ウイルスの遺伝子改変マウスの前立腺に CRISPR ガイドの配信

この外科的処置の全体的な目標は、前立腺がん導入のためのCRISPR Cas9ガイドのウイルス送達により、マウス前立腺の遺伝子発現を変化させることです。この方法は、in vivo環境での新しい遺伝子の分析と検証に関する前立腺がん生物学の新たな問題に対処するのに役立ちます。この技術の主な利点は、人間のシナリオで見られるように、前立腺細胞のサブセットのみを標的とすることにより、複数の遺伝子の迅速な遺伝子編集を可能にすることです。

この手順に不慣れな人は、臓器のサイズと、手術を成功させるために必要な精度のために、最初は苦労するかもしれません。麻酔薬の総量5ミリリットルを新たに調製するには、塩酸メデトミジン1ミリリットルあたり1mgの0.15ミリリットル、ミダゾラム1ミリリットルあたり5mgの0.4ミリリットル、およびブトルフェノール1ミリリットルあたり10mgの0.25ミリリットルを混合します。.次に、4.2ミリリットルの滅菌生理食塩水を追加します。

手術後の塩酸メデトミジンの影響を逆転させるには、麻酔解毒剤として、アチパメゾール1ミリリットルあたり5 mgの0.1ミリリットルと4.9ミリリットルの滅菌生理食塩水を混合します。.適切な消毒と滅菌により無菌手術環境を準備し、手術器具をオートクレーブします。テキストプロトコルに従って8週齢の雄マウスに麻酔をかけた後、前立腺にウイルスを送達すること。筋肉の弛緩、ペダルの離脱、触知可能な反射を評価して、麻酔の深さを調べます。

反射神経の喪失が観察された場合は、動物の下腹部を剃ります。滅菌綿棒を使用して、眼球乾燥症による失明を防ぐために、動物の目を獣医用眼科軟膏で慎重に覆います。次に、70%エタノールと10%プロビドンヨウ素を使用して、剃った腹部を拭き取り、手術部位を消毒します。

次に、滅菌手術用ハサミを使用して、腹部の下部正中線に約1センチメートルの垂直皮膚切開を行います。次に、細かい先端の鉗子を使用して、腹膜を持ち上げて、下に横たわっている臓器の損傷を防ぎます。そして、手術用ハサミを使用して、腹膜を通して8ミリメートル以下の切開を慎重に行います。脂肪組織をそっと脇に動かして、精嚢を露出させます。

次に、リング鉗子を使用して、前立腺が特定されるまで精嚢を慎重に持ち上げます。現在、0.5ミリリットルのインスリン注射器と30ゲージの8ミリメートル針が付いています。総量30マイクロリットルのウイルス溶液を前立腺上皮に注入します。漏れを最小限に抑え、液体が組織内に吸収され、小さな気泡を形成するようにします。

次に、精嚢を腹腔に戻します。液体が小さな泡で組織内に吸収され、漏れないようにするには、精嚢と平行に、前立腺葉の形状に従って注入するようにしてください。テーパーポイント針と13ミリメートルの3/8円で、6-0吸収性縫合糸の2〜3つの単純な中断ステッチで会陰を縫合します。

次に、腹膜の損傷を避けるために鉗子で皮膚を持ち上げます。3つの滅菌4.8 x 6.5ミリメートルクリップで皮膚をホチキス止めします。手術後の回復を良くするには、滅菌済みの1ミリリットルの注射器と27ゲージ×1/2インチの針を使用して、腹腔内注射により体重1グラムあたり0.1ミリリットルの用量で麻酔解毒剤を投与します。.次に、動物を慎重にケージに戻します。

施術後1時間はケージを温熱パッドの上に置いておき、完全に回復するまで低体温症を予防してください。動物は注射の数分後に目覚めるはずです。テキストプロトコルに従って動物を毎日監視し、治療し続けます。

そして、傷口が閉じたら、スキンクリップを取り外します。マウス前立腺へのウイルス送達を評価するために、手術の3か月後にサンプルを分析しました。ここに示すように、この研究で使用したマウスは、ウイルスによって発現されるクリータンパク質に曝露された細胞でGFPを発現しました。

GFPシグナルは、前立腺上皮におけるクリー族の活性を示していますが、CRISPRガイドによって遺伝子編集が誘導されたかどうかは示していません。これらの免疫組織化学的切片は、pAKTの発現が高い細胞の焦点領域を特定し、P10の喪失を示しています。これらのパネルでは、pAKTとGFPのコステイニングによりダブルポジティブ細胞が同定され、アデノ随伴ウイルスによる前立腺細胞の形質転換が確認されました。

全体として、これらの結果は、Rosa26-LSL-Cas9-EGFPマウスとアデノ随伴ウイルスを使用して、in vivoで前立腺上皮でCRISPR-Cas9遺伝子編集を行うことができることを示しています。マスターすれば、15分で手続きが完了します。この技術は、前立腺がんの分野で複数の遺伝子を同時にin vivoで調べる研究への道を開きました。

このビデオを見た後、マウスの前立腺に基質を送達する方法を十分に理解しているはずです。一部のウイルスを扱うときは非常に危険である可能性があり、これらの手順を実行するときは常に予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。