Name: Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブ イメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 学ぶマウス胚脳器官型スライス培養におけるエレクトロポレーション法で、GABA作動性介在ニューロンの接線移行を可視化する技術です。遺伝子変異が脳発達に与える影響を解明し、神経発達障害の診断改善に貢献します。

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この仕事は、サボイ財団と治療てんかん財団からの助成金により運営された、E.R (共焦点顕微鏡) と G.H (回転ディスク共焦点顕微鏡) 革新のためのカナダの財団から助成金装置によって。小胞体からのキャリア賞を受賞、フォン デ recherche du ケベック州健康(周波数-S;Clinician-scientist 賞) でなく、健康研究 (機構; カナダの機関から若手研究者賞を受賞)。周波数 S の上級学者はガーナL.E はチュー サント-ジュスティーヌ基礎ポスドク研修賞、周波数 S ポスドク研修賞、星の財団との提携で、サボイ財団から Steriade サボイ博士課程終了後の訓練賞の受信者です。このプロジェクトはカナダ脳研究基金、ル. に与えられる健康カナダの金融支援を通じて脳カナダによって実現されました

すべての実験動物を含む Comité Institutionnel デもの Pratiques avec les チュー サント-ジュスティーヌ研究所 Animaux」(CIBPAR) で承認された、動物ケアの入門のカナダの評議会に従って実施されました。ケアと実験動物 (第 2 版) の使用。
ここで説明されているプロトコルは、日 (e) 13.5、同時にピークの CGE 派生 INs 生産45,46前に、とき MGE 派生アドインが積極的に生成される胚のエレクトロポレーション用に最適化されました。さらに、gaba 作動性インに向かってエレクトロポレーションをバイアス、アドイン (たとえば、最小限のエンハンサーとDlx5/6プロモーター)47で選択的に発現プロモーターを使用します。
1. 電気穿孔法と脊髄スライス培養用溶液の調製
<ol><li>無菌培養の培地の 125 mL を準備します。<ol>
<li>正規ニューロン固有文化媒体の 125 mL を測定 (定式化の材料表を参照してください) 以前 UV 殺菌バイオ キャビネットの滅菌瓶 70% エタノールを散布します。無血清細胞固有のサプリメントは、1.75 mL 200 mM グルタミン (最終濃度 0.5 mM) の熱不活化馬血清無菌条件下で以前検体の 6.25 mL × 50 の 2.25 mL を追加します。ミックス徹底的に、生殖不能の円錐管に 15 mL の因数と 4 ° C で保存 注意: 培地準備が 4 ° C で最大 3 週間保存することができます。</li>
		<li>無菌条件下で 150 μ 因数に X の Botteinstein の N-2 定式化48の原液 100 を分割し、使用するまで-20 ° C で凍結します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>無菌人工髄液 (アプライド) の 1 リットルを準備します。<ol>
<li>800 mL の 1 L ビーカーに蒸留水を測定します。ショ糖の 25.67 g、塩化ナトリウム (NaCl) の 5.08 g、炭酸水素ナトリウム (NaHCO3) の 2.18 g ブドウ糖、塩化カリウム (KCl) 0.19 g の 1.80 g 0.15 のグラムを追加一塩基無水リン酸ナトリウム (NaH2PO4)、1 M 在庫 CaCl 21 mL.2H2O と 1 M の 2 mL 在庫 MgSO4.7H2O. 攪拌室温で溶解します。蒸留水 1 L の総ボリュームに到達するを追加します。</li>
		<li>0.22 μ m のフィルターを使用して、滅菌バイオ セーフティ キャビネットにおける滅菌ボトルにソリューションをフィルターし、4 ° C で 1 ヶ月保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>各実験の前にアプライドで 4% の agarose の新鮮なソリューションを準備します。<ol>
<li>50 mL の生殖不能の円錐管の事前に準備されたアプライドの 25 mL を測定し、ポイントの低融点アガロースの 1 グラムを追加します。</li>
		<li>45 熱電子レンジで s。こぼれる、沸騰を開始するときにすべての 3-4 秒を加熱を中断、圧力をそれを再び閉じて、agarose をミックスする手動で攪拌させるチューブを開きます。アガロース溶液が均一になるまでを繰り返します。42 ° C で凝固を避けるために実験の残りの中にアガロース溶液を維持します。 注: より高い温度が脳組織を損傷します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 注入のプラスミッドの準備
<ol><li>ガラス製のインジェクション ピペットをプルします。<ol>
<li>マイクロ ピペット引き手適切なパラメーターを設定、設けられたスペースにはガラス毛細血管を保護し、フィラメントと中央に表示かどうかを確認します。</li>
		<li>プルダウン ボタンを押します。</li>
		<li>先端の損傷を避けるためにさらに使用するまで熱の引き手およびボックスまたはきれいなペトリ皿の場所から新しく作ったマイクロインジェクション ピペットを慎重に取り外します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>すべての計測器とキャビネットのバイオ セーフティのセットアップ必要この実験 (図 1A参照)、寛大 70% エタノールでバイオ セーフティ キャビネットにすべての楽器を散布し、楽器と 15 〜 20 分のための紫外光を用いた環境消毒します。</li>
	<li>殺菌のステップ中に氷 (4 ° C) の上のプラスミドを解凍します。</li>
	<li>きれいな 1.5 mL 遠心チューブに原液 (4 μ g/μ L) からのプラスミッドの 10 μ L を測定します。ファストグリーン FCF の 0.01% を追加します。穏やかに混合、簡単にスピンし、氷に使用されるまで続けます。 注: マキシ prep DNA は、エンドトキシン フリー マキシ準備キットを使用して製造元のプロトコルに従って準備されるべき。TE バッファーまたはヌクレアーゼ フリー DNA を可溶化することができます H2O および生殖不能の条件の下で実行する必要はありませんが、色素のソリューションが付いているプラスミッドの準備。マキシ prep からプラスミドを複数凍結融解サイクルを避けるために検体にする必要があります。検体プラスミド染付ないよりその 2 h 使用の前に混合されるべきそれ以上の使用のない凍結する必要があります.</li>
