Name: ピロカルピン刺激次を介してマウス唾液機能的アセスメント分別放射線 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学ぶピロカルピン刺激によるマウス唾液機能評価法。気管切開、唾液採取、腺解剖の技術を含むモジュール型プロトコルで、口腔乾燥や唾液過多の研究に応用可能です。

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この出版物で報告された研究は、国立歯科研究所と顔面研究 (NIDCR) ・賞数 R56 DE025098、UG3 DE027695、F30 CA206296 の下で健康の国民の協会の国立癌研究所 (NCI) によって支えられました。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。この作品も、NSF DMR 1206219 と口腔ケア賞 (2016), 技術革新によって支えられました。
唾コレクション援助の博士えり丸山とアンドリュー ホローモンに感謝したいと思います。腺解剖して彼の支援の Pei Lun 翁に感謝したいと思います。我々 は図の準備の彼の援助のマシュー ・ インガルスを感謝したいです。この原稿の批判的読解の博士 Elaine Smolock とエミリー呉に感謝したいと思います。

すべては、生体内での下記手続は、ロチェスターの大学、ロチェスター動物資源の大学委員会によって承認されました。NY。
1. 準備
<ol><li>分析用天秤を使用すると、ピロカルピンの 20 mg の重量を量る。微量遠心チューブの滅菌生理食塩水 2 mL に溶かします。 注: ピロカルピンが光に敏感で、時間をかけて活動を失うのでこのソリューション必要があります準備注入の日と投与までの光から保護されました。</li>
	<li>分析用天秤を使用すると、重量を量るし、すべてのコレクション チューブ、ガラス管を識別します。コレクション チューブ、ガラス管の数には、マウスの数を一致する必要があります。</li>
</ol>2. 気管切開
<ol><li>分析用天秤を用いた C57/BL6 マウスの重量を量る。</li>
	<li>29 x ½"針で 0.5 mL シリンジを使用して、100 mg/kg 10 mg/kg とケタミン ・ キシラジンの腹腔内注入滅菌生理食塩液をマウスを麻酔します。マウスが応答する刺激 (すなわちペダル逃避反射の不在) に一般的に投与 5 〜 10 分以内に発生するときは、次の手順に進みます。</li>
	<li>綿の先端アプリケータに潤滑剤を塗布後軽く目に適用され、仰臥位でステージ上にマウスを置きます。麻酔下の動物は、暖かい表面に保たれなければなりません。 注: すべての手順は、室温で実行されます。</li>
	<li>鼻、手足、サージカル テープを使用して、ステージに尾を保護します。</li>
	<li>きれいにしアルコール ワイプで首を濡れています。 注: これは入力後切開から毛皮を防ぐため役立ちます。</li>
	<li>鉗子で腹側正中線の首の皮膚を引き上げ、解剖はさみを使用して小さい、表面的なカットをします。開口部にはさみをご案内し、ゆっくりと皮下組織面を分離するブレードを開きます。</li>
	<li>口の下に 1 cm 上げた肌に保つ、慎重にカットします。</li>
	<li>最初のカットの劣ると優れた側面を 2 つの横切開を確認します。鉗子を使用すると、頭と首の構造へのアクセスを有効にする皮膚反映まで優しく。</li>
	<li>顎下腺 8 倍の倍率で解剖顕微鏡を用いた可視化 (正中線:図 1)。</li>
	<li>微細鉗子を使用すると、気管を覆う 4 つの舌骨下 (ストラップ) 筋肉を公開する腺をそっと持ち上げます。涙や周囲の血管や導管を中断することを避けるため。</li>
	<li>1 つ以上のマウスから唾液を収集する続行する前に各マウスを使って手順 2.1 2.10 を繰り返します。 メモ: この手順が安全で実行できます 5 マウスまで同時に。</li>
	<li>小さな解剖はさみでできるだけ正中線に近い滞在中ストラップの筋肉の内側の部分を削除します。気管を視覚化し、プロシージャの間に方法のストラップの筋肉を保つために必要な量だけカットのみ。ピロカルピンが分泌を誘導する効果的ではない重要な出血にセカンダリ ボリュームの枯渇がある場合ために任意の近くの血管を傷つけないでください。</li>
	<li>気管からストラップの筋肉を反映してください。</li>
	<li>喉頭・気管・甲状腺を視覚化します。気管がない組織を覆うことを確認します。</li>
	<li>小さな解剖はさみを使って甲状腺に劣る/後部気管内横切開を加えます。気道が特許と流体の明確なことを確認します。</li>
