Name: イメージング フローサイトメトリーとトランスクリプトーム変質エンドサイトーシス CD1d の人身売買を評価するプロファイリングを統合します。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 学ぶイメージングフローサイトメトリーとトランスクリプトーム解析を統合した手法で、汚染物質に曝露したヒト樹状細胞のエンドサイトーシス機能とCD1dタンパク質の細胞内輸送変化を評価する方法です。

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著者はヒトの血液サンプルのロバート Giulitto (Hoxworth 血液センター) を感謝し、博士梁ニュウ遺伝子発現の正常化のための読み取り。また助成金サポートから、国立環境衛生研究所 (ES006096) に感謝し、環境遺伝学 (CEG) パイロット プロジェクト (件名標目等)、国立研究所のアレルギー ・感染症 (AI115358) のセンター (s. h.) の大学シンシナティ大学研究評議会賞 (件名標目等) は、大学のシンシナティ大学の医学コア強化資金 (X. Z)。

本研究では人間のプロトコルは、シンシナティ大学の制度上の審査委員会によって承認された、すべてのメソッドが関連するガイドラインと規則に従って行われました。健康なドナーから血液サンプルは、シンシナティ大学医療センターの Hoxworth の血液センターから得られました。
1. トランスクリプトームのひと単球由来の汚染物質にさらされた Dc のプロファイリング
<ol><li>BaP 公開 Dc の総 RNA の抽出<ol>
<li>サイトカインの GM-CSF と il-4 によるを使用して人間の Dc を区別し、4 日間13BaP に DCs を公開します。</li>
		<li>フローサイトメトリー (リネージュ-HLA+)、表面発現マーカーに基づいての大部分は、従来の DCs を使用して BaP 公開 Dc を並べ替える (CD11c+CD1c+)13。通常、10% を含む培養液中に 10,000 の Dc を並べ替える FBS、600 x g と 6 分の 4 ° C で Dc を遠心し、1 mL のピペット チップを使用して吸引により上清をすぐに削除します。</li>
		<li>上清を吸引により削除すると、RNA の抽出前に-80 ° C で保管するため RNA 分離キットから 0.4 mL の溶解/結合バッファーを追加することによって細胞ペレットを溶解させます。</li>
		<li>総 RNA の抽出のプロトコルと RNA 分離キットを使用して総 RNA14を抽出します。バイオアナライザー15を使用して RNA の整合性を測定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>並べ替えられた Dc (図 1 a) のトランスクリプトーム解析<ol>
<li>RNA シーケンス RNA ライブラリ作成キットを使用してライブラリを準備します。一言で言えば、隔離されたポリ A RNA のフラグメント (~ 200 bp)、逆、cDNA の第 1 ストランドにフラグメントを書き写すし、dUTP ラベルの付いた 2 番目の鎖 cDNA 合成によって従います。</li>
		<li>ビーズの浄化、終わり、修復や dA テーリング後茎ループ構造を持つアダプターに二重鎖 cDNA を縛る。鎖特異性を維持し、PCR のためアダプター ループを開きユーザー (ウラシル固有切除試薬) 酵素の cDNA とアダプターのループの第 2 鎖でウラシル残基を切除します。<ol>
<li>インデックス付きのライブラリを豊かにする普遍的なインデックス固有のプライマーを用いた PCR の 13 のサイクルを実行します。ライブラリをクリーンアップし、ライブラリの品質をチェックし、サイズ分布バイオアナライザー DNA 高感度チップで実行します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ライブラリ定量キットを使用して、リアルタイム PCR システムはライブラリ濃度で計算するライブラリ サイズ情報と標準曲線法を組み合わせます。</li>
		<li>比例して個別にインデックスの互換性ライブラリをプールし、15 に最終濃度を調整する午後。ライブラリ クラスター生成を実行し、サンプルあたり 2500 万読み取りを生成する単一の読み込みを 1 x 50 bp の設定でライブラリをシーケンスします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>シーケンス<ol>
<li>順序とそれぞれ SBS と PE の試薬ラックに試薬をインデックスを読み込みます。すべての氷が溶けるまで 1 h の研究室グレードの水風呂で試薬を配置し、各ボトル/チューブの試薬は適切に混合します。</li>
		<li>ボトルに解凍の染料、-20 ° C の酵素を追加することによって ICB ミックスを準備し、ミックスします。シーケンスに従って NaOH 溶液を準備します。使用する準備ができるまで、4 ° C ですべての試薬を配置します。</li>
