Name: 前庭と聴覚の感覚器官の三次元切片培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 学ぶ マウスの前庭と聴覚感覚器官の三次元オルガノタイプ培養法。コラーゲンIゲルを用いて組織構造を保持し、機械的刺激と遺伝子導入による内耳発生の分子・力学的シグナリング研究に応用できます。

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このプロトコルの基になる元の研究への貢献、博士 A. ドンハコボラーナー、博士 j. サルヴィと A. Petelski に感謝します。また技術支援および動物飼育のため j. ラマと・ w ・ Makmura に感謝我々。我々 は NIDCD グラント R01DC015530、ロバートソン治療開発資金と資金・ カルーソ家族財団 NIDCD トレーニンググラントは T32 DC009975 を認めます。最後に、我々 は、ハワード ヒューズ医学研究所、博士ハズペスは捜査官からのサポートを認めます。

ここで説明したすべてのメソッドは、動物のケアおよび使用委員会のロックフェラー大学と南カリフォルニア大学に承認されています。
1 (コラーゲンのオプション) 準備私 Mouse-tail 腱からソリューション
注:コラーゲン私ソリューション、商業的に利用できます。ゲルの準備のための製造元の指示に従ってください。
<ol><li>16関連機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコールに従った二酸化炭素と任意の野生型株の 5-10 若い大人 (3-5 週齢) マウスを安楽死させます。尾を収集し、室温で 4 時間以上の 70% のエタノールの沈没によってそれらを消毒します。 注:過剰な組織の脱水の結果腱抽出プロセスを妨げると、48 時間以上の培養は避けてください。</li>
	<li>各尾からメスの刃で縦カットを導入し、全体の皮膚を鉗子で取り消しによって皮膚を削除します。100 mm のペトリ皿満ちているきれいな 70% エタノールと 10 mm のセグメントにそれらをカットする皮のツインテールを転送します。 注:操作しにくい尾の薄い部分を破棄します。</li>
	<li>鉗子を使用して、ペトリ皿の底に尾の各セグメントをセキュリティで保護し、微細鉗子の 2 番目のペアを使用して、一度に 1 つ尾から腱を抽出します。個々 の腱線維が最小限の抵抗で登場。 注:昔、鈍い #5 鉗子は、この手順に適しています。</li>
	<li>酢酸分子グレードの滅菌水での (ボリューム) で 0.1% 溶液 100 mL を準備し、その溶液 10 mL を滅菌 100 mm のペトリ皿に追加します。ペトリ皿に腱を転送し、コラーゲンを変性する室温で 1 時間私を残します。</li>
	<li>1-2 mm の断片に腱をミンチに鈍、湾曲した先端の生殖不能のメスや虹彩のはさみを使用します。滅菌の 50 mL チューブにみじん切りにした腱を転送し、0.1% 酢酸 50 mL にボリュームを表示するを追加します。 注:4 つまたは 5 尾各 50 ml コラーゲンを達成するために酸の私 2.0 〜 2.5 mg/mL の濃度です。</li>
	<li>コラーゲンを冷蔵私ソリューションを完全な蛋白質の変性を促進する 48 時間の最小値のための 4 ° C で。卓上の渦と渦は 1 日 2 回 1 分の最大速度に設定します。</li>
	<li>ビシンコニン酸法による液のタンパク質濃度を測定し、コラーゲンを調整私 2.0 〜 2.5 mg/ml 4 ° C で、酢酸とストアの 0.1% 溶液を追加して濃度 注:コラーゲン私 1 ~ 2 年のソリューションを格納できます。</li>
	<li>(省略可能)コラーゲンを遠心分離機私 4 ° C と、半透明トップ画分 (ボリュームの約半分)、光学的に透明なコラーゲンを達成するためには、セクション 4 でゲル使用で 1 時間 2,000 x g でソリューション。</li>
</ol>2. 前庭と聴覚器官の解剖
<ol><li>16関連機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコールに従った二酸化炭素と任意のひずみの妊娠マウスを安楽死させます。抽出し、胚の首をはねます。 注:Lfng クレエT2/tdTomato マウスは、支持細胞 4 hydroxytamoxifen17への露出の永久的な表示を可能に使用できます。</li>
	<li>すべての作業面、郭清楽器、#5 鉗子と髪ナイフ18の 2 つのペアを含む 70% エタノールでそれらを洗浄殺菌します。</li>
	<li>#5 鉗子の 2 つのペアを使用して、または生殖不能のメスの刃で縦方向のカットを導入することで二つの半分にそれぞれの頭を分割します。内耳19を含んでいる頭骨を抽出し、冷たいハンクの平衡塩溶液 (HBSS) 60 mm のペトリ皿に 15 mL にそれらを配置します。氷の上の皿を保ちます。 注:E13.5 から E18.5 までの段階の範囲では胚が正常に使用されています。</li>