	<li>滅菌後、ナノ インジェクターをとおり準備します。<ol>
<li>クリーン ボックスまたはペトリ皿と約 15 μ m の外径を達成する斜めの方法でピペットの先端をカットする小さなピンセットに格納されている事前に準備されたガラス製のインジェクション ピペットのいずれかを選択します。 注: ここに与えられた外径ユーザーの我々 は、我々 の実験のアイデアを与えるに概数で、流体を許可しながら、脳を損傷することがなくプラスミド注射用スカルのピアスを容易にするために最適化されていますローディングおよび DNA のリリース。外径は、明視野顕微鏡下のミクロ スケール バーにあてるガラス マイクロインジェクション ピペットのカットを見ることによって測定できます。</li>
		<li>注射器を使用して、その unpulled の終点 (すべての空気を吐き出す) から鉱物油で、ピペットを塗りつぶします。</li>
		<li>製造元の指示に従い、ナノ インジェクターに充填ガラス マイクロ ピペットを挿入します。</li>
		<li>空 2/3 rds ガラス マイクロ ピペット (空気のエントリを防ぐために十分な油を維持する)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>慎重に管内プラスミド/染料の解決の準備のマイクロ ピペットを挿入、プラスミド/色素溶液をガラス マイクロ ピペットを埋めます。</li>
</ol>3 妊娠中の女性からマウス胚のコレクション
<ol><li>膣をプラグインするため、できれば毎日同じ時間 (午後の早い時間) に評価するために毎日の繁殖の女性を監視します。日 e0.5 は膣にプラグが観察される最初の日に対応します。 注: ここで説明した実験は、野生型マウスで実施できます。ただし、MGE の識別を容易とすべての gaba 作動性を (または特定のサブ セット MGE 派生アドインなど) のラベルには、トランスジェニック動物使用できます (例: GAD67EGFP;Dlx5/6Cre Cre レポーター遺伝子など47,49と)。このような状況で注入実験プラスミドは transfected INs の可視化を (黄色) 非 transfected INs (緑) とを比較できるように、別の蛍光体 (例えばmCherryまたはTdTomato) を表現しなければなりません。</li>
	<li>首脱臼によって胚日 e13.5 に女性を犠牲に。 注: 犠牲の時に指定された麻酔薬の移行と生存の50,51で影響を与える可能性があり、避けるべきであります。</li>
	<li>とおり、帝王切開によって胚を収集します。<ol>
<li>70% エタノール スプレー女性の腹部の寛大。滅菌ピンセットのペアで腹部の皮膚を引き上げて、もう一方の手で、腹部から皮膚をカットする滅菌手術用ハサミを使用してください。</li>
		<li>滅菌ピンセットとはさみの 2 番目のペアで腹部の筋膜を引き上げ、子宮を慎重に回避しながらカットします。</li>
		<li>滅菌ピンセットとはさみの 3 番目のペアを使用して、子宮の角を引き、骨盤腔内のそれらをカットします。60 mm の滅菌シャーレで、アミノ酸、ビタミン、無機塩類 (市販製品の材料の表を参照) を添加した神経系培養培地でいっぱいに切り裂かれた子宮角を配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>滅菌バイオ セーフティ キャビネット、胎盤から胎児を解剖し、斬首でヘッドを分離する高級ピンセット (それぞれの手に 1 つ) の 2 つのペアを使用します。</li>
	<li>面取りカット 3 mL の滅菌プラスチック転送ピペットの先端を吸引ヘッドと転送凝固黒ワックス層し、同じ神経ベースでいっぱい新しい滅菌 60 mm のペトリ皿に補足として上記培。 注: この手順は、(マウス毛、血液) は汚染物質の移動を最小限に抑えます。黒のワックスは、解剖時に頭を安定させるために使用されます。培地は、これらの手順の中に酸素を受け取る必要はありません。</li>
</ol>4. 心室プラスミド注射と、MGE のEx Vivoエレクトロポレーション
注: 次の手順は、事前に準備されたバイオ セーフティ キャビネットの無菌条件下で実行する必要があります。
<ol><li>場所 60 mm のペトリ皿層黒ワックスであり、バイオ セーフティ キャビネットの双眼鏡の下で培を補足ニューラル ベースで首のない頭を含みます。</li>
	<li>頭、右、左の手で高級ピンセットで直面している吻側部を安定させるし、右手で右側脳室にプラスミド/色素溶液の 1-2 μ L を注入するナノ インジェクターを使用します。 注: 共発現実験をすることができます co electroporating がモル濃度で両方のプラスミドの混合により救助プラスミッドおよび shRNA 発現プラスミドを行います。</li>
	<li>Electroporate 注入された脳。<ol>
<li>背側に配置され、頭に並列負電極と電極と対象とする、MGE 頭の腹側に向かって正の電極の間に頭を配置します。</li>
		<li>電極に位置付けている、一度 500 ms、50 ms の 40 V の 4 正方形パルス パルス間間隔を提供します。</li>
		<li>既にキャビネット、バイオ セーフティにおける配置ピンセットを使用して電極から任意の残留組織を削除します。 注: これらのパラメーターは、実験に用いた遺伝子導入装置のために特別に最適化されています。遺伝子導入装置の異なる種類を使用している場合ユーザー最適化テストを前もって実行することをお勧めします。</li>
		<li>すべての残りの脳の 4.1 から 4.3 の手順を繰り返します。 注: このプロトコルでは、1 つの脳のために必要な操作について説明しますが、収量が増えてそれぞれの脳 electroporating の前に順番に最大 4 脳を差し込むことが可能です。この戦略は、2 つまたは複数の異なるプラスミド注入される順番に (コントロールまたは実験プラスミドなど) (同腹子と比較できるように) 同じ実験中に特に有利であります。さらに、それは注入することが可能と electroporate 同時に電極を脳の表面に完全に平行に配置することで、収量を増やすには、脳の両側。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 脳の解剖と脊髄スライス培養