		<li>1 h の間に待機期間、シーケンサーの電源を入れます。DONOTEJECT ドライブが表示され、コンピューターをネットワーク ドライブに接続を待ちます。</li>
		<li>シーケンサー制御ソフトウェアを起動します。</li>
		<li>0.5% Tween 20 と 0.03% を含むメンテナンス洗浄ソリューションの 2 L ProClin 300 の研究室グレードの水を準備します。</li>
		<li>SBS 試薬ラック 8 ボトルとボトルに漏斗のネジキャップのそれぞれに 〜 100 mL のメンテナンス洗浄溶液を追加します。PE 試薬ラックで 10 15 mL の円錐管のそれぞれにメンテナンス洗浄液 〜 12 mL を追加し、キャップを破棄します。</li>
		<li>シーケンサーにいっぱいソリューション ボトル/チューブと 2 つのラックをロードします。</li>
		<li>シーケンサー制御ソフトウェアから選択メンテナンス洗浄;プロセスが完了するまで、シーケンサーの流体システムをきれいにする画面の指示に従います。</li>
		<li>ソフトウェアから「シーケンス」タブで新しい実行を開始ネットワーク ドライブへの出力データを直接します。多重単一インデックス ライブラリを単一の読み込みを 1 x 50 bp のパラメーターを選択します。</li>
		<li>シーケンスの状態をコンピューターまたはスマート フォンで遠隔監視できますので、必要に応じて、BaseSpace シーケンス ハブにログインします。</li>
		<li>逆多重化のサンプル シートをアップロードし、ソフトウェア要件に従って試薬情報を提供します。</li>
		<li>シーケンサーに SBS PE 試薬をロードします。プライム使用フロー セル (~ 15 分) システム。</li>
		<li>クラスター生成が完了した後 (~4.5 h)、フロー ・ セルを取り出し、水とワイプ乾燥レンズ ペーパーを使用してフロー ・ セルを軽くスプレーします。軽く 95% エタノールのフロー ・ セルをスプレーし、拭き。表面が破片や残留のないクリーンであることを確認するライトをチェックします。</li>
		<li>総理のステップを完了すると、クラスター化のフロー ・ セルを読み込み、シーケンスを開始します。シーケンス解析ビューアー ソフトウェアは自動的に開始されます。</li>
		<li>SAV の遺産相/前期 %、% ≥Q30 クラスター パス フィルター % 読み取りフィルター クラスター密度を含むインデックスの QC、これにより、データの品質を理解し、トラブルシューティング等を介してシーケンス データの品質を監視します。</li>
		<li>フロー電池ガスケットを変更し、シーケンスの完了後にメンテナンス洗浄を実行します。シーケンサーは次の実行を準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>バイオ情報解析<ol>
<li>バイオインフォマティクス RNA シーケンス データ解析13を実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 トランスクリプトームのプロファイル (図 1 b) の経路解析
<ol><li>3 ドナーから BaP 曝露し、非曝露の Dc 間結果遺伝子発現強度カウントを比較するのに、エッジャー Bioconductor を使用します。絶対フォールドの変更に基づいて BaP 曝露し、非曝露の Dc 間特異的発現遺伝子を確認 (> 2 倍) と虚偽の発見率 (FDR) - 調整p- 値 (< 0.05)。</li>
	<li>差動機能群を予測する遺伝子を表現、KEGG と REACTOME を含むいくつかのデータベースに対して変更された遺伝子を検索し、クラスタ リング データを生成する ToppCluster ソフトウェア パッケージを使用します。ToppCluster は、超幾何テストを使って遺伝子リスト濃縮分析16を介して豊かな機能を取得します。</li>
	<li>Cytoscape17,18バージョン 3.3.0、複雑なネットワークを可視化するため広く使用されているオープン ソース ソフトウェア プラットフォームにこれら関数クラスターから結果をさらに入力します。したがって、異なるクラスターまたは経路、エンドサイトーシス クラスター、脂質代謝などに関与する遺伝子は、遺伝子 (図 1 b) 式13の平均フォールドの変更の色アノテーションを使用したネットワークに表示されます。</li>
</ol>3. CD1d と Lamp1 共存のフローサイトメトリーのイメージング
<ol><li>BaP 公開 Dc の抗体の分類<ol>
<li>完全なダルベッコの 2 mL で 37 ° C で 4 日間の 5.94 mm BaP 公開 0.5 x 106人間 Dc 変更イーグル培地。収穫は、Dc 細胞血清ブロッカー、抗ひと Fc 受容体抗体抗ひと CD64、CD32、CD16 抗体を含む氷で 10 分間インキュベートし、差別化された Dc を 400 x g で 10 分間ブロックでの遠心分離。</li>