	<li>(省略可能)軽く 30 mL を含む 50 mL の円錐管にそれらを揺することによって内側の耳を洗って冷たい HBSS、3 〜 4 回、HBSS の取り付け。氷の上の管を保ちます。 注:この手順では、組織培養の可能な汚染を制限し、迅速に、組織の低下と細胞死を防ぐことができます 4 ° C に温度をもたらします。</li>
	<li>細かい #5 鉗子の 2 つのペアを使用して、側頭骨の内側の耳の区別し、冷たい HBSS でいっぱい 60 mm のペトリ皿に耳、3 つまたは 4 つ同時を転送します。</li>
	<li>前庭感覚的な器官を解剖します。<ol>
<li>耳の内側を向き、卵形嚢を探します。#5 鉗子の 2 つのペア、前庭器官の周囲の軟骨を削除します。図 1に示すように、優しく前庭神経、卵形嚢と球形嚢、半規管の接続を断ちます。卵形嚢と耳から優れたと水平半規管の添付ロレンチーニゆっくり引き抜きます。 注:このメソッドは、E16.5 - E18.5 の段階の内側の耳で使用できます。セクション 3 の下の軟骨の断片を保持します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>蝸牛を解剖します。<ol>
<li>#5 鉗子の 2 つのペアと聴覚器官を取り巻く軟骨組織を削除します。図 1に示すように、優しく蝸牛のベースと球形嚢の間の接続を断ちます。 注:段階 E13.5 - E14.5、内側を扱うことによって解剖前に軟骨を柔らかくために耳 0.25% コラゲナーゼと私のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 溶液室温で 5 分間。セクション 3 の下の軟骨の断片を保持します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>広いテフロン加工チップ 200 μ L ピペットを使用して装備、utricles と蝸牛を含む DMEM/F12 33 mM Dglucose、炭酸水素ナトリウム 19 ミリメートル、15 ミリメートル 4(2hydroxyethyl) - を添加した培地で満ちている 30 mm のペトリ皿に転送1piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES)、1 mM グルタミン、1 mM ニコチンアミド、20 mg/L 表皮成長因子、20 mg/L 線維芽細胞成長因子、インスリン 10 mg/L、5.5 mg/L トランスフェリン、5 μ g/L ナトリウム亜セレン酸。</li>
	<li>解剖の時に導入された上皮におけるカットの治癒を許可する 5% 二酸化炭素と毒ガス組織文化のインキュベーターで 37 ° C で 3 h までの卵形嚢準備を維持します。蝸牛の準備は、剥離後コラーゲンゲル 10 分に転送する必要があります。 注:前 37 ° C に成長培地を暖かく必要はありません冷たい HBSS で解剖が実行される、ため</li>
</ol>3. (オプション) コラーゲンを調整する軟骨細胞の様々 な濃度を追加することによって剛性をゲル
注:Gossetらから軟骨細胞の分離方法を修正しました20
<ol><li>コラゲナーゼの 1% 溶液を調製滅菌 1-80 ° C で PBS とストアの 100-200 μ L 因数 x 私霜氷が必要な複数の凍結融解サイクルを回避します。</li>
	<li>軟骨の部分を収集するために使用微細鉗子は 10-12 の耳から聴覚・前庭器官の解剖から残っています。軟骨から別の結合と内耳の組織。30 mm のペトリ皿に軟骨を転送し、滅菌培 300 μ L を追加します。</li>
	<li>鈍湾曲した先端の軟骨部分の長さ約 0.5 mm を達成するために組織をミンチに生殖不能のメスのブレードや虹彩のはさみを使用します。</li>
	<li>コラゲナーゼを追加私 0.25% の最終的な酵素濃度を達成するために軟骨の媒体へ。皿を 37 ° C 5% 二酸化炭素と毒ガスで組織文化のインキュベーターに転送します。ピペットの軟骨の部分を切り離して、ソリューションでは、区別は、もはやまで 1,000 μ L ピペット 20 分毎を積極的に使用し、さらに 20 分間インキュベートします。 注:段階 2.9; 卵形嚢製剤の場合軟骨細胞分離を実行できます。約 2 時間 (3-4 ピペッティング ラウンド) がかかります。</li>
	<li>15 mL コニカル チューブに細胞懸濁液を収集し、滅菌 1x PBS で 10 mL にボリュームを調整します。800 x g で 4 ° C で 5 分間遠心上澄みを除去し、10 mL の滅菌 1 × PBS で細胞を再懸濁します。4 ° C で 5 分間 800 x g で遠心し、上清を除去します。 注:セルを 2 回洗浄することが重要任意の残りコラゲナーゼ コラーゲン ゲルの私を消化します。</li>
