Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブ イメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養
2018年4月20日
ここでは、共焦点顕微鏡とライブ イメージング技術に適したマウス胚から electroporated 脳脊髄スライス培養を生成する低コストかつ信頼性の高い方法を提供します。
この実験の全体的な目標は、可能な限り最も自然な環境での接線移動中の遺伝子組み換え皮質GABA作動性介在ニューロンを視覚化することです。この方法は、脳の発達におけるタンパク質の特定の遺伝子の機能喪失の影響をスクリーニングすることにより、発達神経科学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、子宮内エレクトロポレーションなどの他の同様の方法と比較して、低コストで比較的簡単に実行できることです。
したがって、この技術は、患者に特定された特定の突然変異の病因性や、脳の発達における新規疾患遺伝子の役割を明らかにすることにより、最終的に自閉症やてんかんなどの遺伝性神経発達障害の患者の診断を改善することができます。まず、解剖と培養に必要なすべての器具を備えたバイオセーフティキャビネットを設置します。バイオセーフティキャビネット内のすべての器具に70%エタノールをたっぷりとスプレーし、器具とキャビネット内部をUVライトで15〜20分間滅菌します。
胚を採取する準備ができたら、安楽死させたダムの腹部に70%エタノールをたっぷりとスプレーします。滅菌された鉗子で腹部の皮膚を引き上げ、もう一方の手で滅菌された外科用ハサミを使用して腹部から皮膚を切り取ります。滅菌した鉗子とハサミの2番目のペアで、腹部の筋膜を引き上げ、子宮を慎重に避けながら切ります。
滅菌された鉗子とハサミの3番目のペアを使用して、子宮角を保持し、骨盤腔から切り取ります。解剖した子宮角を、アミノ酸、ビタミン、無機塩を添加した神経ベースのレボビッツ培養培地で満たされた無菌の60ミリメートルのペトリディッシュに入れます。滅菌バイオセーフティキャビネットで、2組の細いピンセットを使用して胎盤から胚を解剖し、斬首によって頭部を分離します。
ベベルは、滅菌された3ミリリットルのプラスチック製転写ピペットの先端を切断し、これを使用してヘッドを吸引し、同じサプリメントを添加した神経ベースの培養培地で満たされた新しい滅菌60ミリメートルのペトリ皿に移して血液を洗い流します。それらを固化した黒ワックスで層状にし、神経ベースのサプリメント培地で満たされた3番目のシャーレに再度移します。16ミリメートルのペトリ皿に黒いワックスを重ね、斬首された頭部を神経ベースのサプリメント培養培地に入れ、バイオセーフティキャビネット内の解剖顕微鏡の下に置きます。
左手に持った細いピンセットを使って、吻側部分を右に向けて頭を安定させます。次に、右手のナノインジェクターを使用して、1〜2マイクロリットルの色素スパイクプラスミド溶液を右側脳室に注入します。負極を頭部に対して背側かつ平行に配置し、正極を頭部の腹側に向けてMGEを標的とする電極の間に頭部を配置して、注入された脳をエレクトロポレーションします。
電極が適切に配置されたら、500ミリ秒のパルス間間隔で50ミリ秒の間、40ボルトの4平方パルスを送達します。バイオセーフティキャビネットの無菌環境で作業しながら、頭蓋骨から脳の解剖を開始します。まず、脳を慎重に避けながら、各目に針を挿入することにより、黒いワックスの層で頭を安定させます。
次に、細いピンセットを使用して首の左側を保持し、2番目の細いピンセットを使用して頭蓋骨の皮膚を後ろから前に引き裂きます。片方の手でピンセットで頭を横に持ちながら、もう一方の手で別のピンセットを使用して、脳幹のレベルで頭蓋骨を慎重に切り取り、頭蓋骨を引き上げます。ピンセットごとに、矢状面の頭蓋骨を正面に向かって切り、次に横方向に切開して頭蓋骨の破片を解放します。
次に、脳幹を持ち上げ、脳が完全に頭蓋骨から出るまで髄膜と脳神経を慎重に切断します。35ミリメートルのシャーレに、摂氏42度に保たれた液体を溶かしたアガロース溶液を入れます。次に、以前に切断したトランスファーピペットを使用して、エレクトロポレーションされた脳をアガロース充填皿に迅速に移します。
金属製の棒でアガロースをかき混ぜて、脳を井戸の中央に保ち、沈み込みを防ぎ、脳を皿と平行な吻側尾面に配置します。アガロースが固まり始めたら、脳への損傷を避けるために攪拌を止めます。アガロース包埋物が固まるのを待ちながら、処理する脳の数に応じて、6ウェル培養プレートの各ウェルに750マイクロリットルのN2添加培地を移します。
そして、充填した各培地ウェルに30mmのメンブレンインサートを入れます。かみそりの刃を使用して、脳を囲むアガロースを切断し、脳の周囲に1〜2ミリメートルのマージンを残す長方形のブロックを形成します。脳の吻側部分がブロックの前限に対して垂直になっていることを確認して、後続の切片化ステップの向きを容易にします。
アガロースブロックをビブラトームプラットフォームの吻側の端を下向きにし、腹側の端をユーザーに向けて接着します。脳を冠状切片に切開して、摂氏4度で厚さ250ミクロンの切片を取得します。滅菌したヘラで、MGEを含む2〜3つの切片を採取し、1匹の動物のすべての脳切片を単一の30mmメンブレンインサートに配置します。
セクション間の重なりを避けながら。培養プレートを摂氏37度、湿度60%、CO25%の換気滅菌インキュベーターに48時間または72時間置きます。所望のインキュベーション時間後、目的の切片を3〜5マイクロリットルの培地で満たされた8チャンバーのカバースリップに移します。
カバーガラスを環境チャンバーに置き、コンピューター支援取得ソフトウェアを備えた倒立スピニングディスク共焦点に接続して、タイムラプスイメージングセッションを設定します。TDトマトカセットを発現する実験プラスミドと目的遺伝子を標的とするSH RNAを用いてE 13.5でエレクトロポレーションした介在ニューロンは、培養48時間後のDLX5 6Cre RCEE GFPマウス胚から得られた器官型脳スライスの接線移動で見られます。介在ニューロンは、タイムラプスライブイメージングを使用して8時間視覚化されました。