		<li>鮮やかなバイオレット 421-対策-CD1c (L161) 孵化させなさい、フィコエ リスリン/シアニン染料 7 (PE/Cy7) - 抗 HLA-DR、および PE/Cy5-抗 CD11c 氷で 20 分間の Dc と。表 1は、この抗体の一覧を示します。</li>
		<li>PBS で 4% パラホルムアルデヒドで Dc を固定し、透過洗浄バッファーとそれらを permeabilize します。(51.1) PE 標識精製された抗ひと CD1d の混合物と Alexa Fluor 647 標識抗 Lamp1 (CD107a) 細胞内染色を実行 (H4A3)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>流れの cytometry の測定 (図 2) をイメージング<ol>
<li>シンシナティ小児病院 40 × 対物を使用して直径の約 10 mm のセルの 300 ピクセルを生成するための流れの cytometry コアでイメージング フローサイトを使用して染色サンプルを分析します。1 つのピクセル サイズは、オブジェクトの 0.5 mm で約 0.5 mm です。</li>
		<li>製造元の指示に従って公平な方法で 10,000 細胞画像を取得します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4 流れの Cytometry のイメージのイメージング解析
<ol><li>アイデア ソフトウェア (図 2) を使用して共局在解析<ol>
<li>ルーチンの流れ cytometry データのように、BaP 蛍光染色 BaP 公開 Dc を含む、しきい値以下の非染色サンプルの蛍光強度を設定することにより単一ステンド グラス対非染色サンプルの補正を行う解析。</li>
		<li>+CD1d HLA-DR+CD11c のサブセットを取得する細胞を染色ゲート+Lamp1+細胞 (図 2 a) と (図 2 b) ゲートのサブセットの表示細胞画像。</li>
		<li>Png 形式 2 の技術基準に基づく強力な共同染色信号の視覚的な存在や ImageJ フィジー (図 2 b) を使用して共局在解析の CD1d と Lamp1 タンパク質細胞内局在の細胞画像を保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ImageJ フィジーのソフトウェアを使用すると、共局在解析 (図 3) を実行できます。<ol>
<li>それぞれ人間 dc の非曝露し、BaP 公開 100 保存した携帯画像をマージすることで入力画像ファイルを準備 (図 3 a)。</li>
		<li>CD1d の分析 (赤) と Lamp1 (緑) の共存、散布図を使用します。<ol>
<li>ImageJ フィジー プログラムを実行します。100 セル画像 (図 3 bおよび図 4 a) で .png ファイルを開き: "ファイル |オープン"。</li>
			<li>赤または緑のチャネルのいずれか 2 つの画像に結合の赤と緑のチャンネル イメージを分割: "画像 |カラー |チャンネルを分割"。</li>
			<li>コマンドを使用して散布図を描く」分析 |共存に関する研究 |共存のしきい値"。「PrintScreen」キーを使用して散布図を保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>各単一細胞イメージのマンダーの共存係数を計算 (n = 100) (図 4 b)<ol>
<li>使用してチャンネルの分割と画像ファイルを 1 つのセル画像を選択、"楕円形"選択ツール。</li>
			<li>コマンドを使用して、"分析 |共存に関する研究 |共存のしきい値"。領域 (ROI) のダイアログ ボックスから「チャンネル 1」を選択します。各セルのイメージの「マンダーのしきい値を用いた」を含むすべての計算オプションを維持します。</li>
			<li>100 セルのすべての画像にこの計算を繰り返します。</li>
			<li>保存し、スプレッドシートを使用して結果を開きます。</li>
			<li>平均と標準誤差」どちらられる Mander の係数」のプロット (n = 100、0 を意味なし共局在 1 完璧な共存)。スチューデントの t 検定を使用して、BaP 曝露し、非曝露グループ (図 4 b) 比較のp値を計算します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>複数のセル画像の CD1d と Lamp1 共局在のどちらられるピクセル強度のパーセントを計算 (n = 100) (図 4)。<ol>
<li>4.2.3 で同じ解析プロトコルを使用し、さらに結果オプション「, しきい値を超える強度 %」を選択します。</li>
			<li>マンダーの共存係数と一緒にこの分析を実行します。</li>
			<li>同様に平均と CD1d と Lamp1, % 強度の標準誤差をプロットします。スチューデントの t 検定を使用して、BaP 曝露し、非曝露グループ (図 4) 比較のp値を計算します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者がある何も開示するには

