Name: マウス顎下腺への Retroductal ナノ粒子注入 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 学ぶマウス顎下腺へのレトロダクタルナノ粒子注入法。ポリマーナノ粒子を用いた局所薬物送達により、全身循環を迂回しつつ唾液腺機能障害治療の研究を進めます。

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この出版物で報告された研究は、国立歯科研究所と顔面研究 (NIDCR) ・賞数 R56 DE025098、UG3 DE027695、F30 CA206296 の下で健康の国民の協会の国立癌研究所 (NCI) によって支えられました。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。この作品も、NSF DMR 1206219 と口腔ケア賞 (2016), 技術革新によって支えられました。
IVIS 実験を行うことで彼女の援助のジェーン ・ Gavrity に感謝したいと思います。我々 は彼女の入力と EM を実行する支援のためカレン ベントレーを感謝したいです。IHC と彼の援助の Pei Lun 翁に感謝したいと思います。我々 は図の準備の彼の援助のマシュー ・ インガルスを感謝したいです。この原稿の批判的読解の博士 Elaine Smolock とエミリー呉に感謝したいと思います。

すべては、生体内での下記手続は、ロチェスターの大学、ロチェスター、ニューヨーク動物資源の大学委員会によって承認されました。
1. 準備
<ol><li>ワイヤー インセット 32 G 頭蓋内カテーテル チューブを使用して、斜めの端、長い軸に約 45 ° を形成するチューブの 3 cm をカットします。ワイヤーは少なくとも 1 cm チューブよりも長いことを確認します。</li>
	<li>ハミルトンの注射器に 50 μ L PSMA ナノ粒子溶液 (図 1) のまたは他の注入材料を読み込みます。Barotrauma の確率を減らすため射出時に、カテーテル チューブを付削除、注射器にスタイレットとデッド ボリュームを追放します。</li>
	<li>ナノ粒子が完全に投与閉塞を防ぐために溶媒和ように注射液を検査します。</li>
	<li>アトロピン 0.1 mg/mL のソリューションを準備します。 注: アトロピン光に敏感、時間の経過とともに低下するため、このソリューション必要があります予防接種、させられる投与までの光から保護します。</li>
</ol>2. アクセスして管のエントリ ポイントを可視化
<ol><li>分析用天秤を用いた C57/BL6 マウスの重量を量る。</li>
	<li>29 x ½"針で 0.5 mL シリンジを使用して、100 mg/kg 10 mg/kg とケタミン ・ キシラジンの腹腔内注入滅菌生理食塩液をマウスを麻酔します。マウスはもはや刺激に反応、一般的に、投与 5 〜 10 分以内に発生するときは、次の手順に進みます。 注: この手順はイソフルランの下で行なうことも可能ですが、口腔内へのアクセスを許可するカスタム ノーズコーンが必要になります。</li>
	<li>プロシージャの間に乾燥を防ぐため、目に潤滑剤を適用し、カスタム ステージ上腹臥位でマウスを配置します。 注: 口腔内のプロシージャの適切な条件を維持するためにツールする必要がありますされる消毒または滅菌を使う前に。</li>
	<li>金属線に上顎前歯を保護することによって口腔内を開き、弾性バンドを使用して (図 2 a) の下顎前歯部の後ろ下方の緊張を適用します。</li>
	<li>顎の基部が視覚化されるように解剖顕微鏡の下にマウスを合わせます。</li>
	<li>口を広げるには、両側頬粘膜に張力を適用するのにカスタム、湾曲した鋼リトラクターを使用します。</li>
	<li>顎下腺の乳頭を視覚化するには、把握し、鈍い鉗子を使用して口の床から舌をそっと持ち上げます。 注: 乳頭舌 (図 2 b) の下にある 2 つの薄い突起として表示されます。</li>
	<li>口腔内で可視化しをさらに操作を容易にするためには、舌と頬の粘膜の間の綿を配置します。</li>
</ol>3. 管挿管および線の配置
<ol><li>カーブタイプ鉗子、罰金を使用して、ワイヤーの挿入カテーテル チューブを把握します。穿刺時に最適な手動制御、鉗子 (図 3 a) の曲率を持つチューブを合わせます。</li>
	<li>解剖顕微鏡を使用して、ビューのフィールドに鉗子とワイヤーを移動します。 注: ワイヤーはチューブから突出する必要があります。</li>