<ol><li>まだ、バイオ セーフティ キャビネットの無菌環境で操作しながら頭蓋骨から脳を解剖します。<ol>
<li>脳を慎重に回避しながらそれぞれの目に針を挿入することによって黒いワックスの層に頭を安定させます。</li>
		<li>首の左側にある 2 番目の最後部から、頭蓋骨から皮膚を引き裂く高級ピンセットのペアを保持するのに高級ピンセットのペアを使用します。</li>
		<li>片方の手でピンセットで頭を横方向に押しながら、脳幹のレベルで頭蓋骨を慎重にカットし、頭蓋骨を軽く引いて別のペアのもう一方の手でピンセットを使用します。各ピンセット, フロントに向かって、矢状面 (正中線) の頭蓋骨をカットし、頭骨の断片を解放するために横方向に切開します。</li>
		<li>脳幹を持ち上げ、髄膜と脳神経を脳が頭蓋骨から完全になるまで慎重にカットします。 注: 5.1 で説明したすべてのステップは、バイオ セーフティ キャビネットにおける厳格な無菌条件の下で行わなければなりません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>4% ポイント agarose の区分のための低融点で脳を埋め込みます。<ol>
<li>(42 ° C で液体を保持) 上記準備アガロース溶液で 35 mm のペトリ皿を埋めます。</li>
		<li>以前カット転送ピペットを使用して agarose いっぱい料理に electroporated 脳をすばやく転送します。室温で料理をしてください。</li>
		<li>(沈没を防ぐため) によく途中で脳を保つために金属棒でアガロースをかき混ぜると吻尾側平面に脳を料理に並列に位置します。固める、脳損傷を避けるために agarose の起動時を攪拌を停止します。</li>
		<li>かみそりの刃を使用すると、脳の周り 1-2 ミリの余白を残して、長方形のブロックを形成するために、脳を取り巻くアガロースをカットします。脳の吻側部が手順については、後続の断面の向きを容易にブロックの前方限界に垂直になるようにします。</li>
		<li>それぞれの脳に繰り返します。 注: それぞれの脳をさまざまな高さで設定中独立したアガロース ブロックを形成して時 (最大 3) 2 つ以上の脳を切断が可能です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vibratome コロナ セクションとスライス培養。<ol>
<li>100 X N-2 の雪解け 1 つの因数は、氷の上 (150 μ L) を補完し、検体無菌条件下で培地 15 mL を加えます。</li>
		<li>6 ウェル培養プレートの各ウェルに培地 (の 1 つ X N2 の補足) 750 μ L を転送します。</li>
		<li>ツル首ピンセットで培地充填も各細胞文化挿入 (直径 30 mm、0.4 μ m の細孔径、PTFE) を配置します。</li>
		<li>連続的に酸素のアプライドで vibratome お風呂を埋めます。お風呂の周囲の氷と 4 ° C に冷却または冷蔵 vibratome を使用します。</li>
		<li>&Gt;0.150 mm/s と 80 ヘルツに周波数 vibratome 速度を設定します。</li>
		<li>アガロース ブロック vibratome プラットフォーム、吻側端を下向きに、腹側を接着端のユーザーが直面しています。</li>
		<li>(4 ° C) で 250 μ m 厚のセクションを取得するコロナ セクションで脳をカットします。</li>
		<li>滅菌へら MGE と慎重にセクション間の重複を回避しながら、単一の 30 mm 膜 1 つの動物からすべての脳のセクションを挿入する場所を含む 2-3 セクションを収集します。(前述の通り補った培地、750 μ L を含む) 6 ウェル培養プレートのウェル 1 個に挿入を配置します。また、各セクションは、500 μ l 添加した培養液でいっぱい 12 ウェル培養プレートの別々 の 13 mm 径膜に配置できます。培養液を各ウェルに推奨量では、水没することがなくメディアを栄養する脳セクションことができます。 注: 5.3.6 5.3.7 で説明されている手順が実行されない完全な無菌条件の下で、vibratome の滅菌処理・ バイオ セーフティ キャビネットで使用しない限り。したがって、任意の汚染を避けるために注意深く手順を実施することが重要です。適切な保護具 (クリーン マスク、手術用手袋、白衣) に着用するべきすべての時間や身体の部分も覆われているような髪、顔、手、培養皿 (培養液の有無にかかわらず) に渡してください。また、手袋とへらの脳のセクションを収集するために使用頻繁に 70% エタノールをスプレーすることをお勧めします。</li>
		<li>48 または 72 h の 60% 湿度と 5% CO2と 37 ° C で換気滅菌インキュベーターで培養プレートを配置します。 注: これらのインキュベーション時間が MGE 派生アドインのタイムラプス イメージングと固定のスライスの共焦点イメージングそれぞれ最適化されました。最適なインキュベーション時間は、各実験的なデザインの事前テスト必要があります。さらに、選択した培養が 72 時間の場合と下、培養培地を変更する必要はありません。インキュベーション時間が長く、培養培地は 2-3 日毎変更必要があります。</li>
		<li>目的の培養時間後 8 腔症 coverslip に関心のセクションを転送し、培地の 3-5 μ L を追加します。(37 ° C、湿度 60%、5% CO2) 環境室 coverslip が逆に接続されている場所は回転ディスク共焦点タイムラプス イメージング セッション セットアップするコンピューター援用取得ソフトウェアを装備しました。 注: また、セクション 4% パラホルムアルデヒド (一晩で 4 ° C または室温で 2 時間)、その後 electroporated を共焦点の下の形態学的特徴の可視化のための異なった抗体と immunostained で修正されることができます。顕微鏡。EGFP と mCherry 任意のプロシージャを反汚すことがなく共焦点顕微鏡で目視できる、固定プロセスは、蛍光を減らすことができるので、信号を向上させる GFP および mCherry に対する免疫組織化学を行うお勧めの削減先頭または末尾のプロセスの小さい枝などの萌芽期ニューロンの細かい成分の検出。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。ここの見解厚生労働大臣またはカナダ政府の見解を必ずしも表さない。