複数の経路と個々 と個体群の細胞活動を統合する難しさを含む広く影響を受けた遺伝子発現のため、変更された遺伝子経路の機能確認は困難です。特にテスト CD1d エンドサイトーシスのコンパートメントに人身売買にイメージング フローサイトメトリーを採用しました。フローサイトメトリーをイメージングには、細胞の変化の測定、複数のタンパク質の細胞内局在の共存の個別デモンストレーションが統合されています。共焦点顕微鏡測定蛋白質の共存、高解像度を提供している以前とフローサイトメトリーは、異なる細胞集団の包括的な表現を提供することができます。共焦点顕微鏡やフローサイトメトリーを環境によってトランスクリプトーム変質の機能確認のため知名度の高い方法で蛋白質の共存を分析する許容画像解像度の利点を組み合わせたフローサイトメトリーをイメージング汚染物質。
いついてスケールで複数のタンパク質の共局在の解析は技術的に難しく、(i) 複数の個々 の細胞の解析の詳細なので、手間と比較的バイアス;(ii) 強度または肯定的な汚損; の領域に基づいてオーバー ラップするピクセルを解釈するための最適なしきい値を定義することは...

抗原提示は通常多くの場合形態的特性と抗原提示細胞1,2,3 の表現型プロファイリングを使用して検討されているが、人身売買、細胞内のタンパク質を含む.イメージングと表現方法の利点を統合するには、単一のセルでひと樹状細胞 (Dc) で変更されたタンパク質の共局在を示す人口レベルのイメージング解析プラットフォームをについて説明します。ペプチド抗原提示で主要組織適合複合体 (MHC) クラス I の分子従来 CD8 をアクティブにする小胞体の短いペプチド (8-10 残基) をバインド+ T 細胞、MHC クラス II 分子結合比較的長い間従来の CD4 をアクティブにエンドサイトーシスのコンパートメントにおけるペプチド (~ 20 残基)+ T 細胞1,4。対照的に、脂質特異的 T 細胞はエンドサイトーシス コンパートメント5,6を中心に読み込まれる脂質抗原と CD1 の蛋白質によってアクティブ化されます。脂質抗原提示が脂質代謝脂質代謝7,8,9,10と CD1 の蛋白質代謝産物の機能性脂質のロードの物の供給を必要とします。エンドサイトーシス コンパートメント5,6。この文脈では、脂質抗原提示、特に脂溶性の汚染物質と免疫疾患の環境の露出の調節細胞要因を定義する重要です。本研究では汚染物質の暴露で脂質抗原提示に貢献してエンドサイトーシス蛋白質の売買を決定するためのトランスクリプトーム解析、イメージ プロファイル、およびひと単球由来の Dc の細胞および個体群のイメージング解析を使いました。確かに、この組み合わせのプラットフォームは、細胞内の蛋白質の売買と異なる生物学的プロセスの共存を勉強に適用できます。
技術的には、共焦点顕微鏡を用いて、統計的に検出された細胞1,2,3,11の限られた数の分析、蛋白質の細胞レベル下のローカリゼーション通常示されました。また、フローサイトメトリーは広く細胞レベル12; 複数のタンパク質の共同染色信号ゲート細胞集団に適用されています。しかし、これは細胞内の蛋白質の共存の詳細な可視化を欠いています。生物的蛋白質ハラーゼの機能を決定するためのプロファイルと分析アプローチをイメージングを取り入れる割合タンパク質共存携帯および人口レベルでの包括的かつ統計的分析を達成するために関連性。CD1d およびリソソーム膜蛋白質 1 (Lamp1) の共存を検出するイメージング フローサイトメトリーを用いて具体的には、本研究ではタンパク質。コードして, 分子の定量解析が難しかった以前いついての規模で演奏されます。本研究で我々 はいついて、個々 の細胞レベルで共同染色細胞数が多いタンパク質ハラーゼの割合を調べるための ImageJ フィジー プログラムを適応しました。具体的には、CD1d タンパク質が、親油性の汚染物質ベンゾ [a] ピレン (BaP)13 にさらされる人間の Dc の後半のエンドサイトーシス コンパートメントで保持された主結論を支持する人口サイズ、強度、共局在領域を測定しました。.この複合携帯と画像解析の人口抑制脂質抗原提示に関連する CD1d Lamp1 共存の再現性の高い、包括的、かつ統計的に有意な結果を提供しました。
BaP 公開人間 Dc のトランスクリプトームは強くエンドサイトーシス脂質代謝と CD1d エンドサイトーシス人身売買された BaP 露出で損なわれること仮説をサポートしました。この仮説をテストするため CD1d、エンドサイトーシスのマーカー、および DC マーカーを含む複数のタンパク質を染色共同 DC 人口の画像をプロフィールにイメージング フローサイトメトリーを適用されます。最後に、共同染色細胞は強度の割合と CD1d と Lamp1 共存のエリアを示す統計的に分析しました。

