNA分子にある特定の配列に結合する細胞質タンパク質を捕捉することです。この方法は、予測されたRNA結合タンパク質が転写産物のアデノシンまたはウリジンリッチ配列に結合できるかどうかなど、RNA生物学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、レポーターアッセイによって評価された安定化または不安定化要素の機能特性評価を補完することです。

この技術を実演するのは、私の研究室のポスドクであるJelena Kresoja-Rakic博士です。プロトコールを開始するには、80〜90%のコンフルエンスを持つ事前に調製したACC-MESO-4細胞を入手します。培地を吸引し、15ミリリットルの1Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄し、PBSを吸引します。

次に、0.25%トリプシン-EDTAを3ミリリットル加え、培養フラスコを摂氏37度で3分間インキュベートします。7ミリリットルのRPMI-1640培地を添加し、細胞を15ミリリットルのチューブに集め、200倍gで5分間スピンダウンします。次に、培地を吸引し、細胞ペレットを1.5ミリリットルの1X PBSで再懸濁します。

次に、細胞を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。細胞を再びgの500倍、摂氏4度で5分間スピンダウンします。スピン後、上清を捨て、細胞ペレットを氷冷した1X PBS1.5ミリリットルで再懸濁し、細胞をgの500倍、摂氏4度で3分間スピンダウンします。

上清を捨て、細胞ペレットを含むチューブと10、20、50、および100マイクロリットルの1X PBSを含む1.5ミリリットルのチューブと比較して、細胞ペレットの充填量を推定します。200マイクロリットルの氷冷細胞質抽出試薬(CER I)を添加し、2マイクロリットルの1Xプロテイナーゼ阻害剤を補充します。ペレットを15秒間激しくボルテックスし、チューブを氷上で10分間インキュベートします。

11マイクロリットルの氷冷細胞質抽出試薬II(CER II)を5秒間激しく渦巻かせ、チューブを氷上で1分間インキュベートします。サンプルを5秒間激しくボルテックスし、チューブを16, 000倍gで5分間遠心分離します。上清を氷上の清潔で事前に冷やしたチューブに移します。

残りのペレットを100マイクロリットルの氷冷核抽出試薬(NER)に再懸濁し、1マイクロリットルのプロテイナーゼ阻害剤を補充し、15秒間激しくボルテックスします。サンプルを氷上で40分間インキュベートし、10分ごとに15秒間ボルテックスします。チューブを16, 000倍gで10分間遠心分離します。

核タンパク質画分である上清を、事前に冷却した清潔なチューブに移します。すぐにビシンコニン法を使用してタンパク質濃度を測定します。次に、25マイクロリットルの細胞質抽出物と核抽出物のアリコートを準備します。

これらのアリコートを液体窒素に5秒間入れて急速冷凍し、マイナス80°Cで直接保存します。5マイクロリットルの10マイクロモルRNAプローブを0.5ミリリットルの薄肉マイクロ遠心チューブに移し、摂氏85度のPCRマシンで5分間インキュベートします。チューブをすぐに氷の上に置きます。

30マイクロリットルの反応を1回行うには、あらかじめ調製した混合物10マイクロリットルをRNA含有チューブに加えます。反応に15マイクロリットルのPEG 30%を慎重に加え、新しいチップを使用して反応を混合します。反応を摂氏16度で一晩インキュベートします。

翌日、試薬を準備します。70マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水をRNA標識反応チューブに加えます。100マイクロリットルのクロロホルム - イソアミルアルコールを加え、短時間ボルテックスしてサンプルを13, 000倍gで3分間回転させます。

上相のみを慎重に取り外します。下の位相には触れないでください。新しいヌクレアーゼフリーの1.5ミリリットルチューブに移します。

10マイクロリットルの5モル塩化ナトリウム、1マイクロリットルのグリコーゲン、および300マイクロリットルの氷冷100%エタノールを追加します。チューブをマイナス20°Cに2時間置きます。2時間後、13, 000倍のgと摂氏4度で15分間遠心分離します。

ペレットを乱さないように上清を慎重に捨てます。氷冷した70%エタノールを300マイクロリットル加え、13, 000倍のgと摂氏4度で5分間再度遠心分離します。上清を完全に捨て、ペレットを15分間風乾します。