	<li>小さく、表面、粘膜パンク (0.076 mm 径) カテーテル チューブ (直径 0.25 mm) の後のエントリを容易にするを生成する嵌め込む式ワイヤーを使用して 1 つの顎下腺乳頭のベースに軽く押さえます。抵抗が発生した場合は、鋭い解剖はさみでチューブとワイヤ埋め込みの両方で新鮮な斜めのヒントをカットします。</li>
	<li>次のエントリ、スタイレットを撤回し、解剖顕微鏡を使用して、穿刺部位にある唾液の存在を確認します。スタイレットの出血を引き起こす可能性がありますまたは管の整合性が損なわれることの説得力がある、または突然の動き (撤退または挿入) を避けてください。</li>
	<li>チューブ (図 3 b) にスタイレットを撤回します。</li>
	<li>チュービングは、ウォートンのダクトの開口部に適合するには、以前作った穿刺 (図 2 C) に剛体ガイドとして、スタイレットを含むチューブを挿入します。 注: すぐに実行されない場合、ローカルの腫れが再挿入をできない場合があります。</li>
	<li>長期にわたる閉塞からの背圧を防ぐためには、チューブを撤回します。顎下腺の乳頭の開口部、顕微鏡では、表示を見ることができることを確認するを確認します。目に見える出血が発生した場合、スタイレットを削除し、ステップ 3.2 反対の顎下腺乳頭からやり直します。</li>
	<li>マウスを動かさずに 1 mg/kg のアトロピン ソリューション、プロシージャの間に唾液の分泌を減らすための腹腔内注入を管理します。5-10 分を待ちます。</li>
	<li>注射器のチューブの端をつかみ、オリフィスの内径 (図 3) を使用して挿入します。抵抗が発生した場合は、チューブと再試行に新鮮な角度付き端部をカットします。</li>
	<li>管は顎下腺乳頭内の箇所で、一度ゆっくりとダクトに 3-5 mm を進めます。鉗子からチューブを離します。</li>
	<li>チューブと顎下腺の乳頭間のシールを高めるためには、軽く 1 分のガーゼでしみが付くことによってインターフェイスを乾燥します。</li>
	<li>チューブの位置が乾燥中にシフトしているいないことを確認するを確認します。</li>
</ol>4. 注入
<ol><li>10 μ L/分マウス鎮静のまま苦痛 (図 2 D) の兆候が表示されないことを確認する検査の速度で材料を注入します。 注: 15 50 μ L の注射が忍容性良好。大量の注入は、barotrauma で起因できます。</li>
	<li>次の注射、ウォートンのダクトと SMG (図 4) 内にある材料の保持を改善するために 5 分のための注射器圧力を維持します。その管が管のオリフィスを終了しないように定期的に顎下腺の乳頭を検査します。</li>
	<li>微細鉗子を使用して、つかみ、軽く顎下腺の乳頭からチューブを撤回します。 メモ: 乳頭からいくつかの流体の出口を観察するは正常です。</li>
	<li>リトラクターと綿を口腔内からステージからマウスを移動する前に削除します。 注: 動物残さないように無人までそれは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しました。さらに、完全に回復するまで他のマウスとマウスが収納されていませんことを確認します。</li>
</ol>5. 検証・解析
注: (として示されている 1 h、図 5に注射後 24 h) 注入蛍光ナノ粒子の保持を評価するため生体内イメージング システム (IVIS) を使用できます。
<ol><li>皮膚を通して SMG 内蛍光信号を見やすく、剃毛か化学脱毛を使用して SMGs を覆う腹の毛皮を削除します。 注: 次の安楽死、SMG 組織も収穫することができます、修正 (4% パラホルムアルデヒド) で一晩、および注入 (図 6) 1 日の蛍光に分類された NP の永続性を確認するため免疫組織化学を用いたステンド グラスします。</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

Retroductal 注入は、唾液腺にローカライズされた薬物送達のため重要です。このテクニックには、シェーグレン症候群と・ リフの9,10,28を含む条件のための治療薬のスクリーニングでアプリケーションがあります。Retroductal 注入を介して SMG に直接薬剤投与は、免疫活性化11を含むオフターゲット効果を減らすためにその潜在的な全身管理上重要な利点を提供します。周囲の組織に蓄積することがなく、薬剤の局所投与を最大化する能力も全身達成できるより広い線量範囲で治療のテストを有効にできます。
我々 はこのプロトコルを提示、トラブルシューティングと品質マウス SMG20にウォートンのダクトを通じて高分子ナノ材料を提供する詳細および更新方法としての手順を確認します。たとえば、ワイヤー ガイドの適切な...