	<li>200 μ L ピペットを使って、細胞ペレットを再懸濁しますに優しくピペットで移しに培養液 100 μ L を追加します。診断を使用してセルをカウントし、使用する前に氷でそれらを維持します。</li>
	<li>ゲル剛性を上げるには、軟骨細胞を追加私はゲル溶液 (セクション 1) と急速にミックスし、中和されたコラーゲンを凝固する前にジェル中の細胞を配布します。 注:弾性率 (剛性の測定) をゲル私のコラーゲン、軟骨細胞の数と線形増加追加11。関係が実験的に決定された線形関数Eによって記述されます = 206·Nc + 15、 EがパスカルとNcの弾性係数と、数百万で軟骨細胞数です。ゲルのための詳しいプロトコルの剛性測定は元資料11参照してください。</li>
</ol>4. 私のゲルのコラーゲンに前庭神経や聴覚の感覚器官を配置します。
<ol><li>滅菌 1.5 mL チューブでコラーゲンを準備私フェノールレッド pH 指示薬、133 μ 0.34 M 水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム 0.9 M、70 μ 1 M HEPES の 40 μ L と 10 x PBS の 160 μ L を混合することによって重合液。氷の上の管を保ちます。 注:このレシピは、重合液のコラーゲン ゲル、けど必要に応じて縮小することができます 2 mL を準備するために必要を提供します。</li>
	<li>重合液とコラーゲンの 400 μ L ミックス 100 μ L 私優しく上下チルド 1.5 mL チューブにピペッティングによる氷のソリューション。ゲル剛性を高めるため軟骨細胞を含んでいる成長媒体の 50 μ L を追加、セクション 3 で説明した軽く混ぜます。</li>
	<li>500 μ l 添加し、中和されたコラーゲンを転送私ソリューション 10 mm ガラス底を挿入すると、冷蔵 30 mm シャーレまたは 4 ウェル プレートの井戸。 注:それはコラーゲンの迅速かつ不均一な重合を防ぐために氷の上のすべての試薬を保つために重要な私。</li>
	<li>中和のコラーゲンに蝸牛または utricles をすばやく転送私ソリューションと滅菌髪ナイフ18または微細鉗子のペアを目的の位置に臓器を調整。 注:コラーゲン私重合が 1-2 分後に顕著になるソリューションが濁った。</li>
	<li>周囲の組織のソリューションが重合した後、完全な重合を確保するため 5% 二酸化炭素と毒ガス組織文化のインキュベーターで 37 ° C でシャーレまたは 20 分の 4 ウェル プレートを配置します。</li>
	<li>シャーレまたは 4 ウェル プレートのウェルあたり同じ媒体の 500 μ L あたり 0.5% ウシ胎児血清 (FBS) を添加した培 3 mL を加えます。5% 二酸化炭素と毒ガス組織文化のインキュベーターで 37 ° C で文化を維持します。必要な場合は、10 μ M 5-エチニル-2´-デオキシウリジン (EdU) 細胞の増殖にラベルを付けると成長媒体を補足します。 注:FBS の高濃度は、必要な場合に使用できます。</li>
</ol>5. ウイルス注射前庭と聴覚の感覚器官の三次元培養で
<ol><li>氷の上の目的のウイルスを解凍、0.05% の最終的な染料濃度を達成するために 0.5 mL の円錐管にトリパン ブルー溶液で混ぜます。ウイルスの実質的な希釈を避けるために 10-20 x 染料を使用します。氷の上を保ちます。 注:アデノ ウイルスはアデノ随伴ウイルス Anc80 することができます両方の有毛細胞を感染させるに対し、卵形嚢19支持細胞に感染して、卵形嚢と蝸牛21で支持細胞の 5 作品をベスト型します。</li>
	<li>クリーン微細鉗子で解剖顕微鏡双眼鏡の最高倍率で観察しながらピペット引き手上に作製したガラス針の先端を破る。 注:針の引き手の設定を最適化することが重要です。9 - 12 mm シャンク付き針と 20 - 30 μ m の開口部は最もよく働きます。</li>
	<li>インキュベーターから感覚器官培養を削除します。ガラスシリンジに針を付けるし、色素とウイルスの混合物の 2-3 μ L でそれを埋めます。感覚器官に双眼鏡を解剖顕微鏡の下で観察しながら針を進めます。</li>
	<li>三次元小嚢培養の屋根の間葉系と上皮の層を介して針の先端を優しくドライブします。青い色素を持つ卵形嚢とロレンチーニの空洞を埋めるまでウイルスの混合物を注入します。 注:感覚的な器官へ簡単にアクセスできる、ため 10 mm ガラス底のシャーレは注射に最適です。</li>
	<li>37 ° c 5% 二酸化炭素と毒ガス組織培養孵卵器で孵化させなさい。 注:緑または赤の蛍光タンパク質をウイルスの構築で使用する蛍光はウイルス伝達後明白な 24 h です。</li>
</ol>