</ol>3. 唾液コレクション
<ol><li>口と角解離ステージ下方近くテープを削除 (45 ° 頭側) 唾液の流れを支援します。</li>
	<li>29 x ½"針で 0.5 mL シリンジを使用して、100 mg/kg の総線量の 10 μ L/g 本体重量ピロカルピンの腹腔内投与を実行します。</li>
	<li>タイマーを起動します。複数のマウスを投与している場合、は、迅速に移動することによって、アシスタント残りのマウスを同時に注入することでリードタイムを短縮します。</li>
	<li>通常鉗子を使用すると、キャピラリー チューブのアクセスのための口を開きます。</li>
	<li>口の中で唾液のビードを観察すると、遠位端で、流体にキャピラリー チューブの近位端の場所が (両方のチューブが事前の重量を量った) 解離性の段階の下に収集の管に配置。 注: C57/BL6 雌ネズミの 6-10 週齢総唾液分泌に発生しますピロカルピン注射の 2 分以内。</li>
	<li>唾液は、口の中でビル管を通って流れていない場合、前の手順を再試行します。入口を妨げることができる粘膜表面に対して直接チューブが配置されていないことを確認します。</li>
	<li>ピロカルピン刺激 12 分の合計のため唾液を収集します。ストーマは明確に残ることを確認します。 注: この時間の間に、通常一回換気量の増加や分泌物 (唾液、尿、便) が。</li>
	<li>マウスは唾液の機能に踏み込んだ場合 (e.g。、ケガや介入のため)、P200 ピペットを使用してコレクションの管口から残りの流体に転送。複数のマウスから収集する場合は、ヒントを変更することを確認します。</li>
	<li>ピロカルピン注射後採取唾液プラス チューブ 12 分の重量を記録します。</li>
</ol>4. 腺解剖
<ol><li>CO2安楽死によってマウスを安楽死させる (動物の安楽死の AVMA のガイドラインに従って: 2013 年版) 開胸、頭と首の構造を維持するために世話が続きます。このため、安楽死の方法として頚部転位を避けます。</li>
	<li>仰臥位でステージ上にマウスを置きます。気管 (図 1) を元のサイトで腺の位置を変更します。</li>
	<li>8 倍の倍率で解剖顕微鏡を用いた視覚化大腺: PG、SMG、SLG。解剖中腺を区別するために、PG がびまん性、SMG と SLG に横で横になっていることを特定します。 注: PG を解剖する場合これされるべき最初だから少なくとも定義され引き裂かれるらしい。</li>
	<li>基になる構造から引き離し、鉗子で PG の尾をつかみ、優しく解剖はさみで PG の頭を切断する前に緊張を適用します。</li>
	<li>鉗子を用いた SMGs を覆う被膜を破る。左と右の SMG を優しきます。</li>
	<li>無料の鉗子を用いた付着 nonglandular 組織から SMG の背側面。</li>
	<li>鉗子でピンと張ったウォートンのダクトを描画し、解剖はさみとダクトを切断、首から SMG を削除します。</li>
	<li>SMG は鉗子を使用してから、SLG を優しきます。 注: SLG は、SMG の上外側面では。</li>
	<li>分析のバランスを使用して、SMG の重みを記録します。</li>
</ol>

<ol><li>Bradley, P., O'Hara, J. <a target="_blank" href="http://www.surgeryjournal.co.uk/article/S0263-9319(15)00194-5/pdf">Diseases of the salivary glands.</a> Surgery (Oxford). 33 (12), 614-619 (2015).</li>
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</ol>

著者が明らかに何もありません。

腺傷害や治療研究に適用可能な唾液腺機能を評価するためにマルチ ステップ法を提案します。私たちの手順には、気管、唾液のコレクション、および唾液腺の生物学の統合研究をサポートすることができます実験アプリケーションを持つ腺解剖が含まれます。たとえば、マウスの気管は、口腔内を妨害する手順の中で一般的な気道管理のため使用されています。
ピロカルピンの適切な郭清と気管切開が必要で 100 mg/kg の唾液の分泌を刺激します。または、削減ピロカルピン投与気管切開の必要性を避けることができるし、唾液分泌16の縦断的評価のため。
唾液の分泌を記録に加えこのプロトコルは、追加の分析のため唾液を収集するために正確で一貫した手段を提供します。このような研究には、レオロジー、プロテオミクス、酵素活性、唾浸透圧25,26,27</s...