唾液腺機能不全、シェーグレン症候群、機能的な分泌組織と照射誘起唾液その他)、頭頸部癌放射線治療1の一般的な sequella の自己免疫を介した損失を含む多くの病因。いずれかの条件のための唾液の機能の損失口腔と全身感染、虫歯、消化、嚥下機能障害、音声障害、大鬱病1,2,3個人の素因となります。その結果、生活の質が大幅低下、介入治療4ではなく、症状の緩和に限定とします。生体内での新規治療法を調査、生物活性化合物の唾液腺に直接管理に興味のです。
Retroductal 注入は、唾液腺に直接生理活性化合物を提供し、病気、傷害、または正常組織の恒常性の下での有効性をテストする貴重な方法です。3 つの大唾液腺は耳下腺 (PG)、顎下腺 (SMG)、舌下腺 (SLG) 導管を通じて口腔内には、空のすべて。痙攣の解剖学 SMG 舌5の下に口の階にウォートンのダクトのカニュレーションを介して直接アクセスを許可します。次の穿刺、溶媒和の薬は、SMG に直接管理できます。次の retroductal 配信外腺の拡散は周囲の構造6の材料の交換を調整する周囲組織のカプセルによって制限されます。SMG とそのダクト同様に、人間の構造は、SMG 手術と sialoendoscopy7の中に日常的にアクセスされます。人間、マウス、PG は頬粘膜8Stensen のダクトを介してアクセス可能な同様に。
・ リフのマウスモデルで SMG retroductal 注入は、成長因子、一次電池、アデノ、サイトカイン、および損傷への細胞応答を調整すると、結果を減らす抗酸化化合物を含む治療を提供に使用されています組織損傷5,9,10、11,12,13,14,15,16。Retroductal 注射の最も注目すべき臨床成功は直接水チャネル (アクアポリン 1 の発現するアデノウイルスベクターの管理AQP1) 患者の頭頸部の癌のための17の放射線に続きます。
以前は、我々 を開発し、・ リフ11,18,19,20から唾液腺の機能を保護するために retroductally を注入した高分子ナノ粒子 siRNA システムの有効性を示します。私たちの過去の作品の拡張として、示す retroductal SMG 注射、蛍光ナノ粒子を用いた (NP) の読み込みと難溶性の提供以外のことができる当社のプロトコル薬21,22,23。
ポリ (スチレン alt マレイン酸 anhydride)-b-poly(styrene) (PSMA) 可逆加算鎖断片化 (いかだ) 重合、21を前述のようから成るジブロック共重合体から NP を合成しました。溶媒交換を通じてこれらのポリマー自発的に自己組み立てる疎水性インテリアと親水性外装21NP ミセル構造に。NPs は、動物を犠牲にせず腺に NP 配信の検証を許可するテキサス赤蛍光体が付いています。動物の画像をライブ、1 h で次の注入 1 日 SMG 免疫組織化学を示します。
これが更新され、再現可能なカニュレーション プロトコル必要があります retroductal 注入を達成するために他人を有効にします。この洗練されたテクニックが重要な生体内での研究、治療開発24,25になることを見込んでいます。

<table><tbody><tr><td>ピロカルピン塩酸塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6503</td><td>ピロカルピン</td></tr><tr><td>学生 Vannas 春のはさみ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>91500-9</td><td>気管切開用春はさみ</td></tr><tr><td>滅菌生理食塩水</td><td>メドライン</td><td>RDI30296H</td><td>生理食塩水</td></tr><tr><td>デュモン #7 鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11274-20</td><td>湾曲した鉗子</td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-10</td><td>ストレート鉗子</td></tr><tr><td>標準パターン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11000-12</td><td>鈍い鉗子</td></tr><tr><td>ファインハサミ-タングステンカーバイド</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14568-09</td>解<td>剖はさみ</td></tr><tr><td>マイクロヘマトクリットヘパリン化毛細管</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>22362566</td><td>毛細管潤滑剤</td></tr><tr><td>眼軟膏</td><td>リフレッシュ</td><td>N/A</td><td>リフレッシュ ラクリルーブ</td></tr><tr><td>ヤギ ポリクローナル抗 Nkcc1</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-21545</td><td>Nkcc1 抗体</td></tr><tr><td>DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>GraphPad プリズム</td><td>グラフパッド</td><td>ver6.0</td><td>統計ソフトウェア</td></tr><tr><td>コットンチップアプリケーター</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td>眼軟膏用アプリケーター</td></tr><tr><td>0.5cc インスリン注射器、29G x 1/2インチ</td> <td>BD</td><td>7629</td><td>腹腔内注射用シリンジ</td></tr></tbody></table>