<table><tbody><tr><td>トランスクリプトミクス</td><td>Illumina</td><td>HiSeq 2500 v4</td><td>Illumina HiSeq システム</td></tr><tr><td>イメージングStream X</td><td>Millipore</td><td>100220</td><td>イメージング フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>mirVana miRNA Isolation Kit</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td>トータルRNA抽出</td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td><td>アジレント</td><td></td><td>トータルRNA QC分析</td></tr><tr><td>Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>PCR, enzyme reaction</td></tr><tr><td>NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td></td><td>PolyA RNA精製</td></tr><tr><td>自動SMARTerアポロシステム</td><td>タカラ</td><td></td><td>PolyA RNA精製</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra RNAライブラリ イルミナ用準備キット</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td></td><td>ライブラリの準備</td></tr><tr><td>アジャンコートAMPure XP磁気ビーズ</td><td>ベックマン・コールターDNA</td><td></td><td>精製&nbsp;</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>Library QC、サイズ分布分析</td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent</td><td></td><td>Library QC、サイズ分布分析</td></tr><tr><td>QuantStudio 5 リアルタイム PCR システム (Thermo Fisher)</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Library 定量</td></tr><tr><td>NEBNext Library Quant Kit</td><td>New England Biolab</td><td></td><td>Library 定量</td></tr><tr><td>cBot</td><td>Illumina</td><td></td><td>ライブラリ クラスター生成</td></tr><tr><td>TruSeq SR クラスター キット v3 - cBot &ndash;HS</td><td>Illumina</td><td></td><td>Library cluster generation</td></tr><tr><td>HiSeq 1000</td><td>Illumina</td><td></td><td>Sequencing</td></tr><tr><td>TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles)</td><td>Illumina</td><td></td><td>Sequencing</td></tr><tr><td>Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7)</td><td>Bio Legend</td><td>L243</td><td></td></tr><tr><td>Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5)</td><td>Bio Legend</td><td>3.9</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant violet 421</td><td>Bioレジェンド</td><td>L161</td><td></td></tr><tr><td>PE 抗マウス IgG2b</td><td>バイオレジェンド</td><td>51.1</td><td></td></tr><tr><td>アレクサ フルーア 647 (AF647)</td><td>バイオレジェンド</td><td>CD107a(H4A3)</td><td></td></tr></tbody></table>

イメージング フローサイトメトリーとトランスクリプトーム変質エンドサイトーシス cd1d の人身売買を評価するプロファイリングを統合します。

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

エンドサイトーシスの蛋白質の形態学的、機能的変化の個体群解析いついてレベルで単一細胞レベルで統計画像解析画像キャプチャの需要のために挑戦しています。この困難を克服するためとを使ってイメージング フローサイトメトリー トランスクリプトーム (RNA シーケンス) をプロファイリング分化 1 d タンパク質 (CD1d) のクラスターの関連付けられている細胞内局在性変化を決定する人間の障害エンドサイトーシス遺伝子発現と脂溶性の共通にさらされた樹状細胞 (Dc)、空気汚染物質ベンゾ ピレン []。CD1d とフローサイトメトリーをイメージングを用いた細胞画像の数千からエンドサイトーシス マーカー Lamp1 蛋白質の共存は、アイデアや ImageJ フィジーを用いて解析したプログラム。共同染色 CD1d と Lamp1 蛋白質と多数の携帯電話画像 CD1d のゲーティング後, 可視化された+Lamp1+の Dc のアイデアを使用しています。BaP 露出マンダーの共局在の強度係数テストどちらられる散布図を使用して、プロットに示されたさらに強化された CD1d と Lamp1 の共存は、ImageJ フィジーを用いた共局在の面積の割合に基づいています。私たちのデータが汚染物質にさらされた人間のトランスクリプトーム変質の障害の機能的予後をサポート、シングル、いついての細胞レベルでのタンパク質共存を測定する有利なインストゥルメンタルとバイオ情報アプローチを提供します。Dc。