<ol><li>Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair-cell+regeneration+in+organ+cultures+of+the+postnatal+chicken+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear.</a> Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).</li>
<li>Meyers, J. R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+change+controls+supporting+cell+proliferation+in+lesioned+mammalian+balance+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Off+J+Soc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium.</a> J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).</li>
<li>Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+utricle+as+an+in+vitro+preparation+for+studies+of+ototoxic-drug-induced+sensory+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death.</a> Brain Res. 1091 (1), 277-281 (2006).</li>
<li>Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+proliferation+in+inner+ear+sensory+epithelia+from+adult+guinea+pigs+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans.</a> Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).</li>
<li>Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Notch+activity+promotes+nonmitotic+regeneration+of+hair+cells+in+the+adult+mouse+utricles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Off+J+Soc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles.</a> J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31 (43), 15329-15339 (2011).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-regulation+of+the+Notch+and+Wnt+signaling+pathways+promotes+supporting+cell+proliferation+and+hair+cell+regeneration+in+mouse+utricles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles.</a> Sci Rep. 6, 29418(2016).</li>
<li>Chai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+induces+proliferation+of+sensory+precursors+in+the+postnatal+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8167-8172 (2012).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%2B+cells+regenerate+hair+cells+via+proliferation+and+direct+transdifferentiation+in+damaged+neonatal+mouse+utricle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle.</a> Nat Commun. 6, 6613(2015).</li>
<li>Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+and+differentiation+of+mammalian+sensory+hair+cell+progenitors%3A+a+requirement+for+EGF+and+periotic+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme.</a> Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).</li>
<li>White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+signaling+is+required+for+regenerative+proliferation+in+the+cochlea%3A+conservation+in+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals.</a> Dev Biol. 363 (1), 191-200 (2012).</li>
<li>Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+force+restricts+growth+of+the+murine+utricle%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Elastic force restricts growth of the murine utricle.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Aragona, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanical+checkpoint+controls+multicellular+growth+through+YAP%2FTAZ+regulation+by+actin-processing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors.</a> Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+a+universal+size-control+mechanism+in+Drosophila+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals.</a> Cell. 130 (6), 1120-1133 (2007).</li>
<li>Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+as+mechanosensors+and+mechanotransducers+in+regulating+organ+size+and+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth.</a> FEBS Lett. 588 (16), 2663-2670 (2014).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+YAP+oncoprotein+by+the+Hippo+pathway+is+involved+in+cell+contact+inhibition+and+tissue+growth+control%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control.</a> Genes Dev. 21 (21), 2747-2761 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%3A+2013+Edition%22">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition</a>. , (2013).</li>
<li>Semerci, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lunatic+fringe-mediated+Notch+signaling+regulates+adult+hippocampal+neural+stem+cell+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/series/7651">Methods in molecular biology</a>. , Humana Press. Totowa, N.J. 137(2000).</li>
<li>Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+adult+mouse+utricle+and+adenovirus-mediated+supporting-cell+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp+JoVE%22%5BJournal%5D)">Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection.</a> J Vis Exp JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+phenotyping+of+murine+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes.</a> Nat Protoc. 3 (8), 1253-1260 (2008).</li>
<li>Landegger, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+AAV+vector+enables+safe+and+efficient+gene+transfer+to+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear.</a> Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).</li>
<li>Burns, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinforcement+of+cell+junctions+correlates+with+the+absence+of+hair+cell+regeneration+in+mammals+and+its+occurrence+in+birds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds.</a> J Comp Neurol. 511 (3), 396-414 (2008).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+polarized+extension+and+planar+cell+polarity+in+the+cochlea+by+the+vertebrate+PCP+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway.</a> Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).</li>
<li>Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cochlear+convergent+extension+by+the+vertebrate+planar+cell+polarity+pathway+is+dependent+on+p120-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin.</a> Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).</li>
<li>Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+regulates+extension%2C+growth+and+patterning+in+the+mammalian+cochlear+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct.</a> Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).</li>
<li>Tada, M., Heisenberg, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+extension%3A+using+collective+cell+migration+and+cell+intercalation+to+shape+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos.</a> Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