唾液腺の障害には、調節不全の過剰産生 (sialorrhea) や唾1の生産不足 (口腔乾燥症と唾液) の分泌障害症候群が含まれます。どちらの場合も、治療開発2の最終目標に向けて唾液腺の生物学の私達の理解の向上に関心があります。
唾液腺は放射線感受性非常器官、頭頸部がんの放射線治療、永久的なドライマウス (口腔乾燥症)3,4につながる間しばしば破損しています。他の放射線感受性の組織とは異なりただし、唾液腺の離職率は比較的低いと分泌の損失のメカニズムはかり5,6。このユニークなけが設定で組織再生と放射線防護戦略唾液の機能評価が必要です。実験的マウス唾液コレクションは腺に対する放射線と治療薬の評価に特に貴重なツールです。
実行して、ピロカルピン、強力なムスカリン作動薬7を使用して刺激唾液分泌の定量化の方法を紹介します。ピロカルピンは、腺分泌8,9を誘導するために自律神経を刺激します。このテストを適切に完了するには、気管切開は、マウスがプロシージャ中気道を維持するために口腔内10でプールされた分泌物から誤嚥・窒息のリスクを低減する必要があります。
これは、3 つの大唾液腺の除去で最高潮に達する、ターミナル手順: (PG) 耳下腺、顎下腺 (SMG)、舌下腺 (SLG)。機能性研究腺重量は記録され、唾液測定11,12,13を正規化する頻繁に使用されます。このデータは、前記腺萎縮が予想した結果14,15放射線研究で特に重要です。
どのように刺激唾液の分泌に関して文献の変動が実行され、16の報告があります。たとえば、ピロカルピン投与量文学スパン少なくとも 3 桁17,18,19,20,21,22,23内。今回、最適化された高用量ピロカルピン プロトコルとして合わせることができる技術 (気管、唾液のコレクション、および腺郭清) のモジュール式プラットフォームを提供することと同様に、メソッドの実行、再現性向上の目的で必要があります。
プロトコル デモに加えて、我々 は SMG 領域に分別された放射線 (6.85 Gy の 4 用量) に続く 2 週間で唾液の流れの代表的な機能のデータを含めます。

<table><tbody><tr><td>ピロカルピン塩酸塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6503</td><td>ピロカルピン</td></tr><tr><td>学生 Vannas 春のはさみ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>91500-9</td><td>気管切開用春はさみ</td></tr><tr><td>滅菌生理食塩水</td><td>メドライン</td><td>RDI30296H</td><td>生理食塩水</td></tr><tr><td>デュモン #7 鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11274-20</td><td>湾曲した鉗子</td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-10</td><td>ストレート鉗子</td></tr><tr><td>標準パターン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11000-12</td><td>鈍い鉗子</td></tr><tr><td>ファインハサミ-タングステンカーバイド</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14568-09</td>解<td>剖はさみ</td></tr><tr><td>マイクロヘマトクリットヘパリン化毛細管</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>22362566</td><td>毛細管潤滑剤</td></tr><tr><td>眼軟膏</td><td>リフレッシュ</td><td>N/A</td><td>リフレッシュ ラクリルーブ</td></tr><tr><td>ヤギ ポリクローナル抗 Nkcc1</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-21545</td><td>Nkcc1 抗体</td></tr><tr><td>DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>GraphPad プリズム</td><td>グラフパッド</td><td>ver6.0</td><td>統計ソフトウェア</td></tr><tr><td>コットンチップアプリケーター</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td>眼軟膏用アプリケーター</td></tr><tr><td>0.5cc インスリン注射器、29G x 1/2インチ</td> <td>BD</td><td>7629</td><td>腹腔内注射用シリンジ</td></tr></tbody></table>

