Name: 迅速かつ安易なパイプラインを生成する突然変異点ゲノムにc. の elegansを用いた CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶCRISPR/Cas9リボ核タンパク質を用いたC. elegansゲノム点突然変異導入法。迅速なプロトコルにより神経変性疾患関連の遺伝的変異の機能解析が可能となり、内因性調節環境下での遺伝子機能研究に有用です。

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すべての動物の世話と実験手順は、国立衛生研究所と動物介護施設使用委員会 (IACUC)、ミシガン大学からガイドラインを追った。RNase フリー ソリューションを使用して、ピペットのプロトコル全体のヒント。RNase 除染液が製造元のガイドライン (表を参照)、次に作業領域、ピペット、チューブ、および遠心分離機をきれい。
1. sgRNA ターゲットの選択
<ol><li>Web ブラウザーを使用して web ページを開く: http://crispor.tefor.net8<ol>
<li>興味の目的の編集を並ぶシーケンスの ~ 60 塩基対 (bp) を入力 (つまり30 bp 5' と 3' の目的の編集)。</li>
		<li>線虫ゲノムをプルダウン メニューから選択します。</li>
		<li>Protospacer 隣接するモチーフを選択 (20 bp NGG - SpCas9、SpCas9-HF1、eSPCas9 1.1) プルダウン メニューから。</li>
		<li>[送信] をクリックします。結果ページで、関心の編集に最も近い上位ランク ターゲット シーケンスを選択します。並ぶ 60 bp 入力シーケンス内の適切なターゲット ・ サイトがない場合は 100 までクエリ シーケンスを展開 bp (すなわち50 bp 目的のいずれかの側を編集)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>利用可能なソース、例えばsynthego から以下の仕様で 20 mer ターゲット sgRNA を取得: 3 nmol;変更はありません。</li>
	<li>受領後、遠心チューブを含む凍結乾燥 sgRNA > 室温で 1 分間 12,000 × g。チューブにヌクレアーゼ フリーのテの 60 μ L を追加し、軽く P200 ピペットを使用して 15-20 回上下ピペッティング再停止します。最終濃度は 50 μ M です。</li>
</ol>2 相同監督修復テンプレート デザイン
<ol><li>SsODN の HDR テンプレート含む設計: 最初と最後の変異を並ぶ 4) 50 bp 5' と 3' の相同性腕 3) NGG PAM シーケンス内で Gs の一方または両方のサイレント突然変異、2) ユニークなフレームに制限酵素サイト 1) 関心の突然変異。(図 1)9,10。<ol>
<li>NGG PAM 一連の突然変異が可能でない場合は、ssODN ヘッダー テンプレートの sgRNA を介した胸の谷間を防ぐために sgRNA ターゲット認識シーケンス内で 5-6 サイレント変異をご紹介します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用可能なソース、例えばidtdna から次のパラメーターを「Ultramer DNA オリゴヌクレオチド」を取得: スケール: 4 nmol;定式化: どれも;浄化: 標準脱塩。</li>
	<li>受領後、遠心チューブを含む凍結乾燥 ssODN > 室温で 1 分間 12,000 × g。軽く P200 ピペットを使用して 15-20 回上下ピペッティングによるにヌクレアーゼ フリー ddH2O の最終濃度 100 μ M の ssODN を中断再。</li>
</ol>3. 設計遺伝子型プライマー
<ol><li>400 ~ 700 bp PCR 増幅11を生成するゲノム修飾を側面に設定プライマーを設計します。</li>
	<li>シングル、特定私アンプリコン11を生成する PCR サイクリング条件を最適化します。</li>
</ol>4. 注入ミックスを準備します。
<ol><li>2 分 4 ° C で最大速度でテーブル 1試薬を遠心分離します。</li>
	<li>順番は、ヌクレアーゼ フリー PCR チューブに表 1試薬を追加します。</li>
	<li>P20 ピペットでピペッティング 10 回上下に優しくによって徹底的にミックスします。</li>
	<li>注入ミックス室温で 10 分間、インキュベートします。</li>
</ol>5. 注入のプロトコル
<ol><li>注入ミックス12の約半分をインジェクション ピペットをロードします。注射針は下駄や中断に備えて注入ミックスの残りを保存します。</li>