仲介する成長と開発時に内耳に分化されている分子信号は盛んに5,6,7,8,9,10。ただし、小嚢のモデル システムから得られる証拠は、セル接合とカバがシグナル伝達の活性化を通した感覚の機械の手がかりがこれらプロセス2,11,も重要な役割を果たすことを示唆しています。22. 両方の感覚上皮から瀕死の有毛細胞の押出、分化転換を通じて新しい感覚受容器のそれに続く形成支持細胞、それらを引き起こして残留による機械的な力に影響することができますまた、再生時に細胞周期を再入力...

哺乳類の器官形成のほとんどの面の研究は、生体外でシステムによって促進されています。2 つの主な方法は今前庭感覚的な器官の培養用: 浮遊1と付着性2準備。両方のメソッドは、有毛細胞の脆弱性3と再生1,4 の生体外の調査を許可します。さらに、ノッチ5,6, Wnt7、8、上皮成長因子受容体 (EGFR)9,10内耳のカスケードをシグナル伝達の発達の役割があります。確立されて、一部、感覚上皮の体外培養を使用しています。しかし、細胞の成長と分化制御、細胞間の連絡先など物理的、機械的な手がかりにも介してモルフォゲン シグナル伝達細胞外マトリックスの剛性と機械的伸張または収縮だけではなく。このような機械的刺激の役割は、発展途上の内耳の生体内で調査するは困難です。また、既存の浮遊・付着性文化メソッドはこのような研究の培養に適してではありません。ここで述べるコラーゲンの三次元培養のため私はゲルのさまざまな剛性。このメソッドは主前庭と蝸牛の感覚器官の生体内でアーキテクチャを保持され、により、増殖・分化11機械力の影響の検討。
力学的刺激は、シグナリング経路12,13,14,15、カバなどの下流の分子イベントをアクティブにする知られているので機械的刺激を組み合わせることができることが重要です。生化学的および遺伝的操作。ここで説明した培養法は、ウイルスを介する遺伝子導入を可能し、内耳開発11時両方の機械的および分子伝達を研究するためすることができます。

<table><tbody><tr><td>#10外科用ブレードミル</td><td>テックス</td><td>4-110</td><td></td></tr><tr><td>#5鉗子</td><td>デュモン</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>100 mmペトリ皿</td><td>シグマ</td><td>P5856-500EA</td><td></td></tr><tr><td>250 uL大型オリフィスピペットチップ</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>1011-8406</td><td></td></tr><tr><td>30 mmガラス底ペトリ皿</td><td>松波ガラスUSAコーポレーション</td><td>D35-14-1.5-U</td><td></td></tr><tr><td>4ウェルプレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>4-ヒドロキシタモキシフェン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>H7904</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp;mm シャー</td>レ <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>123TS1</td><td></td></tr><tr><td>酢酸&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>537020</td><td></td></tr><tr><td>Ad-GFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP, chicken IgY fraction</td><td>Invitrogen</td><td>A10262&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myo7A</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sox2 抗体 (Y-17)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>上皮成長因子</td><td></td><td>Σ E9644</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>線維芽細胞増殖因子</td><td>Σ</td><td>F5392</td><td></td></tr><tr><td>フレーミング/ブラウン マイクロピペット プーラー</td><td>サッター装置</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>Σ</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤&nbsp;</td><td>Daigger</td><td>EF16034F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>Sigma</td><td>I3536</td><td></td></tr><tr><td>虹彩切除ハサミ&nbsp;</td><td>世澤メディカルインスツルメンツ</td><td>08-1201-10&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクター</td><td>成重</td><td>IM-6</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td></td><td>Σ N0636</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X), pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1X), pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red pH インジケーター&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>P4633&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>純粋なエタノール、200プルーフ</td><td>デコンラボ&nbsp;</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RFP抗体</td><td>ChromoTek</td><td>&nbsp;5F8</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td></td><td>ΣS5761</td><td></td></tr>水<tr><td>酸化ナトリウム</td><td>ΣS8045</td><td></td><td></td></tr>亜<tr><td>セレン酸ナトリウム</td><td>ΣS5261</td><td></td><td></td></tr><tr><td>卓上渦&nbsp;</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>トランスフェリン</td><td>Σ</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>T6146</td><td></td></tr></tbody></table>