ピロカルピン刺激次を介してマウス唾液機能的アセスメント分別放射線

Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

唾液は、シェーグレン症候群や大唾液腺に次の放射線障害の自己免疫の反作用でよく観察されます。これらの場合、病気の発症と効果的介入に関する質問のまま。唾液腺の機能評価ができる最適化されたテクニックは外分泌腺の生物学、機能不全、および治療の調査のため貴重です。ピロカルピンを実行するステップ バイ ステップ アプローチを提案するここでは、気管切開と 3 つの主要なマウス唾液腺の解剖など、唾液の分泌を刺激します。我々 はまた、これらのテクニックの中にアクセス適切なマウス頭頸部解剖の詳細します。このアプローチは、スケーラブルな仕事の流れの効率を上げる複数のマウスを同時に処理を可能にします。それぞれはさらにフィールド内でアプリケーションがこれらのメソッドの再現性の向上を目指しています。唾コレクションに加えて指標を定量化し、これらの組織の機能の正常化をについて説明します。代表的なデータは分別された放射線 (6.85 Gy の 4 用量) に続く 2 週間落ち込んで唾液腺機能と顎下腺から含まれます。

唾コレクションに刺激高用量ピロカルピンを実行するときは、誤嚥を防ぐために気道を維持するために重要なまたは口腔内の分泌物から窒息です。切開の概略図 (図 1) を提供しています。気管切開後ストーマは組織や体液の明確なままする必要があります。
唾コレクション中に毛管作用を向上させるため、下方 45 ° の角度で自分の頭を持つマウスを配置必要があります。これらの手順を実行できます &gt; 1 マウス、5 マウスを一度に (図 2) を超えることは推奨はしないが。コレクションが完了すると、チューブが蒸発損失を避けるために迅速に検討するをお勧めします。
次の唾コレクション、マウス、安楽死させた。頭と首の構造を損傷する可能性...