	<li>20 ~ 30 p.s.i. は、段階的な流れるソリューション12を生成できるように、マイクロ ピペット チップを破る。 注: より大きい直径のヒント否定的動物の健康に影響を与えるし、F1後代の収量を減少させます。</li>
	<li>注入 10-15 若い成虫は両方生殖腕の中で可能であれば12。ない場合は、片腕生殖腺への注入で十分です。</li>
	<li>OP50 シード 35 線虫成長メディア (NGM) プレートに注入された動物 (P0) 室温で 1-2 時間を回復するを許可します。その後、白金線ワームを使用して個々 の OP50 シード 35 mm NGM プレートに単一の注入 P0動物は12を選ぶ。</li>
</ol>6. 画面 P0板と単一 mCherry(+) F1s
<ol><li>2 日間投与後、蛍光顕微鏡を用いた咽頭で mCherry を表現する F1子孫を含んでいる P0版を識別する (図 1一日 2-3)。ほとんどの mCherry(+) F1動物を含む 3 つの P0プレートを選択します。</li>
	<li>シングル 24 36 mCherry(+) F1のワームを使用しての合計のための 8-12 mCherry(+) F1動物選ぶ、3 つの選択した P0プレートから (図 1一日 2-3)。 注: mCherry(-) 動物はこれらの P0プレートからも指摘することができますが、正しく識別する確率はあまり動物の編集 (図 2 a) を下げます。</li>
	<li>個々 の F1s を self-fertilize し、室温で 1 〜 2 日のための卵を産みます。</li>
</ol>7. シングル ワーム PCR および遺伝子型解析
<ol><li>産卵の 1-2 日後に、ワーム ピック (表 2図 1一日 4-5) を使用してワームの換散バッファーの 7 μ L を含む個別 PCR ストリップ管キャップに F1s を転送します。</li>
	<li>遠心チューブ下部に動物をもたらす、-80 ° C 1 時間で管を固定するために室温で 1 分最大速度で PCR チューブ。 注: ワームが-80 ° C で不明確に保存されます。</li>
	<li>次のプログラムを使用してたちで冷凍ワームを溶解: 95 ° C、15 分、60 分の 60 ° C 4 ° C を保持します。</li>
	<li>セットアップ PCR マスター ミックス表 3に示すように。</li>
	<li>きれいな PCR チューブに PCR マスター ミックスの 21 μ L を追加し、手順 3 からワームの換散の 4 μ L を追加します。ピペットを使用してミックスし、PCR プログラム (材料表参照) 製造業者の指針を次を実行します。</li>
	<li>製造元の指示に従って、DNA 清潔濃縮キットを使用して PCR 反応を浄化 (材料表を参照してください)。スピンの列に 10 μ L の水を追加することによって DNA を溶出します。</li>
	<li>表 4に示すように、セットアップ制限酵素マスターをミックス。</li>
	<li>各洗浄の PCR 反応に制限酵素マスターミックスプロの 10 μ L を追加し、37 ° C13で 1-2 時間インキュベートします。</li>
	<li>個別は、120 V 1 × トリス-酢酸-EDTA (TAE) バッファー14の使用で実行 1.5% の agarose のゲルの PCR の製品を消化しました。</li>
</ol>8. 識別と編集された動物のシーケンスの検証
<ol><li>潜在的な編集動物14 (図 14-5 日) を示すバンドの存在のため消化酵素サンプルを確認します。 注: は、バンドのサイズおよび/またはバンディング パターン予期しない、複雑な制限の酵素の消化力の変化として観察することができます潜在的な塩基変異を識別するために N2 コントロールを読み込みます。</li>
	<li>潜在的な編集した動物を識別した後ワーム換散の残りの 3 μ L を使用し、PCR 反応を繰り返します。きれいにしていないか、プログラムが完了した後、制限酵素は PCR 反応を消化します。別 1% の agarose のゲルの PCR の反作用をロードし、ゲル抽出キット15を使用してバンドを抽出 (材料表を参照してください)。</li>
	<li>サンガー シーケンス16ゲルが F1 のプライマーを使用して正しく編集した動物 (図 1 a) を識別する DNA を抽出 注: 読み取りは、ヘテロ野生型の存在のためのピークをオーバーレイし、対立遺伝子を設計しました。</li>
	<li>取得してホモ動物検証ヘテロ接合体の編集された動物、単一 8 122動物 7-8 の手順に従います。</li>
</ol>