この記事で私たちは子宮 ex e13.5 にマウス MGE のエレクトロポレーションを実行するため、胎生期脳スライスの切片文化の生成のための信頼性の高い方法を提供します。体外メソッドでは、ボイデン室アッセイなどは比較的簡単に実行および異なる遺伝子やその他の要因を干渉することがなくタンパク質の特定の役割を評価するために使用することができます、彼らを排除するでの調査方向性と移行パス25に関して移行動態。MGE 植の効果的な手段として紹介したが、最も内因性の手がかりに欠けているでは、移行中に発生する動的な細胞骨格の変化を研究し、多くの場合 (ただし、これは、神経細胞移動を促進するために指導手掛かりを追加する必要MGE 植が皮質フィーダー層培養した場合は大幅に向上)25,54。それにもかかわらず、MGE 植に基づくアッセイは INs29の特定方向または移行パスを導くなどのより微妙なメカニズムに関与す...

皮質 gaba 作動性介在ニューロン (INs) はその生化学的性質、生理学的性質と接続性に関して多様であり、彼らは成熟したネットワーク1,2,3 でさまざまな機能を仲介します。、4,5。皮質の INs のさまざまなサブタイプの仕様が広く調査1,2されている遺伝子のカスケードを堅く調整されます。大脳皮質 gaba 作動性 INs の大部分 (70%) 内側神経節隆起 (MGE)、腹側に位置する萌芽期の構造の前駆細胞に属し、皮質板1、に到達する比較的長い距離の間で移行する必要があります。2,6皮質錐体細胞に移行放射状グリア細胞足場に沿って皮質板 (VZ) の心室の地帯から放射状、さまざまな組み込みが必要ですこのような足場に接続されていない、あるプラグインの接線方向の移動と。非皮質構造2,7,8から彼らを指導しながら皮質板へ移行するニューロンを誘致する外因性の手がかり。細胞周期を終了すると、アドインは、MGE から皮質板9,10に向かって接線方向の移動をトリガーする MGE の VZ 内で表現される化学療法反発手掛かりによって撃退されます。アドインの移行異なる反発手掛かり11の援助と線条体を避けるため、皮質板に達すると後、彼らは、接線方向から放射状移動モードに切り替えるし、錐体からキューに応答の一部の彼らの最終的な層流位置に到達セル12と他の細胞集団13。他の神経細胞の集団として、アドインの移行は、ニューロンの実際の動きを許可する様々 な動的形態変化を伴います。このいわゆる神経運動は 3 つの連続する手順の反復的なサイクルによって特徴付けられる: 主要なプロセス、核 (nucleokinesis) のアクティブな前向性モーション、後続プロセス14の撤回の伸長。移行ではドライブの分岐と向きと移行14,15 の速度を決定する、適切な方向に INs を導く主要なプロセスのアクティブな改造多数の組み込みと外因性手掛かりによって規制されて ,16。
移行した皮質を規制する要因は、近年1,2,7,17,18,19、20、広く研究されています。つながる神経発達障害、小児難治性てんかんや自閉症スペクトル障害1,2,21,などいくつかのこれらの分子の俳優の中断が仮定されています。22,23,24します。 したがって、生体外でそして生体内の様々 なアプローチの開発は以前に再検討された25として、動的な過程を研究する当社の能力が大幅に躍進する追求されてきた。体外メソッド、ボイデン室アッセイとストライプの選択法などを含む神経移行中に要件と特定の遺伝子または蛋白質の細胞の自律的影響を評価するための最速かつ最も再現性のある手段を提供します。他の影響を受けずに25 をを要因します。これらのアッセイは、ライブ イメージング8,26,27と組み合わせると特に役立ちます。これらの技術を簡単に e13.5 MGE から取得および8,28 を以前示すようにその後様々 なシグナル伝達経路と指導の手がかりを調べることができます、酵素と機械的解離によって分離.ただし、これらの試金は細胞遊走や生存25に影響を与える可能性がある神経細胞の挙動と細胞プロパティを変更するかもしれない三次元組織アーキテクチャの不在で人工細胞外マトリックスの場所を取る。これらの制限を回避するためにex vivo MGE 植は、速度と方向で14などのパラメーターと共に移行中に発生する動的形態学的変化を定量化するための代替ツールとして開発されています。 29。MGE 植を生成するは比較的簡単です、広くされている30を他の場所で説明されています。それは後者がオプション31マトリゲルと魅力的または冷淡なキュー25の存在下でコラーゲンの混合物、混合の大脳皮質細胞の膜上に MGE の小さな抽出物のめっきを伴います。MGE 植まばら標識細胞のイメージング、32,33 を示したように分岐、主要なプロセス中に骨格改造など、細胞内のプロセスの研究を簡素化する高解像度を可能にします。、34本研究で。MGE 植は、(例えば、Tielensら201633を見なさい) 特定の薬理学的または遊走操作後例えば 2D 環境での移行時に骨格変化を評価するために正常に使用されています。.ただし、この方法で、人工マトリックス内にアドインを移行、これは動作と再現性実験結果の有意性を変更可能性があります。
対照的に、子宮内でエレクトロポレーションのネイティブ環境でプラグインの遺伝子操作を有効にし、迅速かつ効率的の制限を回避しながらゲインの影響と遺伝子機能の損失を評価するために広く使用されている方法です。高価な時間のかかるノックアウトとノックで戦略25,35。セル型特定プロモーターを使用し、MGE36を含む腹内側核の構造への電極を配置することで、子宮内でエレクトロポレーションを前駆細胞で偏ってすることができます。さらに、子宮内エレクトロポレーションにより実験的構造を 1-2 日内のタイムリーな表現のため構造式を用いたウイルスに必要な 7-10 日に比べてベクトル25。しかし、子宮内でエレクトロポレーションの前駆細胞の低降伏点傾向があります。確かに、背側心室ゾーンにある錐体細胞の前駆細胞を効率的に導入することができますが子宮内を使用して、MGE より腹側に位置する構造をターゲット エレクトロポレーションより技術的に難しいは特に小さな e13.5 に胚と胚性致死性さらに率が高い実験的利回り25が減少します。
体外に関連する技術的な制限のいくつかを回避するために MGE は実験と体内の子宮内でエレクトロポレーションを外植体、脊髄スライス培養前のヴィヴォが開発した8,37をされています。 38,39。脳切片スライス文化提供は安価で生成する動物モデル25よりも時間がかかるしながら体内を模倣の利点が条件します。確かに、これらの準備はプラグインの具体的な可視化と共に、MGE へ簡単にアクセスを許可するより生理的環境8に移行するアドインの特定の分子経路を調査する焦点エレクトロポレーションと組み合わせることができます。,39,40,41我々 はしたがって切片文化38、 ex 子宮穿孔と時間経過の共焦点レーザー顕微鏡と組み合わせて我々 のアプローチを最適化して、さらに形態学的および動的処理の発生評価。中に MGE アドインの接線方向の移動。この議定書は適応し、錐体細胞42,43の移行を検討するex 子宮または子宮内脳エレクトロポレーションと脊髄スライス培養を使用している人から最適化されたと皮質 INs36,,3944。具体的には、首をはねられマウス胚と、MGE は electroporated ex vivo実験プラスミドの脳室内注入後より効率的かつ正確に達成できるものよりも MGE 前駆細胞のターゲット子宮内エレクトロポレーション。脳が抽出されると全脳辺縁系を数日間培養することができますに分割、ので、連続追跡 transfected INs のイメージングします。このアプローチは、通常脳スライスあたりの 5-20 接線方向に移行する INs を容易に分離できるように十分にまばらなニューロン集団をラベリングしながら統計的有意性に到達するために必要な実験の繰り返しの数を最小限に抑えることをラベルします。復興と微細形態学的評価のため個々 のニューロン。さらに、切片文化確実に移行する MGE 植に比べて INs はローカル分泌ケモカインと求心系の視床からの入力などを含むより自然な環境に公開されます。この方法は方向性と主要なプロセスの分岐など細かい動的プロセスの評価を許可する十分な解剖学的な詳細を提供している間 transfected INs によって採択された渡り鳥のパスを定量化するに適してnucleokinesis と後続のプロセス撤回。