前庭と聴覚の感覚器官の三次元切片培養

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

内耳の感覚器官は、実験操作と光学観測にその到達不能のための哺乳類の研究に挑戦しています。また、既存の培養技術は生化学的摂動ことは、これらのメソッドが、内耳感覚的な器官の開発中に機械的な力と組織剛性の効果を検討するための手段を提供しません。ここでそのままマウス卵形嚢とこれらの制限を克服して蝸牛の三次元培養法について述べる。ここで説明した三次元マトリックス剛性の調整法は、弾性組織の成長に反対の操作を許可します。このメソッドは、内耳開発中に機械的な力の役割を研究するため使用できます。さらに、文化は、利得と損失-の機能実験に使用することができますウイルス媒介性遺伝子配信を許可します。この培養法は、生来の有毛細胞を保持され、支持細胞し前庭と聴覚の感覚器官の伝統的な二次元文化を代替する可能性のある優れた役割を果たします。

胚の耳から前庭と聴覚の感覚器官はマイク低剛性萌芽期の条件11を模倣したゲル 40 Pa コラーゲン培養、比較的普通の三次元構造 (図 1) を保ち、有毛細胞を維持し、支持細胞 (図 2および図 3)。30% 以上減少する細胞密度をサポート (スチューデントのt検定: n = 4、 p &lt; 0.004) と有毛細胞密度減少 60% (スチューデントのt検定: n 5、 p = &lt; 0.0001) 小嚢の文化 (図 2 で 3 日後)、11時間の同じ期間に倍以上の黄斑部 (n = 3, p = 0.0002)。これは、ここで説明した三次元培養法に...

三次元切片培養マウス卵形嚢との蝸牛は光学的コラーゲン ゲル保持する生得的な組織形態の私をオフに、マトリックス剛性の調整により機械的刺激を可能にするおよびウイルス媒介性遺伝子配信を許可します。