<ol><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202, 885-901 (2016).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096(2014).</li>
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<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).</li>
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<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17, 148(2016).</li>
<li>Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+genome+editing+using+CRISPR-Cas9+and+linear+repair+templates+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans.</a> Methods. , (2017).</li>
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<li>Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+SOD1+loss+of+function+involved+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis?</a> Brain. 136, 2342-2358 (2013).</li>
<li>Acevedo-Arozena, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+assessment+of+the+SOD1G93A+low-copy+transgenic+mouse%2C+which+models+human+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis.</a> Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).</li>
<li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li>
</ol>

頼むこの原稿の批判的研究室のメンバーに感謝いたします。系統は、線虫の遺伝学センター研究インフラストラクチャ プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金が供給されるによって提供されました。頼む研究室での研究は NIH (R01 NS094678) や筋ジストロフィー協会 (MDA382300) からの補助金によってサポートされて A.A.B. に

CRISPR Cas9 システムのモデル生物のゲノムを正確に変更するための強力かつ効果的なツールです。ここでは、そのキメラ sgRNAs20と相まって ssODN HDR 有効テンプレートに線虫の遺伝子の点変異の高効率生成を示します。重要なは、示す共同選択マーカーとして使用する蛍光 RNP 配信が編集効率を生成する使いやすさと手法の信頼性を強調.
線虫ゲノム工学 CRISPR Cas9 メソッドの大半は、特定の遺伝的背景や co CRISPR 戦略1に依存します。Co CRISPR メソッドは、成功したゲノム編集を得ることの可能性を増加させる非常に便利なツールであると証明しました。しかし、co CRISPR メソッドは豊かに関心のゲノム編集用マーカーの軌跡で表現型が選択可能な編集を導入することを必要です。一方、強力な選択可能な表現型ベアリング変異導入望ましくないかもしれない場合編集するひずみまたは自体興味の目的の点突然変異表現型悪化またはマーカーの表現...

最近の技術の進歩が根本的に形質転換し、正確にエンジニアのゲノムに能力を加速します。特に、RNA 誘導エンドヌクレアーゼの興味のターゲット シーケンスに近い二重鎖切断 (DSB) を誘導する Cas9 に頼る、CRISPR Cas9 システムは広くモデル有機体の使用の大半のゲノムを正確にエンジニアに使用されています生物医学研究1,2,3,4。大幅に CRISPR Cas9 の使用は、ゲノムはc. の elegans5のような困難な種でも編集ロックを解除が。種に関係なく編集システム基づく CRISPR Cas9 ゲノムと点突然変異を生成する 3 つのコア コンポーネントに依存しています: 1) Cas9 エンドヌクレアーゼ、ターゲット シーケンスと 3) 設計ユーザーに Cas9 エンドヌクレアーゼを指示する 2) シングル ガイド RNA (sgRNA)2興味の目的の編集を含むホモロジー監督修理 (HDR) テンプレートです。
ターゲットの sgRNA と Cas9 を紹介するために使用できるいくつかの方法があるプラスミッド、RNA ウイルス ベースの配信方法6などのセルにヌクレアーゼ。最近、中古複合 sgRNA Cas9 Ribonucleoproteins (結合) の直接配信は、CRISPR ベース Cas9 ゲノム編集7で強力で効率的なツールとして浮上しています。中古複合 CRISPR Cas9 結合の直接配信はいくつかのメリット、すなわち: 1) 結合細胞のトランスクリプションのための必要性のバイパス、翻訳、2) 結合が急速にクリアされ、特異性を増加するには可能性があります利用可能な時間の短縮オフ ターゲット胸の谷間、そして 3) 結合に非ネイティブのシーケンスをランダムな統合により宿主ゲノムに導入を回避する外国の DNA ・ RNA 要素が含まれていません。一緒に、これらの属性の可能性が高いターゲットに CRISPR 編集オフターゲット効果を最小限に抑えながらの短いバーストを提供します。
線虫 c. エレガンスのサイト固有の genomic 変更を導入するための簡単かつ効率的なプロトコルについて述べる。このプロトコルでは、ターゲットに正しく編集した動物を明確に同定のジェノタイピング戦略と配信、sgRNA Cas9 RNP 錯単一鎖オリゴヌクレオチド (ssODN) HDR テンプレート デザイン sgRNA 含まれています。この戦略を使用すると、目的のサイト固有の変更を回復できる、だけでなく他の非特定塩基の変異を回復も可能性があります。したがって、当社の戦略は、1 つの戦略を使用してモノラル対立、bi 対立、対立シリーズの生成を許可、F1世代で塩基変異を生成できます。