<table><tbody><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21103049</td><td>市販のニューロン特異的培養液です。このウェブサイトで入手可能な完全な処方: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html</td></tr><tr><td>B-27 無血清サプリメント</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17504044</td><td>50X 無血清ニューロン特異的サプリメント</td></tr><tr><td>15 mL 滅菌遠心チューブ</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11415064</td><td>アミノ酸、ビタミン、無機塩を添加した市販の神経ベースの培地。完全な処方は、ディストリビューターのウェブサイトで入手可能&nbsp;</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>馬血清、熱不活化</td><td>ミリポアシグマ</td><td>H1138-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ニューロセルサプリメント N-2 100X</td><td>Wisent</td><td>305-016</td><td>ボッテンシュタインの N-2 製剤</td></tr><tr><td>VWR スクエア PETG メディアボトル 125 mL</td><td>VWR</td><td>89132-062</td><td></td></tr><tr><td>クラス II タイプ A バイオセーフティキャビネット</td><td>Nuaire</td><td>NU-540</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>BioShop</td><td>SUC700.1</td><td></td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム</td><td>BioShop</td><td>SOD001.1</td><td></td></tr>重<tr><td>炭酸ナトリウム</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>D +グルコース</td>ミリ<td>ポアシグマ</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>ナトリウム一塩基無水</td><td>BioShop</td><td>SPM400.500</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カルシウム二水和物&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td><td>BiosShop</td><td>MAG522</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>BioShop</td><td>AGA002.500</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 滅菌遠心チューブ</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 遠心チューブ</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>P-97 フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー</td><td>サッターインスツルメンツ株式会社</td><td>モデル P-97</td><td></td></tr><tr><td>0.4 mm I.D. x 75 mm キャピラリーチューブ</td><td>ドラモンド科学</td><td>1-000-800/12</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VWR</td><td>E193</td><td></td></tr><tr><td>5 mL シリンジ</td><td>ベクトン・ディキンソン &Co</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Oil (heavy)</td><td>Rougier Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WPI Swiss Tweezers #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>504511</td><td>11 cm, ストレート, 0.06x0.07mm チップ, 反磁性.これらのうち2つが必要になります。</td></tr><tr><td>WPIスイスピンセット#7</td><td>ワールド精密機器</td><td>504504</td><td>11.5 cm、0.18x0.2mm、湾曲した先端</td></tr><tr><td>HTCピンセット</td><td>ワールド精密機器</td><td>504617</td><td>11 cm、ストレート、フラット</td></tr><tr><td>操作はさみ</td><td>ワールド精密機器</td><td>501225</td><td>16 cm、シャープ/シャープ、ストレート。これらのうち3つが必要になります。</td></tr><tr><td>ドレッシング鉗子</td><td>ワールド精密機器</td><td>501217</td><td>12.5 cm、ストレート、鋸歯状</td></tr><tr><td>虹彩鉗子</td><td>ワールド精密機器</td><td>504478</td><td>10.2 cm、フルカーブ、鋸歯状</td></tr><tr><td>デベイキー組織鉗子</td><td>世界精密機器</td><td>501996</td><td>15 cm、45&deg; 角度、繊細な顎、丸</td></tr><tr><td>みを帯びた端を持つ1.5mm幅のフィッシャーブランマイクロスパチュラ FisherScientific</td><td></td><td>21-401-5</td><td>これらのうち2つが必要になります。</td></tr><tr><td>Nanoject II オートナノリットルインジェクター</td><td>ドラモンドサイエンティフィック</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>TC ディッシュ 60, スタンダード</td><td>ザルスタット</td><td>83.3901</td><td>60-mm ディッシュ</td></tr><tr><td>ティッシュカルチャーディッシュ</td><td>サルスタット</td><td>83.1800</td><td>35-mm ディッシュ</td></tr><tr><td>ブラックワックス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S17432</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット&nbsp;</td><td>Ultident</td><td>170-CTB700-212</td><td>3 mL、小型</td></tr><tr><td>電球実体顕微鏡</td><td>ライカバイオシステム</td>ズ <td>ライカM80</td><td>メーカー(FisherScientificのStereoMaster)によって製造中止になった当社の実体顕微鏡に代わるもの)</td></tr>Electro <tr><td>Square Porator</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>Tweezertrodes、Plattinum Plated、3mm</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0487</td><td></td></tr><tr><td>25G 1 1/2</td><td>ベクトンディッキンソン&共同</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>ライカVT1000S振動ブレードミクロトーム</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>GEM、シングルエッジカミソリブレード</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>71952-10</td><td>ビブラトームのブレード指定スペースに挿入する前に鈍い端を取り外し</td></tr><tr><td>てください&micro;-スライド8ウェル</td><td>イビディ</td><td>80827</td><td>15</td></tr><tr><td>ミリセル細胞培養インサート</td><td>のパックミリポアシグマ</td><td>PICM0RG50</td><td>30 mm、親水性PTFE、0.4 & マイクロ;mポア、50個入り。</td></tr><tr><td>ライカ DMi6000 顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>スピニングディスク共焦点ヘッド Ultraview Vox</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Volocity 6.0 取得ソフトウェア</td><td>Improvision/Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LiveCell Stage トップインキュベーションシステム</td><td>病理装置</td><td>LC30030</td><td>温度、CO2、湿度の制御を提供します。&nbsp;</td></tr><tr><td>SP8共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mCherry-Lifeact-7</td><td>Addgene</td><td>54491</td><td>マイケル・デビッドソンからの贈り物</td></tr><tr><td>ファストグリーン FCF</td><td>ミリポアシグマ</td><td>F7258-25G</td><td>25G ボトル、生物学的染色委員会によって認定</td></tr></tbody></table>

ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブ イメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Gaba 作動性介在ニューロン (INs) は、ドライブの認知・行動神経ネットワークの重要なコンポーネントです。大脳皮質を設定する運命を移行で腹側に組み込みと外因性の終脳 ((MGE、CGE) 内側と尾節大物を含む) さまざまなレスポンスで背側骨皮質骨板に起源の場所から接線方向手がかり。異なる方法論は遺伝子特定の経路を操作し、適切に必要な細胞骨格の動的な変化を調整する方法を調査に長年にわたって開発されている移行。子宮内エレクトロポレーションは遺伝子発現抑制の効果を研究に広く使用されています。 または形態および最終的な位置への影響を評価しながら過剰発現の特定のサブタイプします。ただし、このアプローチは容易に放射状に移行する錐体細胞を変更するのには使用されますが、それはより技術的に困難な子犬の減少生存率を与えられる低降伏点が生成される子宮内保険エレクトロポレーションをターゲットとエレクトロポレーションは、e14.5、MGE 派生アドインの勉強は、慣習として前に行われています。別のアプローチで MGE 植、MGE へ簡単なアクセスを提供、遺伝子組み換えの INs のイメージングを容易にします。ただし、これらの植で INs は内因性指導手掛かりおよび視床入力を欠いている、人工マトリックスに移行します。これは、アドインが子宮内アプローチの技術的な課題を回避しながらより自然主義的な環境で移行できますメソッドを最適化するために私たちを促した。本稿で述べるマウス萌芽期の脳脊髄スライス培養を容易に追跡、イメージおよびに応えて自然のパスに沿って移行する遺伝子組み換えのプラグインを再構築後のex 子宮穿孔の組み合わせ内因性の手がかり。このアプローチは定量化カルビンディン抗体に固定組織の神経再建を使用して様々 な形態学的パラメーターの詳細な分析と同様、コマ撮りの共焦点レーザー顕微鏡を使用して移行での動的な側面のことができます。

