迅速かつ安易なパイプラインを生成する突然変異点ゲノムにc. の elegansを用いた CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

この手順の全体的な目標は、一本鎖オリゴヌクレオチド相同性指向修復テンプレートとCRISPR/Cas9リボ核タンパク質を使用して、C.エレガンスにゲノム点変異を作製することです。この方法は、神経変性疾患に関連する遺伝的分散の病理学的影響を決定するなど、神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ゲノム点変異を迅速に生成できるため、タンパク質の過剰発現の注意点を回避しながら、内因性制御の文脈で遺伝的分散の機能研究が可能になることです。

sgRNAターゲットの選択を行うには、ここに示されているWebページを開いてください。目的の編集に隣接する配列の約60塩基対を入力します。C.Elegansゲノムとプロトスペーサー隣接モチーフをテキストプロトコルに従って選択した後、submitをクリックします。

結果ページで、関心のある編集に最も近い上位にランク付けされたターゲットシーケンスを選択します。受領後、凍結乾燥されたsgRNA含有チューブを室温および少なくとも12, 000gで1分間遠心分離する。60マイクロリットルのヌクレアーゼフリーTEをチューブに加え、p200ピペットを使用して、ピペッティングを15〜20回上下して穏やかに再懸濁します。

最終濃度は50マイクロモルです。目的の変異、ユニークなインフレーム制限エンドヌクレアーゼ部位、NGG PAM配列内のGの一方または両方のサイレント変異、および最初と最後の変異に隣接する50塩基対の5つのプライムホモロジーアームと3つのプライムホモロジーアームを含むssODN HDRテンプレートを設計します。受領後、今示したように凍結乾燥されたssODN含有チューブを遠心分離し、ヌクレアーゼフリーのDD H20を使用して、ssODNを最終濃度100マイクロモルまで穏やかに再懸濁します。

注射用ミックスを調製するには、ここに示す試薬を最高速度で摂氏4度で2分間遠心分離します。記載されている順序で、試薬をヌクレアーゼフリーPCRチューブに加えます。次に、p20ピペットを使用して、内容物を穏やかに完全に混合します。

チューブを室温で10分間インキュベートします。テキストプロトコルに従ってP0動物を注入した後、OP50シードした35mmNGMプレート上で室温で1〜2時間回復させます。その後、プラチナワイヤーワームピックを使用して、単回注入したP0動物を個々のOP50播種35mmNGMプレートに移します。

注射の2日後、蛍光顕微鏡を使用して、咽頭にmCherryを発現するF1子孫を含むP0プレートを同定します。mCherry陽性のF1動物を最も多く含む3つのP0プレートを選択してください。選択した3つのP0プレートのそれぞれから、ワームピックを使用して、8〜12 mCherry陽性のF1動物を1匹ずつ、合計24〜36 mCherry陽性のF1を1

個々のF1が室温で1〜2日間自家受精し、卵を産むのを待ちます。産卵から1〜2日後、ワームピックを使用して、F1を7マイクロリットルのワーム溶解バッファーを含む個々のPCRストリップチューブキャップに移します。PCRチューブを最大速度および室温で1分間遠心分離し、動物をチューブの底に持っていきます。

次に、チューブを摂氏マイナス80度で1時間凍結します。次に、次のプログラムを使用して、凍結したワームをサーモサイクラーで溶解します。次に、この表に示すようにPCRマスターミックスをセットアップします。

21マイクロリットルのPCRマスターミックスをきれいなPCRチューブに加え、次に4マイクロリットルのワーム溶解チューブを加え、ピペッティングでよく混合します。その後、メーカーのガイドラインに従ってPCRプログラムを実行します。DNA Clean and Concentrate Kitを使用して、製造元の指示に従ってPCR反応を精製します。

次に、スピンカラムに10マイクロリットルの水を加えてDNAを希釈します。制限酵素マスターミックスを設定した後、洗浄した各PCR反応液に10マイクロリットルを加え、チューブを摂氏37度で1〜2時間インキュベートします。次に、消化したPCR産物を1.5%アガロースゲル上で120ボルトの1x TAEバッファーを用いて分離します。

酵素消化されたサンプルに、編集された可能性のある動物を示すバンドが存在するかどうかを調べます。編集された可能性のある動物を特定した後、残りの3マイクロリットルの線虫溶解を使用し、PCRを繰り返します。次に、完了した反応をすぐに1%アガロースゲルにロードしてから、ゲル抽出キットを使用してバンドを分離および抽出します。

F1プライマーを使用して、正しく編集された動物を同定するためのサンガーシーケンシングを行います。最後に、検証済みのヘテロ接合体編集動物からホモ接合動物を得るために、8〜12匹のF2動物を1匹ずつ行い、テキストプロトコルに従ってジェノタイピングと配列検証を行います。CRISPR/Cas9 RNPベースのアプローチの簡便性、実現可能性、および効率性を実証するために、C.Elegans sod-1遺伝子を標的にして、疾患に関連するヒトG93a変異体を線虫ゲノムに導入しました。

このゲル画像は、24匹のmCherry陽性F1動物のジェノタイピング結果を示しています。10匹はモノアリル酸またはビアリル酸修飾を含んでおり、10匹は野生型、3匹は潜在的なインデル、1匹はPCRの失敗でした。蛍光mCherryマーカーがゲノム改変のために濃縮することを実証するために、3つのP0プレートのそれぞれから8匹のmCherry陰性動物を選びました。

正しく改変されたのは1匹だけで、23匹は野生型でした。この図は、全長ゲル抽出 PCR 産物のクロマトグラムを示しており、ssODN HDR テンプレートで設計された正確なヌクレオチド変化が、このホモ接合体の F1 動物のゲノムに忠実に組み込まれていることを示しています。この手法を習得すると、適切に実行されれば、4〜5日でC.Elegansのゲノム点変異を生成および同定するために利用することができます。

この手順を試みる際には、RNaseフリー水、フィルターピペットチップ、手袋などの核フリー試薬と技術を使用することを忘れないでください。この手順に続いて、目的の突然変異に関連する可能性のある表現型を調査するために、細胞、分子、および行動アッセイを実施できます。このビデオを見れば、キメラシングルガイドRNaseとCRISPR/Cas9リボ核タンパク質を使用して、C.Elegansのゲノム点突然変異を正確に生成する方法を十分に理解できるはずです。