<table><tbody><tr><td>CRISPRevolution sgRNA&nbsp;EZキット</td><td>シンテーゴ株式会社</td><td></td><td>キメラsgRNA</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリーTE</td><td>Synthego Inc.</td><td>sgRNAキット、EZキット</td><td></td>、</tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Synthego Inc.に</td>付属<td>sgRNAキットに付属 EZキット</td><td></td></tr><tr><td>4 nmole Ultramer DNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>ssODN HDRテンプレート</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1078728</td><td>Cas9タンパク質</td></tr><tr><td>pCFJ90&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19327</td><td>Pmyo-2::mCherryマーカープラスミド</td></tr><tr><td>KCl</td><td>シグマ</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>DNAクリーン&コンセントレーター</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean ゲル DNA リカバリー キット</td><td>Zymo Research</td><td>D4002</td><td></td></tr><tr><td>Q5 ホット スタート ハイフィデリティ 2X マスター ミックス</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>シグマ</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>ガラス ホウケイ酸ガラス マイクロピペット</td><td>サッター機器</td><td>BF100-78-10</td><td>OD: 1.0mm。ID: 0.78mm</td></tr><tr><td>Trizma 塩酸塩</td><td>Σ</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Σ</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Σ</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap 除染液</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

迅速かつ安易なパイプラインを生成する突然変異点ゲノムにc. の elegansを用いた crispr/cas9 ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

クラスター化された定期的に散在させていて回文繰り返し (CRISPR) - CRISPR - に関連したタンパク質 9 (Cas9) 原核生物の適応免疫の防衛システムが抱き込まれてしまった正確な真核生物ゲノム工学のための強力なツールとして線虫のゲノムの点変異の効率的で正確な世代キメラ シングル ガイド Rna (sgRNA) と CRISPR Cas9 Ribonucleoproteins (結合) を使用して迅速かつ簡単な方法を紹介します。SgRNA ターゲットの選択、ホモロジー監督修復 (HDR) テンプレート デザイン、CRISPR Cas9 RNP 錯化と配信、および正しく編集した動物の堅牢かつ迅速な同定を可能にする遺伝子型戦略のパイプラインについて述べる。我々 のアプローチは、変異動物安易な世代とゲノムの任意の場所の同定が可能だけでなく、高効率および減らされたスクリーニング作業負荷で約 4-5 日で他の複雑な塩基の対立遺伝子の検出を容易にも。

人間スーパーオキシドジスムターゼ 1 (SOD1) の変異は、家族性筋萎縮性側索硬化症、麻痺と死の17に必ずや壊滅的な神経変性疾患の 10 ~ 20% を占めます。ヒト SOD 1 です (図 1 b) c. の elegans SOD 1 タンパク質と 55% のアイデンティティおよび 70% の類似性を共有進化上保存されたタンパク質です。シンプルさ、可能性、CRISPR Cas9 RNP ベースのアプローチの効率を示すためには、ワームのゲノム (図 1 a) 疾患関連の人間 G93A バリアントを紹介する線虫 sod 1遺伝子を対象とします。
線虫ゲノム G93A 変異をエンジニアに、sgRNA が選ばれたが P...

ここでは、CRISPR Cas9 ribonucleoproteins と相同性依存修理テンプレートを使用して線虫のゲノム エンジニア リング方法を提示します。

迅速かつ安易なパイプラインを生成する突然変異点ゲノムにc. の elegansを用いた CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