脂溶性の汚染物質 BaP 変更各ドナーから人間人間 dc 単球由来 dcs エンドサイトーシス遺伝子群 (n = 3)、さらに前述の RNA 抽出とトランスクリプトーム解析に使用された従来の Dc の bap が培養され.遺伝子発現の正常化に BaP 公開し、非曝露群の間の変えられた遺伝子は、発現遺伝子の機能的相関によるとクラスター化されました。関連の携帯電話経路の解析のための Toppcluster プログラム16に変更された遺伝子リストを入力を行い、検定のp値 (図 1 b) の偽の発見率 (FDR) 補正を使用しています。脂質代謝とエンドサイトーシスの機能を含むいくつかの主要な変更された遺伝子クラスターは、BaP 公開 Dc で識別されました。本研究で具体的に着目エンドサイトーシス人身売買の機能テスト CD1 を介した抗原提示はエンドサイトーシス経路5,<sup class...

フローサイトメトリーをイメージング細胞個々 および地方レベルでの形態学的、機能的変化を検出するための理想的なアプローチを提供します。中断エンドサイトーシス汚染物質にさらされたひと樹状細胞における脂質抗原提示機能を遺伝子発現と蛋白質の売買の形態のデモの複合トランスクリプトームのプロファイルを示した。

イメージング フローサイトメトリーとトランスクリプトーム変質エンドサイトーシス CD1d の人身売買を評価するプロファイリングを統合します。

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

これらの方法は、次世代シーケンシングとフローサイトメトリーイメージング解析を統合します。これは、特に汚染物質暴露環境において、トランスクリプトームの代わりに、いくつかの表記の変化が含まれているかどうかのような興味深い質問に答えるのに役立ちます。この単純な方法の主な利点は、生物学的に重要なタンパク質の共局在化を測定し、主要な遺伝子発現の結果を機能レベルで解釈できることです。この技術の意味は、病理学的および毒物学的結果の診断に及ぶ。通常のイメージャーアプローチとして、forseeは、遺伝子発現をタンパク質機能に接続する能力を有する。一般的に、この方法に新しい個人は、イメージングおよびトランスクリプト分析の高い技術的要求のために苦労します。ヒト単球由来樹状細胞ライブラリーを配列するには、まずシーケンシング合成試薬およびインデックス用試薬ラックにシーケンシングおよびインデックス化試薬を積み込み、すべての氷が溶けるまで1時間、実験室グレードの水浴にラックを入れ、試薬を完全に混合します。試薬が解凍されている間、シーケンサの電源を入れ、取り出す操作のドライブが表示されたらコンピュータをネットワークドライブに接続し、シーケンサ制御ソフトウェアを起動します。次に、シーケンシング生合成試薬ラックの各ボトルに約100ミリリットルのメンテナンス洗浄液を加え、各ボトルに漏斗キャップをねじ込みます。約12ミリリットルのメンテナンス洗浄液を、インデックス用試薬ラックの15ミリリットル円錐形チューブに加え、キャップを廃棄します。次に、両方のラックをシーケンサーに積み込みます。シーケンサ制御ソフトウェアで「メンテナンスウォッシュ」を選択し、シーケンサ流体システムのクリーニング手順に従います。フラッシュライトを使用して、フローセルの車線を通過する気泡を視覚的に検査し、漏れがないことを確認します。ウォッシュシーケンスが終了したら、[シーケンス]タブを開き、新しい実行を開始して、出力データをネットワークドライブに送ります。デマルチプレクシング用のサンプルシートをアップロードし、適切な試薬情報を入力します。使用フローセルを使用して、シーケンシング試薬を使用してシステムをプライミングします。クラスターの生成が完了したら、フロー セルを削除します。そして、軽く水で細胞をスプレー.フローセルをレンズペーパーで拭き、続いて95%エタノールの軽いスプレーを吹き付けます。フローセルを再び乾かした後、フローセルの表面を光に照らしてチェックし、残骸や塩残渣がなくても清潔であることを確認します。プライムステップが終了したら、クラスター化されたフローセルをロードし、シーケンスを開始します。