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

この手順の全体的な目標は、マウスの前庭および聴覚感覚器官の三次元器官型培養を確立することです。この方法は、内耳感覚器官の発達における機械的な力と組織の硬さの役割は何かなど、内耳研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、前庭蝸牛の先天的な構造を大幅に保存し、内耳の発達中の分子的および機械的シグナル伝達の両方を研究できることです。Hudspeth博士と私が最初にこの方法のアイデアを得たのは、三次元培養が前庭器官の成長をin vitroで研究するための形態学的条件を提供できることに気付いたときでした。まず、70%エタノールを使用して、作業エリアと、5番の鉗子やヘアナイフなど、必要なすべての解剖器具を洗浄および消毒します。次に、滅菌メスの刃を使用して縦方向に切り込みを入れ、マウスの頭を2つに分割し、側頭骨を取り出します。氷上の60mmシャーレに15ミリリットルのHBSSバッファーを移し替えます。次に、細い5番の鉗子を2対使用して、内耳を側頭骨から分離します。次に、氷冷したHBSSバッファーを含む60ミリメートルのシャーレで一度に3〜4つの耳を移します。次に、内側を上にして耳を向けて、卵形嚢を見つけます。2対の5番鉗子を使用して、前庭器官を囲む軟骨を取り除きます。次に、前庭神経、卵形嚢と球形嚢の間の接続、および半規管を切断して、卵形嚢と付着した膨大部を耳から解放します。必要に応じて、余分な半規管をトリミングします。あるいは、2対の5番鉗子を使用して、聴覚器官を取り巻く軟骨組織を切除します。次に、蝸牛を分離します。次に、幅広の焦げ付き防止チップが取り付けられた200マイクロリットルのピペットを使用して、蝸牛と卵形嚢をDMEM/F12ベースの成長培地で満たされた30ミリメートルのシャーレに移します。次に、蝸牛と卵形嚢の準備物を組織培養インキュベーターに移し、摂氏37度で5%の二酸化炭素をガス化します。これは、内腔が封入された臓器培養を実現するためです。1.5ミリリットルの滅菌チューブに100マイクロリットルのコラーゲン1重合溶液を調製します。次に、チューブを氷の上に置きます。次に、蝸牛と卵形嚢の準備物を組織培養インキュベーターから取り出します。中和されたコラーゲン1溶液を準備します。これを行うには、100マイクロリットルの重合溶液を入れた冷やした1.5ミリリットルのチューブに、氷上で数回ピペッティングして、400マイクロリットルのコラーゲン1を追加します。中和されたコラーゲン1溶液500マイクロリットルを、10mmガラス底インサートを備えた冷やした30mmシャーレに移します。すぐに蝸牛または卵形嚢を中和されたコラーゲン1溶液に移し、幅の広い焦げ付き防止の先端が取り付けられた200マイクロリットルのピペットを使用します。滅菌ヘアナイフ、または細い鉗子を使用して、双眼解剖顕微鏡で臓器を希望の位置に調整します。完全な重合を確実にするために、ペトリ皿を摂氏37度で20分間インキュベートします。20分後、各ペトリ皿に0.5%のウシ胎児血清を補充した3ミリリットルの成長培地を追加します。.増殖培地を加えた後、37°Cで培養します。まず、氷上でウイルスを解凍します。次に、ウイルス懸濁液を0.5ミリリットルの円錐管内でトリパンブルー溶液と混合して、最終色素濃度を0.05%に調整しますトリパンブルー溶液を混合した後、ウイルス粒子を氷上に置きます。次に、双眼解剖顕微鏡を使用して、清潔で細かい鉗子を備えたマイクロピペットプーラーで準備したガラス針の先端の破損を観察します。まず、インキュベーターから感覚器培養物を取り出します。針をマイクロインジェクターに取り付けます。針に2〜3マイクロリットルの染料とウイルス混合物を入れます。針を感覚器官にセットしながら、双眼解剖顕微鏡を覗きます。針先を三次元卵形培養物の屋根の間葉層と上皮層を通して前進させ続けます。卵形嚢と膨大部の空洞が青色の染料で満たされるまで、ウイルス混合物を注入し続けます。次に、5%の二酸化炭素でガス化された摂氏37度の組織培養インキュベーターで臓器培養をインキュベートします。これらは、三次元コラーゲンワンゲルに埋め込まれた卵形嚢と蝸牛培養の光顕微鏡画像です。卵形嚢と蝸牛は、それぞれ17.5日齢と14.5日齢の胚から採取し、48時間培養します。これらの共焦点顕微鏡画像は、40PAコラーゲン1ゲルの摘出直前と直後の18.5日齢の胚性卵形嚢を示しています。培養で3日後、Myo7A陽性有毛細胞のほぼ80%が無傷のままです。卵子嚢培養では、3日後に支持細胞密度が30%以上減少し、有毛細胞密度が60%減少します。これらの共焦点顕微鏡画像は、40PAコラーゲン1ゲルの摘出の直前と直後の14.5日齢の胚の蝸牛を示しています。培養で3日後、Myo7AとSox2陽性の内有毛細胞と外有毛細胞は形態学的に区別でき、約4〜5列に組織化されています。ここでは、蝸牛の基部にある支持細胞と、胚の15.5日と17.5日の胚から得られた卵形室の三次元培養全体でのウイルス感染が成功したことを示しています。このビデオを見れば、無傷の内耳感覚器官を解剖する方法、卵形嚢と蝸牛の三次元培養を確立する方法、およびコラーゲン1型ゲルを培養する方法、およびそれらの三次元培養でウイルストランスフェクションを行う方法についてよく理解できるはずです。ウイルス粒子の取り扱いは、遺伝子貨物によっては危険な場合があることを忘れないでください。個人用保護具の着用や適切なウイルス処理などの予防措置を常に実践する必要があります。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

この手順では、スパイラル輪部とらせん神経節ニューロンの有無にかかわらず、コルチ器のマウス器官の単離および培養のための方法を説明します。我々はまた、エレクトロポレーションにより、コルチ植の器官における外因性レポーター遺伝子の発現のための方法を示しています。...