この手順の全体的な目標は、一本鎖オリゴヌクレオチド相同性指向修復テンプレートとCRISPR/Cas9リボ核タンパク質を使用して、C.エレガンスにゲノム点変異を作製することです。この方法は、神経変性疾患に関連する遺伝的分散の病理学的影響を決定するなど、神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ゲノム点変異を迅速に生成できるため、タンパク質の過剰発現の注意点を回避しながら、内因性制御の文脈で遺伝的分散の機能研究が可能になることです。sgRNAターゲットの選択を行うには、ここに示されているWebページを開いてください。目的の編集に隣接する配列の約60塩基対を入力します。C.Elegansゲノムとプロトスペーサー隣接モチーフをテキストプロトコルに従って選択した後、submitをクリックします。結果ページで、関心のある編集に最も近い上位にランク付けされたターゲットシーケンスを選択します。受領後、凍結乾燥されたsgRNA含有チューブを室温および少なくとも12, 000gで1分間遠心分離する。60マイクロリットルのヌクレアーゼフリーTEをチューブに加え、p200ピペットを使用して、ピペッティングを15〜20回上下して穏やかに再懸濁します。最終濃度は50マイクロモルです。目的の変異、ユニークなインフレーム制限エンドヌクレアーゼ部位、NGG PAM配列内のGの一方または両方のサイレント変異、および最初と最後の変異に隣接する50塩基対の5つのプライムホモロジーアームと3つのプライムホモロジーアームを含むssODN HDRテンプレートを設計します。受領後、今示したように凍結乾燥されたssODN含有チューブを遠心分離し、ヌクレアーゼフリーのDD H20を使用して、ssODNを最終濃度100マイクロモルまで穏やかに再懸濁します。注射用ミックスを調製するには、ここに示す試薬を最高速度で摂氏4度で2分間遠心分離します。記載されている順序で、試薬をヌクレアーゼフリーPCRチューブに加えます。次に、p20ピペットを使用して、内容物を穏やかに完全に混合します。チューブを室温で10分間インキュベートします。テキストプロトコルに従ってP0動物を注入した後、OP50シードした35mmNGMプレート上で室温で1〜2時間回復させます。その後、プラチナワイヤーワームピックを使用して、単回注入したP0動物を個々のOP50播種35mmNGMプレートに移します。注射の2日後、蛍光顕微鏡を使用して、咽頭にmCherryを発現するF1子孫を含むP0プレートを同定します。mCherry陽性のF1動物を最も多く含む3つのP0プレートを選択してください。選択した3つのP0プレートのそれぞれから、ワームピックを使用して、8〜12 mCherry陽性のF1動物を1匹ずつ、合計24〜36 mCherry陽性のF1を1匹にします。個々のF1が室温で1〜2日間自家受精し、卵を産むのを待ちます。産卵から1〜2日後、ワームピックを使用して、F1を7マイクロリットルのワーム溶解バッファーを含む個々のPCRストリップチューブキャップに移します。PCRチューブを最大速度および室温で1分間遠心分離し、動物をチューブの底に持っていきます。次に、チューブを摂氏マイナス80度で1時間凍結します。次に、次のプログラムを使用して、凍結したワームをサーモサイクラーで溶解します。次に、この表に示すようにPCRマスターミックスをセットアップします。21マイクロリットルのPCRマスターミックスをきれいなPCRチューブに加え、次に4マイクロリットルのワーム溶解チューブを加え、ピペッティングでよく混合します。その後、メーカーのガイドラインに従ってPCRプログラムを実行します。DNA Clean and Concentrate Kitを使用して、製造元の指示に従ってPCR反応を精製します。次に、スピンカラムに10マイクロリットルの水を加えてDNAを希釈します。制限酵素マスターミックスを設定した後、洗浄した各PCR反応液に10マイクロリットルを加え、チューブを摂氏37度で1〜2時間インキュベートします。次に、消化したPCR産物を1.5%アガロースゲル上で120ボルトの1x TAEバッファーを用いて分離します。酵素消化されたサンプルに、編集された可能性のある動物を示すバンドが存在するかどうかを調べます。編集された可能性のある動物を特定した後、残りの3マイクロリットルの線虫溶解を使用し、PCRを繰り返します。次に、完了した反応をすぐに1%アガロースゲルにロードしてから、ゲル抽出キットを使用してバンドを分離および抽出します。F1プライマーを使用して、正しく編集された動物を同定するためのサンガーシーケンシングを行います。最後に、検証済みのヘテロ接合体編集動物からホモ接合動物を得るために、8〜12匹のF2動物を1匹ずつ行い、テキストプロトコルに従ってジェノタイピングと配列検証を行います。CRISPR/Cas9 RNPベースのアプローチの簡便性、実現可能性、および効率性を実証するために、C.Elegans sod-1遺伝子を標的にして、疾患に関連するヒトG93a変異体を線虫ゲノムに導入しました。このゲル画像は、24匹のmCherry陽性F1動物のジェノタイピング結果を示しています。10匹はモノアリル酸またはビアリル酸修飾を含んでおり、10匹は野生型、3匹は潜在的なインデル、1匹はPCRの失敗でした。蛍光mCherryマーカーがゲノム改変のために濃縮することを実証するために、3つのP0プレートのそれぞれから8匹のmCherry陰性動物を選びました。正しく改変されたのは1匹だけで、23匹は野生型でした。この図は、全長ゲル抽出 PCR 産物のクロマトグラムを示しており、ssODN HDR テンプレートで設計された正確なヌクレオチド変化が、このホモ接合体の F1 動物のゲノムに忠実に組み込まれていることを示しています。この手法を習得すると、適切に実行されれば、4〜5日でC.Elegansのゲノム点変異を生成および同定するために利用することができます。この手順を試みる際には、RNaseフリー水、フィルターピペットチップ、手袋などの核フリー試薬と技術を使用することを忘れないでください。この手順に続いて、目的の突然変異に関連する可能性のある表現型を調査するために、細胞、分子、および行動アッセイを実施できます。このビデオを見れば、キメラシングルガイドRNaseとCRISPR/Cas9リボ核タンパク質を使用して、C.Elegansのゲノム点突然変異を正確に生成する方法を十分に理解できるはずです。

