均質な時間分解蛍光共鳴エネルギー転送を用いた測定インスリン分泌の検出

この手順の全体的な目標は、インスリン分泌細胞から分泌されるインスリンのレベルを誘導し、正確に定量化することです。この方法は、膵臓ベータ細胞におけるグルコース刺激インスリン分泌の主なメカニズムなど、糖尿病分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、グルコース刺激に応答したインスリン分泌を正確かつ迅速に定量化し、分泌に対する潜在的な薬物効果を検出できることです。

この技術の意味は、薬物誘発性代謝機能障害のメカニズムをよりよく理解することを可能にするため、2型糖尿病の治療と創薬にまで及びます。この方法は、不死化ベータ細胞株からのインスリン分泌に関する洞察を得ることができますが、無傷の膵島などの他のシステムにも適用できます。一般的に、この方法に不慣れな人は、複数の細胞処理ステップと薬物調製のために苦労します。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、インスリン分泌に対するドーパミン作動薬の作用を調査するための迅速なアッセイを考え出したいと思ったときでした。細胞の繊細な性質と、実験間のアッセイの一貫性を確保するための精度の重要性のために、細胞の取り扱いステップを学ぶのが難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。まず、テキストプロトコルで概説されているように、INS-1E細胞を増殖させます。

細胞が目的のコンフルエントに達したら、培地を吸引します。細胞を5ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄します。次に、0.5ミリリットルの025%トリプシンを細胞に加え、細胞をインキュベーターに3〜4分間摂氏37度で放置します。

トリプシンを不活性化するには、9ミリリットルの完全培地を追加します。次に、細胞を15ミリリットルの遠心チューブに移します。次に、細胞を遠心分離してペレットを形成します。

遠心分離後、ペレットを5ミリリットルの新鮮な培地に溶解します。再懸濁した細胞を10マイクロリットルをチューブからピペットで取り出し、10マイクロリットルのトリパンブルーバイタル色素と混合して生存率を評価します。次に、血球計算盤を使用して、生きている細胞と死んだ細胞の数を数え、細胞の90%が生きていることを確認します。

カウント後、新鮮なRPMI 1640培地にミリリットルあたり100万個の細胞を加え、次にポリ-L-リジンコーティングされた24ウェルプレートの各ウェルに500,000個のINS-1E細胞の0.5ミリリットルを播種します。プレートをインキュベーターに丸1日置いておきます。翌日、培地を取り出し、各ウェルに500マイクロリットルの新鮮なRPMI 1640培地を追加します。

プレートをさらに24時間インキュベートして、細胞がウェル表面に広がるようにします。アッセイを行うには、まずKRBバッファーを調製し、次に各ウェルから培地を吸引し、予め加温したリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄します。次に、各ウェルにウシ血清アルブミンを添加し、グルコースは添加しない450マイクロリットルのKRBバッファーを追加します。

培養プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%に1時間放置します。KRB緩衝液中で薬物の段階希釈液を調製し、最終濃度200ミリモルグルコースの10倍を添加します。グルコース飢餓ステップの後、対応する各ウェルで50マイクロリットルの段階希釈薬物をピペットで掴みます。

グルコース刺激のために、20ミリモルグルコースの存在下でそれぞれの段階希釈薬物を追加します。.次に、細胞を摂氏37度で90分間インキュベートします。刺激が終わったら、上清を回収し、標識された1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。

採取した各上清10マイクロリットルを96ウェルプレートに移します。各ウェルに90マイクロリットルのKRBを添加して、1対10の希釈比を達成します。希釈液を混合して均質性を確保します。

次に、HTRFインスリンアッセイのインスリン標準曲線を取得します。次に、標準的なインスリンサンプルと希釈したアッセイ上清をそれぞれ10マイクロリットルを96ウェルプレートに加えます。抗体ミックスを1〜2ドナーで調製し、検出バッファー中の比率を受け入れます。

抗体ミックスを調製した後、96ウェルプレートの各ウェルに30マイクロリットルを加えます。プレートを密封し、室温でインキュベートします。インキュベーション後、抗体ミックスを入れたプレートをプレートリーダーで読み取ります。

読み取りには665ナノメートルと620ナノメートルの適切なHTRF光学モジュールを使用し、各ウェルに200回のフラッシュを使用します。まず、インスリンの検量線をプロットして、アッセイサンプルからインスリンの実際の値を推定します。標準曲線は、得られたレシオメトリック蛍光測定値が、事前定義された標準ヒトインスリン濃度の関数として有意に増加することを示しています。

次に、INS-1E細胞からのインスリン分泌の基礎レベルを、20ミリモルグルコースの存在下または非存在下で研究します。プロットから、グルコースの存在下で細胞がインスリン1ミリリットルあたり約100ナノグラムを分泌することを示しています。興味深いことに、インスリンレベルは、グルコースがない場合、ミリリットルあたり約15ナノグラムでほぼ半分です。

次に、細胞を、20ミリモルグルコースを含むドーパミン濃度の増加した存在下でインキュベートします。分泌されるインスリンは、各ウェルからの最大インスリンの割合の平均値に正規化されます。プロットは、ドーパミンがGSISを阻害することを示しており、それによってGSISにおけるドーパミン作動性受容体の機能的重要性を示しています。

このプロットは、2型糖尿病治療薬であるブロモクリプチンが、ドーパミンよりもGSISの誘導に強力であることを示しています。このプロットは、キンピロールの濃度が増加すると、D2アゴニストはブロモクリプチンよりも効率は劣りますが、GSISの刺激においてドーパミンと同様の効力を示すことを示しています。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば4〜5時間で完了します。

この手順を試すときは、慎重かつ一貫してピペットを振ることを忘れないでください。この手順に続いて、サイクリックAMP HDRFアッセイなどの他の機能アッセイを実行して、ダウンストリームシグナル伝達に対するドーパミン作動性薬物の影響などの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、代謝の分野の研究者が不死化細胞株と膵島の両方で他の内分泌分泌経路を探索する道を開きました。

このビデオを見れば、HDRFを使用して細胞からのインスリン分泌を正確に測定する方法を十分に理解できるはずです。