マウス顎下腺への retroductal ナノ粒子注入

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

唾液腺治療の 2 つの共通の目標は、予防と次のいずれかの組織の機能不全の治療自己免疫または放射線障害。ローカル唾液腺に生物活性化合物を提供すること、によって、全身投与と組織濃度を安全に実現できます。さらに、標的組織を材料の外腺に蓄積することによる効果は大幅に削減することができます。この点で、retroductal 注入、唾液腺の生物学・病態生理学を調査するため広く使用されている方法です。成長因子、一次電池、アデノ ウイルスのベクトル、小分子薬の Retroductal 管理は、傷害の設定で腺機能をサポートする示されています。私たちは以前照射腺の機能を維持するために注入した retroductally ナノ粒子 siRNA 戦略の有効性を示しています。ウォートンのダクトをマウスの顎下腺にナノ材料を管理するための非常に効果的かつ再現性のある方法の詳細ここでは、(図 1)。口腔内にアクセスしてプロシージャ全体で品質チェックとしてより詳細な観察と cannulate のウォートンのダクトに必要な手順の概要を説明します。

Retroductal 注射は、マウス SMG (図 1) に、NPs を管理に使用できます。ここでは、50 μ g PSMA NPs テキサス赤蛍光ラベルの付いたお届け。
マウスの適切な配置により、安易なアクセスなど (図 2 aB) 口の中の床の可視化。顎下腺の乳頭は舌の下に 2 つの肉質の突起として識別されます。次の穿刺 (図 2)、アトロピン注射注射器管は顎下腺乳頭 (2 D 図) に配置できます。
顎下腺の乳頭の小さな穿刺は、カニュレーションを容易にする...

顎下腺への薬剤の局所投与は、唾液腺の生物学を理解に、新規治療法の開発に興味のです。配信精度と実験の再現性を向上させるため、更新と詳細な retroductal 注入プロトコルを提案します。ここに提示されたアプリケーションは、高分子ナノ粒子の配信です。

マウス顎下腺への Retroductal ナノ粒子注入

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

この手順の全体的な目標は、ナノマテリアルをマウスの顎下腺に直接投与することです。この技術の主な利点は、体循環をバイパスしながら、顎下腺への化合物の直接送達を達成することです。この技術の意味は、頭頸部悪性腫瘍に対する放射線治療後の唾液腺機能障害の治療にまで及びます。一般に、この方法に不慣れな個体は、動物が鎮静されている間に顎下管を見つけてカニューレを通すことによって挑戦される可能性があります。この手順を開始するには、ワイヤーがはめ込まれた32ゲージの頭蓋内カテーテルチューブを3センチメートル切断して、長軸に対して約45度の斜めの端を形成します。ワイヤーがチューブより少なくとも1センチメートル長いことを確認します。チューブに斜めのエッジを作成すると、管カニューレ挿入が容易になります。処置中にチューブが曲がった場合は、新しい斜めのエッジをカットする必要があります。次に、50マイクロリットルのPSMAナノ粒子溶液または他の注入材料をハミルトンシリンジにロードします。注射中に巣穴が外傷する可能性を減らすには、カテーテルチューブをシリンジに取り付け、デッドボリュームを排出します。注入液を検査して、ナノ粒子が完全に溶解し、管閉塞を防止することを確認します。次に、1ミリリットルあたり0.1ミリグラムのアトロピン溶液を調製します。乳管の入口を視覚化するには、麻酔をかけたマウスをカスタムステージの腹臥位に置きます。その後、処置中の乾燥を防ぐために目に軟膏を塗ります。その後、上顎切歯を金属ビームで固定し、ゴムバンドを使用して下顎切歯の後ろに下向きの張力を加えます。マウスを解剖顕微鏡の下に合わせ、顎の基部を視覚化します。口を広げるには、カスタムの湾曲したスチール製リトラクターを使用して、頬粘膜に両側に張力を加えます。顎下乳頭を視覚化するには、鈍い鉗子を使用して舌をつかみ、口の底からそっと持ち上げます。舌と頬粘膜の間に綿を置き、口腔内でのさらなる操作を可能にします。管カニューレ挿入とライン配置を行うには、ワイヤーインセットでカテーテルチューブをつかみます。カニューレ挿入中の最適な手動制御のために、チューブを鉗子の湾曲に合わせます。解剖顕微鏡を使用して、鉗子とワイヤーを視野内に移動します。ワイヤーインセットを使用して、1つの顎下乳頭の基部に静かに圧力を加え、カテーテルチューブの後の挿入を容易にする小さな表在性粘膜穿刺を生成します。抵抗が発生した場合は、鋭利な解剖ハサミでチューブとワイヤーのはめ込みの両方で新しい斜めの先端を切り取ります。エントリー後、スタイレットを引き出し、解剖顕微鏡を使用して、穿刺部位に唾液が存在することを確認します。その後、スタイレットをチューブ内にさらに引っ込めます。出血を引き起こしたり、管の完全性を損なったりする可能性のあるスタイレットの強制的または突然の動きを