a-rapid-facile-pipeline-for-generating-genomic-point-mutants-c

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

このビデオでは、PCRスクリーニングにより、単一の線虫の遺伝子マーカーを迅速にスクリーニングする手法について説明しています。このプロトコル例では、CRISPRベースのゲノム編集をスクリーニングします。...

シングルワームPCR:ゲノムDNAを抽出し増幅する方法

このビデオでは、トランスジェニック線虫株を作成する一般的な方法であるマイクロインジェクションについて説明しています。この例では、CRISPRベースの遺伝子編集のためのリボ核タンパク質(RNP)複合体を導入するためのマイクロインジェクションを使用しています。...

生殖腺マイクロインジェクション:C.エレガンスの生殖細胞系に直接化合物送達する方法

CRISPR/Cas9は、遺伝子と遺伝的要素の破壊を生み出す堅牢なシステムです。ここでは、CRISPR/Cas9を使用して哺乳類細胞株のゲノム欠失を効率的に作成するためのプロトコルについて説明します。...

CRISPR / Cas9経由哺乳動物細胞株におけるゲノム欠失の生成

ここで説明したジェノタイピング技術、キャピラリーゲル電気泳動に結合する蛍光ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、ヌクレアーゼ媒介ノックアウトクローンのハイスループット遺伝子型決定を可能にします。これは、他の遺伝子型判定技術が直面している制限を回避し、配列決定法よりも費用対効果の高いです。...

ハイスループットフォーマットでの遺伝子型CRISPR / Cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました

対象となるゲノム編集モデルにおける動脈分布(ゼブラフィッシュ) は、CRISPR ベースのアプローチの出現によって大きく促進されています。ここで、生成・ ヘテロ二本鎖移動性試金が組み込まれたナンセンスの CRISPR 由来の対立遺伝子の同定と次世代シーケンシングによる突然変異の同定の合理化された、堅牢なプロトコルについて述べる.

効率的な生産とモデル システムの動脈分布に CRISPR 識別/Cas9 生成遺伝子のノックアウト

組立 Cas9 を利用した複雑なリボ核タンパク質 (RNP)...

強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたヘテロ接合性またはホモ接合ヌクレオチド変化の生成を容易にする方法を提供する。...

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

このプロトコルの目的は、組み立てられたリボヌクレオタンパク質複合体とスクリーニングのためのdpy-10コクリスピーマーカーを使用して、C.エレガンスゲノムのシームレスなCRISPR /...

CRISPR/Cas9 dpy-10 Co-CRISPRスクリーニングマーカーと組み立てられたリボヌクレオプロテイン複合体を用いたC.エレガンスrbm-3.2遺伝子の編集。

接合子のCRISPRエレクトロポレーションによるマウスの効率的なゲノム編集

本稿では、昆虫病原性線虫(EPN:昆虫寄生)線虫であり、新たな遺伝モデルである Steinernema hermaphroditum におけるCRISPR-Cas9媒介ゲノム工学を実証しています。この技術は変異体の作成に有用であり、相利共生および寄生共生に関連する線虫生物学の遺伝子機能の解明を可能にします。...

CRISPR-Cas9ベースの線虫 Steinernema hermaphroditum における変異誘発と変異系統の維持

Caenorhabditis elegansの生殖細胞における内因性蛍光タグ付けのためのCRISPR/Cas9マイクロイン注射ワークフローで、in...

CRISPR/Cas9を媒介したカエノラブディティス・エレガンスにおける生殖細胞特異遺伝子の内因性蛍光タグ付け

学ぶCRISPR/Cas9リボ核タンパク質を用いたC. elegansゲノム点突然変異導入法。迅速なプロトコルにより神経変性疾患関連の遺伝的変異の機能解析が可能となり、内因性調節環境下での遺伝子機能研究に有用です。

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