によるエクソン介在物評価スプライスの SMA 患者の繊維芽細胞でスイッチング アンチセンスオリゴヌクレオチド
2018年5月11日
エクソン インクルー ジョン (スプライス変調) を誘導し、脊髄性筋萎縮症 (SMA) の召式を救出様々 なアンチセンスオリゴヌクレオチド (AONs) が示されています。ここでは、エーオン lipotransfection エクソン包含SMN2遺伝子の SMA 患者の繊維芽細胞の有効性を判断する評価方法を誘導するためのプロトコルについて述べる。
このリポトランスフェクションプロトコルの全体的な目標は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に導入し、SMA細胞のエクソン封入に対するこれらの薬物の有効性を評価することです。この方法は、アンチセンス療法分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、患者に治療を提供するための新しいアンチセンスオリゴの有効性。
この手法の主な利点は、さまざまなアンチセンスオリゴヌクレオチド化学の試験に十分な速さ、容易さ、感度を備えていることです。この方法は、アンチセンスオリゴの線維芽細胞へのトランスフェクションに使用できますが、初代筋芽細胞や他のさまざまな細胞株など、他の細胞タイプにも適用できます。手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるAleksです。
まず、LNA/DNA混合剤の10マイクロモル溶液を氷上で解凍します。血清欠乏培地中の混合液を1.5ミリリットルチューブ内で必要な濃度に希釈します。次に、トランスフェクション試薬を希釈し、希釈したトランスフェクション試薬を1対1の比率でミックスマーに加えます。
トランスフェクションを行っている間、細胞の密度が約65〜80%であることが重要です。コンフルエント度が80%を超えると、トランスフェクション効率が低下します。次に、トランスフェクション試薬混合物を室温で10分間インキュベートします。
10分後、5%ウシ胎児血清を含む900マイクロリットルの血清欠乏培地をチューブにピペットで移します。トランスフェクション試薬やLNA/DNAミックスマーとのインキュベーション前にFBSを添加すると、トランスフェクション効率にも影響するため、添加しないでください。次に、培養プレートから古い培地を吸引します。
次に、LNA/DNA混合剤を含む培地1ミリリットルを培養プレートに加えます。次に、プレートを摂氏37度のインキュベーターに24〜48時間放置します。インキュベーション後、培養プレートから培地を吸引します。
次に、1ミリリットルのGPC試薬を細胞にピペットで移します。次に、GPC試薬でウェルを数回洗浄します。数回洗浄した後、細胞を1.5ミリリットルのチューブに集め、サンプルを氷上に保ちます。
次に、チューブを高速で30秒間ボルテックスします。その後、チューブをマイナス80°Cで1時間保管します。次に、サンプルを室温で解凍し、すばやくボルテックスします。
次に、200マイクロリットルのクロロホルムをサンプルに加え、15秒間激しく振とうします。次に、チューブを室温で3分間インキュベートします。3分後、サンプルを12, 000gで摂氏4度で15分間遠心分離します。
遠心分離が終了したら、遠心チューブの上部から水相を回収します。次に、水相を新しいチューブに移します。次に、500マイクロリットルのイソプロパノールと、RNAグレードのグリコーゲンのマイクロリットルあたり8マイクログラムの1マイクロリットルを水相に加えます。
サンプルを10秒間すばやくボルテックスし、室温で10分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを12, 000gで摂氏4度で10分間遠心分離します。ランが終了したら、上清をデカントします。
1ミリリットルの冷たい75%エタノールを加え、短時間ボルテックスして得られたペレットを洗浄します。再度、サンプルを7500 gで摂氏4度で5分間遠心分離します。次に、すべてのエタノールを排出し、ペレットを室温で乾燥させます。
ペレットが乾いたら、30マイクロリットルのDNAse / RNAseフリー水に溶かします。次に、サンプルを摂氏60度で10分間インキュベートします。次に、分光光度計で260ナノメートルのRNAの濃度を読み取り、マイクロリットルあたり15ナノグラムに調整します。
RT-PCRマスターミックスを構成するには、2つのX RT-PCR反応バッファー、1ステップRT-PCR酵素ミックス、フォワードプライマーとリバースプライマー、およびRNAse/DNAseフリー蒸留水を追加します。マスターミックスを0.2mmのPCRチューブに分配し、各サンプルのトータルRNAを添加します。その後、PCR反応を開始します。