この例では、同じエレクトロポレーションされた介在ニューロンがヌクレオキネシスの過程で見られます。皮質内を剥離面と平行に接線方向に移動しながら。ニューロンは、ヌクレオキネシスの過程で最初に細長い細胞体を示します。
トレーリングプロセスと分岐リードプロセスも同様です。3時間のライブイメージングの後、核酸菌の観察が完了します。トレーリング プロセスは後退し、リーディング プロセスは 2 つの長いブランチを伸ばしています。
5時間30分後、主要なプロセス分岐の1つが収縮し、ニューロン細胞体は約10ミクロン前進しました。最後に、8時間のイメージングの後、移動が一時停止し、ニューロンは再びその先行プロセスを延長し、後続プロセスが現れました。しかし、原子核はまだ前進していません。
このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば3時間で完了します。この手順を試みるときは、常に無菌環境に保つことが重要です。したがって、この手順に続いて、MGエレクトロポレーションとそれに続く外植片などの他の方法を実行して、超細胞レベルでのニューロン移動中に発生する動的な細胞骨格プロセスを解明するための答えのための追加の問題に対処することができます。
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概要
この研究は、マウス胚から低コストで効果的な電気穿孔脳オルガノタイプ切片培養を生成する技術を提示し、遺伝子変異を持つ皮質GABA能性間脳細胞の水平方向移動中の可視化を可能にします。この方法は、脳の発達における特定の遺伝子変異の影響を調査することを目的とし、神経発達障害に関する洞察を提供します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 発生生物学
- 神経遺伝学
背景
- GABA能性間脳細胞の移動を理解することは、発生神経科学にとって重要です。
- 脳の発達中の遺伝子機能の喪失は、神経発達障害に関する疑問を提起します。
- 低コストの技術は、自閉症やてんかんなどの障害の診断能力を向上させることができます。
- 電気穿孔法は、生体内での遺伝子発現の標的操作を可能にします。
研究の目的
- 培養環境における遺伝子変異を持つGABA能性間脳細胞の移動と行動を可視化すること。
- 遺伝子変異が神経発達に与える影響を特定すること。
- 発生神経科学を研究するためのより利用しやすい方法を開発すること。
使用された方法
- この方法は、マウス胚から得られたオルガノタイプ切片培養を採用しています。
- 生物学的モデルには皮質GABA能性間脳細胞が含まれ、特にそれらの移動に焦点を当てています。
- 電気穿孔は、発達中の脳にプラスミド溶液を導入するために使用されます。
- 主要なステップには、慎重な胚の解剖、電気穿孔、およびイメージングのための培養セットアップが含まれます。
- イメージングのためのインキュベーションと切片化は、厳密にタイミングがとられ、監視されています。
主な結果
- この研究により、GABA能性間脳細胞の内部移動パターンの観察が可能になります。
- 得られた洞察は、発達プロセスに対する変異の影響を明確にする可能性があります。
- 解剖と培養中の機械的および環境条件が、生存率と観察に大きな影響を与えます。
- 結果は、神経発達障害の根底にあるメカニズムの解明に役立ちます。
結論
- この技術は、神経移動と遺伝子機能を研究するための信頼性の高いプラットフォームを提供します。
- この方法は、脳の発達における遺伝的影響の理解を進める可能性があります。
- 洞察は、神経発達障害の治療アプローチを強化する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D to study GABAergic interneuron migration in a near-physiological context, supporting target validation for neurodevelopmental disorders. By combining ex utero electroporation with organotypic slice cultures, it provides a scalable platform for mechanistic de-risking of gene candidates linked to autism and epilepsy. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking genetic manipulation to dynamic cellular phenotypes in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in migrating GABAergic interneurons to clarify pathogenic mechanisms of neurodevelopmental disorder mutations.
- Operational Value: Supports high-confidence target selection by linking genetic perturbation to quantifiable migration phenotypes in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative live-imaging readouts of nucleokinesis, process dynamics, and migration speed for assay standardization.
- Operational Value: Enables reproducible, time-lapse confocal imaging of interneuron behavior across genetic conditions for screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains endogenous guidance cues and thalamic inputs, improving translational relevance of migration phenotypes observed in cortical slices.