初代培養およびコルチのマウス臓器のプラスミドエレクトロ。

免疫組織化学と共焦点顕微鏡に続くコルチ器官を、切片ビブラトームの簡単な手順が説明されています。この手順では、コルチ器の哺乳類器官の微細な細胞構築の改良保全を可能にし、その結果、細胞の種類を正確に定量することができます。...

ビブラトームは、コルチ器の哺乳類器官の細胞構築の強化された保全のためセクショニング

このビデオは、内耳から螺旋神経節外植片を分離し、それらを多電極アレイ上でコルチ器官と共培養するプロセスを示しています。螺旋神経節は慎重に抽出され、より小さな組織切片または外植片に切片化されます。これらの外植片は、多電極アレイの活性領域で培養され、ニューロンプロセスの伸長を促進します。...

多電極アレイ上でのマウススパイラル神経節ニューロン外植片の培養

前庭有毛細胞機能の解析は頭蓋骨の最も困難な部分の奥深くの位置、側頭骨錐体によって複雑になる。最も機能有毛細胞研究は、急性単離された有毛細胞を使用している。ここでは、電気生理学的および二光子顕微鏡研究のためのマウス前庭上皮の半無傷の準備について説明します。...

電気生理学および高分解能二光子顕微鏡用マウス前庭感覚上皮の切り抜き半無傷準備

私たちは、ニューロンの応答プロファイルを研究し、刺激パラメータを最適化するために、多電極アレイ上で一次マウススパイラル神経節ニューロン外植片を培養するためのプロトコルを提示します。このような研究は、人工内耳のニューロン電極インターフェースを改善して、患者の聴覚とデバイスのエネルギー消費に利益をもたらすことを目的としています。...

マルチ電極アレイ上のらせん神経節ニューロン外植片培養と電気生理学

本研究では、共焦点顕微鏡を用いて、コルチの器官を含む人工内皮上皮を用いてex...

コルチの器官に向かう細胞の移動を探るインビトロタイムラプスライブセルイメージング

ひよこは、さまざまな研究のために費用効果が高く、アクセスしやすく、広く利用可能なモデル生物です。ここでは、鳥類の内耳の発達と再生の根底にある分子メカニズムを理解するための一連のプロトコルが詳述されています。...

鳥類の内耳の発達を研究するためのOvoおよびEx Ovoの方法

ここでは、内耳の前庭神経節および螺旋神経節ニューロンからの解剖、解離、培養、およびパッチクランプ記録の詳細な手順を提供する方法を示します。...

パッチクランプ記録のための新生児げっ歯類からの前庭およびらせん状神経節体細胞の分離と培養

現在のプロトコールは、以前のプロトコールを更新し、高品質の蝸牛外植片を培養するための比較的簡単なアプローチを取り入れています。これにより、生細胞および固定細胞における信頼性の高いデータ取得と高解像度イメージングが可能になります。このプロトコルは内耳の細胞を調査することの進行中の傾向を支える。...

In vitroモデルとしての新生児蝸牛外植片全体

ここでは、マウスから初代蝸牛有毛細胞を単離して培養するための詳細なプロトコルを紹介します。最初に、コルチの器官は、顕微鏡下で新生児(3〜5日齢)のマウス蝸牛から解剖されました。その後、細胞を酵素的に消化して単一細胞懸濁液とし、数日間培養した後に免疫蛍光法を用いて同定しました。...

新生仔マウスの初代蝸牛有毛細胞の単離と培養

ここでは、迷路切除術中に生理学的条件下でヒトの前庭末端器官を採取する技術と、免疫染色を用いたそれらの解析について述べる。...

迷路切除術中の生理学的条件下での前庭末端器官の収穫

学ぶ マウスの前庭と聴覚感覚器官の三次元オルガノタイプ培養法。コラーゲンIゲルを用いて組織構造を保持し、機械的刺激と遺伝子導入による内耳発生の分子・力学的シグナリング研究に応用できます。

前庭と聴覚の感覚器官の三次元切片培養

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