RT-PCRが完了したら、増幅した製品に5マイクロリットルの6つのXローディング色素を加えます。次に、混合物の5マイクロリットルを2%アガロースゲルにロードします。電気泳動ユニットを100ボルトで40分間始動します。
まず、さまざまな混合剤の効率が研究されます。これを行うために、ミクサーをトランスフェクトしたSMA線維芽細胞におけるSMN2エクソン7およびGAPDHレベルの包含を分析します。ゲル画像は、上部と下部のバンドがSMN2 RNAの包含と除外されたエクソン7を表しているエクソン7の包含を示しています。
また、インクルージョン効率は、ミックスマー1〜5でトランスフェクションした場合、78〜98%と定量化されています。一方、ミクマー6〜8を使用して患者のSMA線維芽細胞をトランスフェクションした場合、対照と比較して有意な結果は得られません。実験では、GAPDHをコントロールとして用います。
次に、GAPDHと比較して全長SMN2の相対的発現を解析するために、定量的PCRを行います。SMN2転写産物レベルの量の急激な増加は、コントロールと比較して、ミックスマー1〜3および5番でトランスフェクションすると観察されます。SMNタンパク質の発現レベルも研究されており、これは、mixmer 1〜5をトランスフェクトした患者の線維芽細胞におけるSMNタンパク質の発現レベルの増加を示しています。
SMNタンパク質レベルの急激な1.5倍から1.9倍の増加が観察されます。ここで、使用されるコントロールは cofilin です。それどころか、ミクマー6〜8はSMNタンパク質の発現レベルを変化させません。
このビデオを見れば、アンチセンスオリゴを線維芽細胞にトランスフェクションする方法と、in vitroでの有効性を評価する方法について十分に理解できるはずです。
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概要
本記事では、脊髄性筋萎縮症（SMA）の治療を目的として、SMN2遺伝子のエキソン包含を誘導するためにアンチセンスオリゴヌクレオチド（AONs）を細胞内に導入するリポトランスフェクションプロトコルを紹介します。本手法の有効性は、SMA患者由来の線維芽細胞を用いて評価しています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 遺伝学
- 細胞生物学
背景
- 脊髄性筋萎縮症（SMA）は、運動ニューロンに影響を及ぼす遺伝性疾患です。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドは、スプライシングを調節し、SMNの発現を回復させることができます。
- AONの効果的なデリバリー手法は、治療への応用において極めて重要です。
- 本プロトコルでは、さまざまなAON化学修飾の試験が可能です。
研究目的
- SMA細胞にAONを効果的に導入すること。
- エキソン組み込みを誘導するAONの有効性を評価すること。
- AONを試験するための迅速かつ高感度な手法を提供すること。
使用された手法
- 線維芽細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドのリポトランスフェクション。
- SMN2遺伝子におけるエキソン包含の評価。
- 初代筋芽細胞を含むさまざまな細胞型への本手法の適用。
- 実験技術者による手順の実演。
主な結果
- リポトランスフェクション法は、AONの導入に有効である。
- SMN2遺伝子におけるエキソン包含の誘導に成功した。
- 本プロトコルは、異なる細胞種に適応させることが可能である。
- 得られた結果は、SMAの治療法としてのAONの可能性を支持するものである。
結論
- このリポフェクションプロトコルは、アンチセンス療法の研究における有用なツールとなります。
- これにより、SMA細胞におけるAONの有効性を迅速に検証することが可能になります。
- 今後の研究では、この手法を拡張して新しいAONの探索を行うことができます。
よくある質問
業界における重要性
本プロトコールは、患者由来線維芽細胞において、アンチセンスオリゴヌクレオチド（AON）によるSMN2エキソン包含誘導の有効性を、迅速かつ高感度に評価することを可能にし、スプライシング調節療法の初期段階におけるターゲットバリデーションおよびリード化合物の同定を支援します。低濃度のAONでのエキソン包含およびタンパク質回復量を定量化することで、より高い力価と低毒性プロファイルを持つ候補化合物を優先的に選択するための予測的な信頼性を提供します。本手法は、細胞種や化学構造に対する適応性が高く、SMA創薬パイプラインにおける前臨床段階でのリスク低減とトランスレーショナルな連続性を促進します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：SMN2エクソン7の組み込み効率をターゲット結合の機能的なリードアウトとして測定することにより、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用上の価値：RT-PCRおよびqPCRを用いてエクソン組み込み量と転写産物量を定量化し、ターゲット検証のための再現性のある定量的なアウトプットを提供する。
