Name: PDGFRα + 低細胞クロマチン免疫沈降塩基配列解析法による細胞を精製した急性の転写因子 Olig2 ゲノム結合部位の特定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: 学ぶ低細胞ChIP-seq法によるOlig2転写因子のゲノム結合部位解析。マウス脳由来OPCを精製し、エピジェネティック機構と細胞分化の理解を深めるバイオインフォマティクス解析手法を習得する。

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JQW、XD、RCDD、YY は、国家機関の健康 R01 NS088353; からの補助金によって支えられました。NIH グラント 1R21AR071583-01;Staman オギルビー基金記念ヘルマン財団;UTHealth 脳イニシアチブと CTSA UL1 TR000371;テキサス システム神経科学・神経研究所 (補助金 #362469) の大学からの助成金。

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</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

哺乳類遺伝子制御ネットワークは非常に複雑であります。チップ seq、ゲノム蛋白質 DNA の相互作用を調査する強力な方法です。このプロトコルは、(低反応あたり 2 万セルとして) マウス脳から精製した Opc の数が少ないを使用して Olig2 チップ seq を実行する方法を説明します。このプロトコルの最初のキーのステップは、PDGFRα 抗体を用いた immunopanning によるマウス脳から Opc の浄化です。PDGFRα コーティング プレートと Opc の肯定的な選択のため、PDGFRα にしばしば弱バインドする Opc 塗布鋼板。いくつかの洗浄後もまだ左にいくつかの非付着性のセルがあります。各 D PBS 後非付着細胞を顕微鏡下で洗うをチェックすることが重要です。非付着性のセルの数を減らすためにより多くの D PBS 洗浄が解決しない場合に余分な洗浄が接続されている Opc を取り除くし、浄化された細胞の収量を減らすので選択したセルの収集です。しかし、他の脳細胞の種類の汚染に十分な洗浄があります。したがって、分離後、毎回GFAPのアストロ サイト、既知の細胞型のニューロン、 Tuj1...

それは蛋白質 (または蛋白質の複合体) を研究することが重要 DNA バインディングおよびエピゲノム様々 な生物学的過程に関与する転写制御ネットワークを構築します。特に、ゲノム DNA への転写因子の結合は、遺伝子発現制御、細胞分化と組織の発達に重要な役割を再生できます。転写制御とエピジェネティクス機構を研究するための強力なツールは、クロマチン免疫沈降 (チップ) です。おかげで次世代シーケンシング技術の急速な進歩によって、蛋白質・ DNA バインディングおよびエピゲノム1の分析に高スループット DNA シーケンス (チップ seq) と相まってチップが使用されます。ただし、標準的なチップ seq プロトコルには、反応は、細胞の数が限られている孤立した初代培養細胞などのまれな細胞集団のこの技術の応用を難しくあたり約 2000 万セルが必要です。
オリゴデンドロ サイト細胞オリゴデンドロ サイト前駆細胞 (Opc) とオリゴデンドロ サイトなどを含む脳の全体に広く分散、開発や脳の機能が不可欠です。前駆細胞型として Opc は自己複製と分化の両方が可能です。Opc は、オリゴデンドロ サイト前駆細胞として機能するだけでなく、脳細胞2の他の種類との通信によって神経信号の伝播の重要な役割を果たします。以前の研究では、オリゴデンドロ サイト開発が Olig2 および Sox103,4など系統特異的転写因子によって調節されていることを示唆しています。これらの転写因子は、オリゴデンドロ サイト仕様と分化の間に彼らの表現に影響を与えるいくつかの重要な遺伝子のプロモーターやエンハンサー領域にバインドする発見されました。しかし、DNA 細胞の非常に限られた数で鋭く精製プライマリ Opc に興味の蛋白質 (または蛋白質の複合体) のバインドを識別するは困難です。
このプロトコルでは、チップ seq を用いたゲノム規模で浄化されたマウス Opc で Olig2 によるゲノム DNA の沈澱を体系的に調査する方法について説明します。マウス脳から Opc 急性 immunopanning で精製され増殖体外なしチップ実験で使用されます。Opc の限られた数は immunopanning によって得ることができる、標準チップ seq 実験のために十分ではないです。ここで、低細胞チップ seq プロトコルはトランスクリプション要因のためチップ反応あたり 2 万セルとして低記載されて。簡単に言えば、架橋細胞分離, クロマチンをせん断する超音波装置による超音波処理.Olig2 抗体ゲノム DNA を沈殿させる A をコートしたビーズの蛋白質と同様、Olig2 抗体とせん断のクロマチンを孵化すると。A コートしたビーズとタンパク質・ リバース架橋から溶出後 Olig2 抗体によって引き起こされる DNA がフェノール-クロロホルム抽出法で精製した.結果として得られる製品は定量化され T テーリングを受ける、プライマーアニー リングのテンプレート スイッチとエクス テンション、アダプター、増幅、ライブラリ サイズ選択、浄化の追加チップ seq ライブラリ構築の手順します。
シーケンス処理の後 Olig2 転写因子抗体調製した試料コントロールのサンプルから raw 読み取りの品質を調べた。質の低い塩基対とアダプターを含むフラグメントされたトリミングをお読みください。次に、トリミングされた読み取りマウス参照ゲノムに一直線に並んだ。コントロールのサンプルと比較してチップの読み取りがピークとして検出されたため大幅濃縮したゲノム領域。潜在的な転写因子結合部位を表す重要なピークはフィルターされ、ゲノムのブラウザーで可視化します。
特に、このプロトコルで説明する方法は、限られた数の任意のセル型と他の転写因子のチップ seq の広く使用できます。