シーケンス解析ビューアソフトウェアが自動的に起動します。約26時間後、高シーケンス制御ソフトウェアを介してシーケンシングデータ品質を監視し、シーケンシング分析ビューソフトウェアを使用してデータ品質を評価し、トラブルシューティングを行います。そして、シーケンスが終了したら、フローセルガスケットを変更し、次の実行を開始する前にメンテナンス洗浄を行う。汚染物質曝露樹状細胞のフローサイトメトリックイメージング後、ImageJ Fijiを開き、非暴露および汚染物質にさらされたヒト樹状細胞サンプル群の保存された100個の保存された細胞画像を、治療群に従って個々のファイルにマージする。CD1d と 2 つの集団内の Lamp1 の共局在化を分析するには、汚染物質にさらされた 100 個の結合セルイメージを開き、[画像]、[色]、[スプリット チャネル] を選択して、画像をチャンネルごとに 1 つのフルオロフォアで 2 つの個別の画像に分割します。共局化されたピクセルの散布図を作成するには、[分析]、[共局化]、[共局化のしきい値] を選択し、[印刷画面] を押して散布図を保存します。単一セルラー画像ごとに Mander の共局在係数を計算するには、楕円選択ツールを使用して、分割チャネルを含むイメージ ファイル上の単一セル画像を選択し、分析、共局在化、および共局在化のしきい値を再度選択します。次に、対象地域のダイアログ ボックスから [チャンネル 1] を選択し、[OK] をクリックします。100 個のセルイメージすべてに対して係数が計算されたら、結果を適切なスプレッドシートにインポートし、コントロールの非公開セル サンプルの分析を繰り返します。RNAシーケンシングおよび転写データ解析を用いて、汚染物質暴露DCにおいて脂質代謝および内視鏡機能を含むいくつかの主要な遺伝子クラスターが同定された。個々の細胞画像レベルでは、HLADR陽性CD11c陽性樹状細胞は、CD1dおよびLamp1共発現に従ってゲートすることができる。コントロール非露出樹状細胞は、CD1dおよびLamp1タンパク質共局在化を最小限に抑え、CD1dの内視鏡的人身売買の基底レベル、および生理学的条件下での高レベルの表面発現を示す。CD1dは汚染物質曝露樹状細胞の後期内視鏡区画に保持されているのに対し、この実験細胞集団における変化した内視鏡遺伝子プロファイルを確認する。個々の細胞画像を単一の画像ファイルにマージした後、個々の画像をフルオロフォアの発現に従って分割することができ、2つのチャンネル間のピクセル強度の共局在化を散布図で視覚化することができます。2つの処理グループにおけるCD1dとLamp1タンパク質の共局在化の程度は、マンダーの係数を使用して定量化することができます。タンパク質の強度が共局領域と非共局領域の間で不均一である場合、共局化された強度は共局領域と平行ではないため、ピクセル強度に基づいて2つのタンパク質の共局在化をさらに評価することも重要である。一度マスターすると、画像解析は2時間で完了し、RNAシーケンシングのセットアップは、各技術が適切に実行されれば、3時間で完了することができます。この手順を試みる際には、すべての試薬が正しい位置に正しくロードされ、シーケンサーに漏れがないように注意することが重要です。この手順に従って、マイクロRNA、エキソーム、またはマスト細胞シーケンシングのような他の方法を、それぞれ、グローバルなマイクロRNA発現、遺伝子変異、またはDNAメチル化に関する追加の質問に答えるために実行することができる。開発後、この技術は、細胞イメージング分析の分野の研究者と、遺伝子発現およびタンパク質機能に対する環境汚染物質の影響を探求する次世代シーケンシングの研究に役立ちます。このビデオを見た後、次世代シーケンシングの設定方法とタンパク質共局在のイメージャー分析についてよく理解する必要があります。人間の血液サンプル中の有毒な汚染物質化学物質を使用すると、非常に危険な場合があることを忘れないでください。これらの手順を実行する際には、化学発煙フードや個人用保護具の使用などの注意事項を必ず考慮してください。

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