このセクションで我々 は制御プラスミドや脊髄スライス培養続いて e13.5 マウス胚の MGE の興味の遺伝子をターゲット実験プラスミドのex 子宮穿孔の後得られた代表的な結果を提供します。37 ° C (タイムラプス イメージング) の 48 時間または 72 h (固定および免疫組織化学的分類) で培養 (スケマティック プロトコルの図 1 bを参照)。MGE 植から移行する INs の代表例図解 (図 1を参照スケマティック プロトコル) としてここで説明法との比較があります。プラスミド MGE 前駆細胞のエレクトロポレーションは、MGE からアドインの終了を延期するよう、培養時間をそれに応じて調整する必要があります。
成功した実験で切片スライス表示共焦点顕微鏡の下で健康的なすなわち皮質層がわかりやすい明るいフ...

ここでは、共焦点顕微鏡とライブ イメージング技術に適したマウス胚から electroporated 脳脊髄スライス培養を生成する低コストかつ信頼性の高い方法を提供します。

Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブ イメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

この実験の全体的な目標は、可能な限り最も自然な環境での接線移動中の遺伝子組み換え皮質GABA作動性介在ニューロンを視覚化することです。この方法は、脳の発達におけるタンパク質の特定の遺伝子の機能喪失の影響をスクリーニングすることにより、発達神経科学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、子宮内エレクトロポレーションなどの他の同様の方法と比較して、低コストで比較的簡単に実行できることです。したがって、この技術は、患者に特定された特定の突然変異の病因性や、脳の発達における新規疾患遺伝子の役割を明らかにすることにより、最終的に自閉症やてんかんなどの遺伝性神経発達障害の患者の診断を改善することができます。まず、解剖と培養に必要なすべての器具を備えたバイオセーフティキャビネットを設置します。バイオセーフティキャビネット内のすべての器具に70%エタノールをたっぷりとスプレーし、器具とキャビネット内部をUVライトで15〜20分間滅菌します。胚を採取する準備ができたら、安楽死させたダムの腹部に70%エタノールをたっぷりとスプレーします。滅菌された鉗子で腹部の皮膚を引き上げ、もう一方の手で滅菌された外科用ハサミを使用して腹部から皮膚を切り取ります。滅菌した鉗子とハサミの2番目のペアで、腹部の筋膜を引き上げ、子宮を慎重に避けながら切ります。滅菌された鉗子とハサミの3番目のペアを使用して、子宮角を保持し、骨盤腔から切り取ります。解剖した子宮角を、アミノ酸、ビタミン、無機塩を添加した神経ベースのレボビッツ培養培地で満たされた無菌の60ミリメートルのペトリディッシュに入れます。滅菌バイオセーフティキャビネットで、2組の細いピンセットを使用して胎盤から胚を解剖し、斬首によって頭部を分離します。ベベルは、滅菌された3ミリリットルのプラスチック製転写ピペットの先端を切断し、これを使用してヘッドを吸引し、同じサプリメントを添加した神経ベースの培養培地で満たされた新しい滅菌60ミリメートルのペトリ皿に移して血液を洗い流します。それらを固化した黒ワックスで層状にし、神経ベースのサプリメント培地で満たされた3番目のシャーレに再度移します。16ミリメートルのペトリ皿に黒いワックスを重ね、斬首された頭部を神経ベースのサプリメント培養培地に入れ、バイオセーフティキャビネット内の解剖顕微鏡の下に置きます。左手に持った細いピンセットを使って、吻側部分を右に向けて頭を安定させます。次に、右手のナノインジェクターを使用して、1〜2マイクロリットルの色素スパイクプラスミド溶液を右側脳室に注入します。負極を頭部に対して背側かつ平行に配置し、正極を頭部の腹側に向けてMGEを標的とする電極の間に頭部を配置して、注入された脳をエレクトロポレーションします。電極が適切に配置されたら、500ミリ秒のパルス間間隔で50ミリ秒の間、40ボルトの4平方パルスを送達します。バイオセーフティキャビネットの無菌環境で作業しながら、頭蓋骨から脳の解剖を開始します。まず、脳を慎重に避けながら、各目に針を挿入することにより、黒いワックスの層で頭を安定させます。次に、細いピンセットを使用して首の左側を保持し、2番目の細いピンセットを使用して頭蓋骨の皮膚を後ろから前に引き裂きます。片方の手でピンセットで頭を横に持ちながら、もう一方の手で別のピンセットを使用して、脳幹のレベルで頭蓋骨を慎重に切り取り、頭蓋骨を引き上げます。ピンセットごとに、矢状面の頭蓋骨を正面に向かって切り、次に横方向に切開して頭蓋骨の破片を解放します。次に、脳幹を持ち上げ、脳が完全に頭蓋骨から出るまで髄膜と脳神経を慎重に切断します。35ミリメートルのシャーレに、摂氏42度に保たれた液体を溶かしたアガロース溶液を入れます。次に、以前に切断したトランスファーピペットを使用して、エレクトロポレーションされた脳をアガロース充填皿に迅速に移します。金属製の棒でアガロースをかき混ぜて、脳を井戸の中央に保ち、沈み込みを防ぎ、脳を皿と平行な吻側尾面に配置します。アガロースが固まり始めたら、脳への損傷を避けるために攪拌を止めます。アガロース包埋物が固まるのを待ちながら、処理する脳の数に応じて、6ウェル培養プレートの各ウェルに750マイクロリットルのN2添加培地を移します。そして、充填した各培地ウェルに30mmのメンブレンインサートを入れます。かみそりの刃を使用して、脳を囲むアガロースを切断し、脳の周囲に1〜2ミリメートルのマージンを残す長方形のブロックを形成します。脳の吻側部分がブロックの前限に対して垂直になっていることを確認して、後続の切片化ステップの向きを容易にします。アガロースブロックをビブラトームプラットフォームの吻側の端を下向きにし、腹側の端をユーザーに向けて接着します。脳を冠状切片に切開して、摂氏4度で厚さ250ミクロンの切片を取得します。滅菌したヘラで、MGEを含む2〜3つの切片を採取し、1匹の動物のすべての脳切片を単一の30mmメンブレンインサートに配置します。セクション間の重なりを避けながら。培養プレートを摂氏37度、湿度60%、CO25%の換気滅菌インキュベーターに48時間または72時間置きます。所望のインキュベーション時間後、目的の切片を3〜5マイクロリットルの培地で満たされた8チャンバーのカバースリップに移します。カバーガラスを環境チャンバーに置き、コンピューター支援取得ソフトウェアを備えた倒立スピニングディスク共焦点に接続して、タイムラプスイメージングセッションを設定します。TDトマトカセットを発現する実験プラスミドと目的遺伝子を標的とするSH RNAを用いてE 13.5でエレクトロポレーションした介在ニューロンは、培養48時間後のDLX5 6Cre RCEE GFPマウス胚から得られた器官型脳スライスの接線移動で見られます。介在ニューロンは、タイムラプスライブイメージングを使用して8時間視覚化されました。この例では、同じエレクトロポレーションされた介在ニューロンがヌクレオキネシスの過程で見られます。皮質内を剥離面と平行に接線方向に移動しながら。ニューロンは、ヌクレオキネシスの過程で最初に細長い細胞体を示します。トレーリングプロセスと分岐リードプロセスも同様です。3時間のライブイメージングの後、核酸菌の観察が完了します。トレーリング プロセスは後退し、リーディング プロセスは 2 つの長いブランチを伸ばしています。5時間30分後、主要なプロセス分岐の1つが収縮し、ニューロン細胞体は約10ミクロン前進しました。最後に、8時間のイメージングの後、移動が一時停止し、ニューロンは再びその先行プロセスを延長し、後続プロセスが現れました。しかし、原子核はまだ前進していません。このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば3時間で完了します。この手順を試みるときは、常に無菌環境に保つことが重要です。したがって、この手順に続いて、MGエレクトロポレーションとそれに続く外植片などの他の方法を実行して、超細胞レベルでのニューロン移動中に発生する動的な細胞骨格プロセスを解明するための答えのための追加の問題に対処することができます。