- Operational Value: Facilitates continuity from gene targeting in embryonic brain to phenotypic analysis in organotypic culture for preclinical de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling gene function screening in migrating interneurons prior to lead identification, supporting go/no-go decisions based on migration defect severity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene roles in interneuron migration through direct visualization of cytoskeletal dynamics and nucleokinesis.
- Screening: Delivers quantitative, time-resolved phenotypic outputs such as migration distance, branching, and pausing for comparative analysis across conditions.
- Analytics: Provides morphometric and kinetic measurements from time-lapse imaging and neuronal reconstructions to enable statistical comparison of genetic perturbations.
- Translational Research: Preserves endogenous cortical environment and migratory pathways, enhancing relevance of findings to human neurodevelopmental disorder models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of gene candidates across multiple neurodevelopmental disorder targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by linking gene loss-of-function to specific migration defects in GABAergic interneurons.
- Operational Value: Offers a low-cost, standardized alternative to in utero electroporation with improved embryo survival and sectioning consistency.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through phenotypic screening in a disease-relevant system.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of gene targets based on severity and specificity of migration phenotypes observed.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection, ventricular injection, and electroporation parameters for MGE targeting.
- Depends on sterile technique, agarose embedding precision, and vibratory sectioning at 4°C to maintain tissue integrity.
- Necessitates environmental control during culture (37°C, 60% humidity, 5% CO2) and confocal imaging setup for time-lapse acquisition.
- Adaptation to other brain regions or cell types may require adjustments to electroporation orientation and culture duration.
- Practical limitations include dependency on embryo viability post-electroporation and section quality for consistent imaging of migrating interneurons.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:01
Collection of Mouse Embryos
2:51
Intraventricular Plasmid Injections and Ex Vivo Electroporation of the MGE
3:53
Brain Dissection and Organotypic Slice Cultures
7:16
Results: Time-lapse Live-imaging of Electroporated INs in Organotypic Slices Cultured for 48 h.
9:09
Conclusion