- 予測的価値：ウェスタンブロットによる用量依存的なSMNタンパク質の回復を実証し、AON候補化合物のメカニズム的なリスク低減およびポートフォリオの選別を支援する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイの準備：LNA/DNAミックスマーを含む多様なAON化学構造の高スループット試験に適した、リポトランスフェクションベースのワークフローを確立します。
- 再現性：トランスフェクション条件（コンフルエンシー 65–80%、試薬比率）およびGAPDHとコフィリンコントロールによる標準化を規定し、実験間の整合性を確保します。
- 拡張性：初代筋芽細胞やその他の細胞株との互換性があり、疾患関連モデルにわたるプラットフォームの再利用が可能です。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性：SMA患者由来線維芽細胞を使用することで、遺伝的および表現型的な忠実性を維持し、AONスクリーニングデータのトランスレーショナルな妥当性を高めています。
- 前臨床段階の連続性：エキソン含有とSMNタンパク質発現を関連付けることで、分子標的の調節から機能的な表現型の救済へと至るメカニズム的な橋渡しを提供します。
- リスク調整済み進展：エキソン含有効率（78–98%）およびタンパク質の fold-change（1.5–1.9）に基づいた go/no-go 判断を可能にし、後段階における生物学的リスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、ターゲット検証からリード化合物の同定、さらには前臨床評価に至る創薬の連続的なプロセスに統合されており、in vivo試験に先立ってAONの有効性を反復的に評価することを可能にします。
- 探索生物学：GAPDHによる標準化を通じてオフターゲット効果を排除し、エキソンの包含率を定量化することで、スプライススイッチング機構の仮説検証を支援します。
- スクリーニング：アッセイの準備状況および定量的な出力（エキソン包含率%、転写物のフォールドチェンジ）を提供し、さまざまなAON化学構造にわたる信頼性の高い化合物評価を可能にします。
- アナリティクス：測定可能なリードアウト（RT-PCRバンドの定量化、qPCR相対発現量、ウェスタンブロットによるタンパク質レベル）を生成し、条件間の比較分析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：患者由来細胞における分子レベルの有効性とタンパク質の回復を関連付け、バイオマーカーの整合性と前臨床研究の継続性を支援します。
- 企業レベルでの再利用：複数のAONタイプおよび細胞システムに適用可能な標準化されたリポフェクションプロトコルを確立し、重複するメソッド開発を削減します。
運用およびエンタープライズへの影響
- 科学的価値： エクソンの組み込みとSMNタンパク質の回復を直接測定することにより、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を提供する。
- 運用的価値： 低濃度での多様なAON化学構造の試験において、標準化、再現性、および感度を確保する。
- 戦略的価値： エクソンの組み込み効率をタンパク質発現に結びつけることで、Go/No-Go判断を改善し、後期段階での失敗リスクを低減する。
- ポートフォリオへの影響： 定量的な有効性しきい値に基づいた、リスク調整済みのAON候補の優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 核酸の取り扱い、トランスフェクションの最適化、およびRNA/タンパク質分析に関する専門知識が必要です。
- トランスフェクション試薬の適合性、RNA定量用の分光光度計、およびゲル電気泳動/qPCR/ウェスタンブロット装置に依存します。
- 再現性のある結果を得るためには、トランスフェクション条件（コンフルエンシー、試薬比率）およびコントロールの標準化（GAPDH、cofilin）をチーム間で統一する必要があります。
- 初代筋芽細胞やその他の細胞株に適応させる場合は、トランスフェクション効率の最適化および細胞毒性評価が必要になる場合があります。
- 実用上の制限として、患者由来線維芽細胞の継代数のばらつきや、抽出時のRNA完全性の保持が必要な点が挙げられます。