retroductal-nanoparticle-injection-to-the-murine-submandibular-gland

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

ワルトン管を介してマウス顎下唾液腺のカニュレーションのためのプロトコルが記述されています。この実験では、トリパンブルー溶液は、この手法が効果的に標的腺に注入を提供する方法を示すこと、および唾液腺の再生のための潜在的な臨床薬/細胞療法としてのこの新しいアプローチの信頼性を示唆するダイアーとして使用されます。...

ワルトン管を経由してマウス顎下唾液腺のカニュレーション

このビデオでは、マウスの乳腺の管に注射ミックスを送達する管内注射技術について説明しています。...

管内注射:マウス乳腺の管に注射ミックスを送達する

このビデオは、人間の患者の唾液腺に治療薬を投与するための超音波ガイド下注射技術を示しています。...

ヒト唾液腺への治療薬の超音波ガイド下注射

生体顕微鏡は、生きた動物の様々な生物学的プロセスを画像化可能にする強力なツールです。この記事では、生きたマウスの唾液腺では、このような分泌顆粒として細胞内構造のダイナミクスを画像化するための具体的な方法を提示する。...

蛍光タンパク質を発現する生きたマウスでのイメージング細胞内の構造物の生体顕微鏡

マウス乳腺水性試薬の非侵襲管内送達のためのプロトコルが記載されている。この方法は、特に乳管を対象とした乳腺の乳首にローカライズ注入を利用しています。この技術は、siRNA、化学療法剤および小分子を含む化合物の様々な適合可能である。...

マウス乳腺に局在薬物送達のための管内注入

リンパ節は免疫応答を調整する免疫組織であり、ワクチンの重要な標的です。バイオマテリアルは、より良いリンパ節を標的とし、抗原またはアジュバントの送達を制御するために採用されてきた。本論文では、これらのアイデアを組み合わせて、生体適合性ポリマー粒子をリンパ節に注入する技術について述べる。...

生分解性高分子粒子のリンパ節内注入

唾液腺の機能低下は、頭頸部放射線治療の大きな副作用であり、患者の生活の質を低下させます。動物モデルにおける新しい治療法の有効性の実証は、臨床移行前の前提条件です。このプロトコルは、ラット顎下腺のレトロダクト投与と局所照射について説明しています。...

唾液機能低下のラットモデルにおけるRetroductal顎下腺点滴とローカライズされた分割照射

手術を公開し、直立した生体顕微鏡を用いた生体イメージングのマウス顎下腺唾液腺を安定させるためのプロトコルについて述べる。このプロトコルは、頭部および頸部マウスの他の小さい齧歯動物の他の外分泌腺に容易に適応です。...

マウス顎下腺唾液腺の直立した生体顕微鏡検査のための準備

唾液腺は、遺伝子治療の組織標的部位として、特に遺伝子導入によるワクチン接種の領域において提案されている。逆行性の耳下腺注入を利用した非ヒト霊長類モデルにおける遺伝子導入を実証する。...

ベクター化遺伝子導入のための非ヒト霊長類におけるステンセンダクトによる逆行性耳下腺注入

本プロトコールでは、顎下腺(SMG)の内皮バリア機能を、2光子レーザー走査顕微鏡下で in vivo...

インビボ マウス顎下腺における血管透過性検出

免疫蛍光イメージングは、複雑で時間依存の生物学的プロセスを1つのスナップショットで観察する能力に制約があります。この研究は、精密にカットされたマウスの顎下腺スライスで実施されたライブイメージングアプローチの概要を説明します。このアプローチにより、ホメオスタシス中の細胞間相互作用や再生・修復の過程をリアルタイムで観察することができます。...

唾液腺における細胞間相互作用の Ex Vivo Live Cell Imaging(英語)

学ぶマウス顎下腺へのレトロダクタルナノ粒子注入法。ポリマーナノ粒子を用いた局所薬物送達により、全身循環を迂回しつつ唾液腺機能障害治療の研究を進めます。

マウス顎下腺への Retroductal ナノ粒子注入

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