マウスの気管切開と 3 つの大唾液腺の分離を含む唾液のコレクションを実行する詳細なアプローチを提案します。

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

この手順の全体的な目標は、ピロカルピン刺激によってマウスの唾液機能を評価することです。この方法は、唾液腺機能障害の自然史を理解し、潜在的な介入の有効性をテストするために適用できます。当社のプロトコルは、マウス気管切開術、唾液採取、腺解剖などの技術のモジュール式プラットフォームを提供します。臨床的には、この手法は、口渇または唾液の過剰産生を評価する研究に影響を及ぼします。また、気道管理が必要な他の口腔内処置にも適用できます。このプロトコルを初めて学ぶ人は、気管切開と腺解剖が難しいと感じるかもしれません。このビデオが、適切な腺分離技術と関連する解剖学を学ぶのに役立つことを願っています。分析天びんを使用して、20ミリグラムのピロカルピンを計量し、2ミリリットルの滅菌生理食塩水に溶解します。ピロカルピン溶液は、使用日に新鮮にする必要があります。次に、手順のためにすべての収集容器を秤量し、マウスの秤量を正確に投与します。C57ブラック6系統を使用。マウスに麻酔をかけ、つま先つまみで麻酔を確認した後、綿先端のアプリケーターを使用して点眼軟膏を塗布し、マウスを仰臥位に配置します。次に、手足、鼻、尻尾をサージカルテープで固定します。次に、アルコールワイプを使用して首をきれいにして濡らします。次に、鉗子を使用して腹側正中線の首をつまみ、はさみで小さな表面的な切り込みを入れます。次に、ハサミを開口部に導き、ブレードをゆっくりと皮下開きにして組織面を分離します。皮を浮かせたまま、口の1センチ下にもう一つ丁寧に切り込みを入れます。次に、最初のカットよりも劣っている側と優れている2つの横方向の切開を行います。次に、鉗子を使用して、皮膚をそっと引き離して頭と首の解剖学的構造にアクセスします。解剖顕微鏡を使用して8倍の倍率で進行します。細い鉗子を使用して、顎下腺をそっと持ち上げて、気管を覆う4つの舌骨下筋を露出させます。周囲の血管系や排 ?? 管を引き裂いたり、混乱させたりしないでください。.複数のマウスから唾液を採取する場合は、先に進む前に、この時点まですべてのマウスを準備してください。1人で最大5匹まで同時に扱うことができます。さて、手術を続けるには、小さな解剖ハサミを使用して、正中線の近くにとどまりながらストラップ筋肉の内側部分を取り除きます。気管を視覚化するのに十分な筋肉を取り除き、筋肉が手順に干渉するのを防ぎます。ストラップの筋肉を解剖するときは、近くの血管を傷つけないようにすることが特に重要です。ニックは、出血に続発するボリュームの減少につながる可能性があり、したがって、ピロカルピンは唾液分泌の誘導に効果がなくなります。続行するには、ストラップの筋肉を気管から遠ざけて反射させ、喉頭、気管、甲状腺を視覚化します。気管が上にある組織から離れていることを確認してください。最後に、メスではなく小さな解剖ハサミを使用して、甲状腺より劣る気管に水平切開を行います。この気道が特許を取得しており、液体がないことを確認してください。唾液採取の場合は、まず口の近くのテープをはがし、次に解剖ステージを45度傾けて唾液の流れを頭蓋方向に向けます。次に、29ゲージの半インチの針が付いた0.5ミリリットルの注射器を使用して、腹腔内ピロカルピン注射を投与します。次に、タイマーを開始します。複数のマウスを注入している場合は、アシスタントの助けを借りて迅速に作業してください。次に、標準の鉗子を使用して口を開き、毛細管を所定の位置に持ってきます。唾液のビーズは数分以内に形成されるはずです。毛細管の一方の端を唾液に入れ、もう一方の端を解剖段階の下に配置された収集チューブに入れます。必要に応じて、チューブの位置を変えて唾液を吸い上げます。粘液が入口を塞ぐ可能性があるため、粘膜組織との接触を避けてください。注射時から12分間唾液を採取します。ストーマは全体を通して透明に保たれている必要があります。マウスの唾液機能が低下している場合は、P200マイクロピペットを使用してマウスの口から採取チューブに液体を移します。マウスごとに異なるチューブまたはチップを常に使用してください。すべてのコレクションが完了したら、コレクション容器の重量を再測定します。マウスを二酸化炭素窒息で安楽死させた後、慎重に開胸術を行い、マウスを仰臥位にして解剖顕微鏡ステージに置きます。次に、腺を元の手術部位に再配置します。8倍の倍率で、主要な腺、PG、SMG、SLGを視覚化します。PGは拡散性で、SMGとSLGの横方向に配置されています。最初にPGを解剖します。PGの尾を鉗子でつかみ、下にある構造から引き離します。穏やかな張力で構築し、次に解剖はさみでPGの頭をカットします。次に、鉗子でSMGを囲むカプセルを破ります。次に、左右のSMGをそっと分離します。次に、SMGの背側を周囲の非腺組織から解放します。SMGを取り外すには、鉗子でウォートンのダクトを締め、解剖ハサミでダクトを切断します。SLGは、SMGの上位側面にあります。2つの腺を分離するには、それぞれを別々の鉗子でつかみ、腺の間の組織面に1つのタインを配置します。その後、ゆっくりと緊張を高め、2つの腺が徐々にバラバラになります。腺組織を分離した後、直ちに収集容器の重量を再測定します。分析のポジティブコントロールとして、マウスSMGに放射線を照射し、コントロールと比較しました。6.85 gray の 4 分割の放射線照射の 2 週間後、唾液機能は有意に低下しました。総唾液分泌量と腺湿重量に正規化された分泌量の両方が、唾液機能容量の低下を示し、アッセイの感度を実証しました。次に、SMGが解剖されました。それらは固定され、切片化され、染色される可能性があります。ヘマトキシリンとエオシンの染色を使用して、ピロカルピン刺激の有無にかかわらず、グロスアーキテクチャを比較しました。さらに、膜ナトリウム-塩化カリウムトランスポーターであるNKCC1について、組織を免疫染色しました。どちらの染色でも、組織はピロカルピン刺激に関係なく、同様の細胞形態を示しました。このビデオを見た後、ピロカルピン刺激によるマウスの唾液機能の評価方法についてよく理解しているはずです。一度マスターすれば、このフルテクニックは1時間以内に完了します。この方法により、唾液の研究者は唾液全体を採取して腺の機能を定量化し、3つの主要な唾液腺をきれいに再現性よく分離することができます。この手順を試行するときは、特に複数のマウスで、すばやく移動し、正しい時点で唾液収集を終了することが重要です。この手順に従って、唾液全体から組成と酵素活性を測定でき、腺組織を組織学または免疫染色のために処理できます。

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Research

JoVE Journal

Medicine

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ピロカルピン刺激次を介してマウス唾液機能的アセスメント分別放射線

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