ペレットを20マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に再懸濁します。RNAを摂氏90度で2分間インキュベートし、氷の上に置きます。ストレプトアビジン磁気ビーズの予備洗浄の次のステップで、標識されたRNAを氷上に置きます。

RNAの50ピコモルあたり50マイクロリットルのストレプトアビジン磁気ビーズを予め洗浄します。ストレプトアビジン磁気ビーズでチューブを15秒間ボルテックスします。すばやくボルテックスした後、カットされたピペットチップを使用して、200マイクロリットルを清潔な1.5ミリリットルのSafe-Lockチューブに移します。

次に、チューブを磁気スタンドに置き、ビーズがチューブの側面に集まるようにし、1分間待ちます。再懸濁液を取り除きます。ビーズを洗浄するには、チューブを磁気スタンドから取り外し、400マイクロリットルの0.1モル水酸化ナトリウム、0.05モルの塩化ナトリウム溶液を追加し、数回静かに上下させます。

チューブをマグネットスタンドに戻し、1分間待ちます。次に、上清を収集します。ビーズを200マイクロリットルの100ミリモル塩化ナトリウムで洗い、上清を取り除きます。

200マイクロリットルの20ミリモルトリスを加え、ピペッティングでビーズを再懸濁し、チューブを磁気スタンドに置きます。1分後、上清を取り除きます。次に、チューブをマグネティックスタンドから取り外し、200マイクロリットルの1X RNAキャプチャバッファーを加え、短時間ボルテックスしてストレプトアビジン磁気ビーズを再懸濁します。

50マイクロリットルのストレプトアビジン磁気ビーズを取り出し、カットしたピペットチップを使用して各標識RNAチューブに加えます。チューブをローラー上で室温で30分間インキュベートします。チューブが磁気スタンドに1分間置かれた後、上清を取り除きます。

ビーズに50マイクロリットルの20ミリモルトリスを加え、再懸濁します。次に、チューブを磁気スタンドに入れます。1分後、上清を取り除きます。

100 μLの1X protein RNA結合バッファーをビーズに加え、再懸濁します。次に、チューブを磁気スタンドに戻します。チューブがスタンドに1分間入ったら、上清を回収します。

100マイクロリットルのマスターミックスBを加え、ピペッティングで静かに上下させて再懸濁し、気泡が発生しないようにします。反応チューブをローラー上で摂氏4度で60分間インキュベートします。洗浄と溶出のステップに進みます。

チューブを磁気スタンドに入れ、流れを集めて新しいチューブに移します。ビーズに100マイクロリットルの1X洗浄バッファーをピペットで移し、穏やかに再懸濁し、スタンドに戻し、1分間待ってから上清を捨てます。この手順を 2 回繰り返します。

40マイクロリットルの溶出バッファーを磁気ビーズに加え、ピペッティングで上下に混合し、チューブシェーカーでインキュベートします。チューブをマグネットスタンドに入れ、1分間待って溶出液サンプルを採取します。氷上に置いて、下流の分析に使用します。

核/細胞質画分の純度を実証するために、タンパク質をウェスタンブロットで分析したところ、α-チューブリンは細胞質画分でのみ検出され、PARPタンパク質は核分画でのみ検出されることが示されました。CALB2 3プライムUTR AREプローブからの溶出液は、ヒトRの結合を示し、変異プローブおよび鉄応答性タンパク質に結合する無関係なRNAプローブからの溶出液には存在しませんでした。CALBの3プライムUTRとヒトRとの間の特異性をさらに実証するために、メンブレンを抗メソセリン抗体でプローブしたところ、3つの溶出物サンプルすべてにメソセリンの存在は示されず、CALB2 3プライムUTR内の安定化AREモチーフがヒトRタンパク質に特異的に結合できることが示されました。

ゲルのクマシー染色は、3つの異なるRNAプローブとのインキュベートに同量のタンパク質が使用されたことを示しています。この手順に続いて、特定のタンパク質の免疫沈降のようなタンパク質中心の追加の方法を実行して、どの配列がそれに結合するかなどの追加の問題に対処することができます。その開発後、この技術は、RNA生物学の分野の研究者が特定のRNAの相互作用可能なパートナーを探求する道を開きました。