ex-utero-electroporation-organotypic-slice-cultures-embryonic-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、末梢神経突起伸長の栽培とタイムラプスイメージングのための妊娠中期のマウス胚の器官型スライスを準備する方法を提示する。...

末梢神経突起伸長のリアルタイムイメージングのためのGFP発現マウス胚の器官型スライス培養

E12.5マウス胚中脳から器官型スライスを生成する方法が記載されている。器官切片培養は、ドーパミン作動性ニューロンや他の腹側中脳の神経細胞の挙動を観察するために使用することができます。...

胚腹側中脳の器官型スライス培養：ドーパミン作動性ニューロンの発達を研究するための体制 in vitroで</em

大脳皮質の発達における遺伝子の機能の迅速な評価を行うために、我々は関与する方法を説明...

神経形態形成の研究のための方法：<em&gt;エキソビボ</em胎児マウス大脳皮質&gt; RNAiのエレクトロポレーション

出典: Wiegreffe, C., et. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain using In Utero エレクトロポレーション. J. Vis. Exp. (2017)...

形質導入マウス胚脳切片における皮質ニューロン放射状移動のタイムラプスイメージング

出典: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains.J. Vis. 経験。...

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神経芽細胞の遊走は、出生後の神経発生における基本的なイベントです。我々は、in vivoでの出生後のエレクトロポレーションおよび急性脳スライスのタイムラプスイメージングを使用して、移行のその後の視覚化によって神経芽細胞の効率的な標識のためのプロトコルを記述します。私たちは、ビデオトラッキングによる神経芽細胞の動態を定量的に分析するための説明が含まれています。...

生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中

ここでは、海馬の発達における特定の遺伝子の制御メカニズムを調べるためのツールを提供するプロトコルを提示します。子宮外エレクトロポレーションと器官型スライス培養を用いることで、単一細胞における目的遺伝子の発現をアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションし、発生中の遺伝子の運命を追うことができます。...

子宮外エレクトロポレーションおよびマウスの海馬組織の器官型スライス培養

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その場で 急性 エクスビボ 胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

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マウス胚脳切片における移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージング

学ぶマウス胚脳器官型スライス培養におけるエレクトロポレーション法で、GABA作動性介在ニューロンの接線移行を可視化する技術です。遺伝子変異が脳発達に与える影響を解明し、神経発達障害の診断改善に貢献します。

Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブイメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養

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