<table><tbody><tr><td>試薬/ 機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banderiaea simplicifolia lectin 1</td><td>Vector Laboratories</td><td># L-1100</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗PDGFRa抗体</td><td>BD Bioscience</td><td># 558774</td><td></td></tr><tr><td>神経組織解離キット (P)</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td># 130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL technologies</td><td>#07920</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Thermo Fisher</td><td>#15596026</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody</td><td>Millipore</td><td># AB5320</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Pico sonication device</td><td>Diagenode</td><td># B01060001</td><td></td></tr><tr><td>True MicroChIPキット</td><td>Diagenode</td><td># C01010130</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td><td>ThermoFisher</td><td># 15593031</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin ゲル&PCR クリーンアップキット</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td># 740609</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td># P11496</td><td></td></tr><tr><td>DNA SMART ChIP-Seq kit</td><td>Clontech Laboratories</td><td># 634865</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Voulter</td><td># A63880</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Thermo Fisher</td><td># AM9516</td><td></td></tr><tr><td>pico-green</td><td>Thermo Fisher</td><td># P11496</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Thermo Fisher</td><td># 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Master mix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td># 1725124</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Fisher Scientific</td><td># 11-320-033</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td><td>Fisher Scientific</td><td># 15140122</td><td></td></tr><tr><td>N-2 サプリメント</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック<td>#17502048</td><td></td></tr><tr><td>B-27 サプリメント</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック<td>#17504044</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>シグマ</td><td>#I6634</td> 5 <td>mgのインスリンを10 mlの水と50 μに溶解して、0.5 mg / mlのインスリン溶液を調製します。1 N HClのl。</td></tr><tr><td>細胞培養(BSA)に適したウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma</td><td>#A4161</td><td>100mlのD-PBSに4 g BSAを溶解し、pHを7.4に調整することにより4%BSA溶液を調製します</td></tr><tr><td>線維芽細胞成長因子基本タンパク質、ヒト組換え(bFGF)</td><td>EMDミリポア</td><td>#GF003</td><td></td></tr><tr><td>ヒトPDGF-AA</td><td>VWR</td><td>#102061-188</td><td></td></tr>ポリ<tr><td>-D-リジン</td><td>VWR</td><td>#IC15017510</td><td>10 mgのポリD-リジンを10 mLの水に溶解して1 mg / mlのポリD-リジン溶液を調製し、使用する場合は100倍に希釈してください。.</td></tr><tr><td>ファルコン使い捨てペトリ皿、滅菌、コーニング、100x15mm</td><td>VWR</td><td>#25373-100</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン使い捨てペトリ皿、滅菌、コーニング、150x15mm</td><td>VWR</td><td>#25373-187</td><td></td></tr><tr><td>HBSS、10X、カルシウムなし、マグネシウムなし、フェノールなし レッド</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>#14185-052</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>ステムセルテクノロジー</td><td>#07050</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma</td><td># 11697498001</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastQC</td><td>[10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td><td></td> <td>生リードとトリミングリードの品質管理メトリクスの取得</td></tr><tr><td>Trimmomatic 0.33</td><td>[11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td><td></td><td>生リード</td></tr><tr><td>のトリミングとフィルタリングGENCODE mm10</td><td>ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz</td><td></td><td>Mouse reference genome</td></tr><tr><td>Bowtie2 2.2.4</td><td>[12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SAMTools 1.5</td><td>[13] http://samtools.sourceforge.net/</td><td></td> <td>SAMファイルのBAM形式への変換</td></tr><tr><td>HOMER 4.9.1</td><td>[14] http://homer.ucsd.edu/homer/</td><td></td> <td>タグディレクトリを作成し、遺伝子記号R</td></tr><tr><td>3.2.2</td>で濃縮されたゲノム領域に注釈を付ける[<td>15] https://www.R-project.org/</td><td></td> <td>スクリプトのプログラミングと関数の実行</td></tr><tr><td>SPP 1.13</td><td>[16] https://github.com/hms-dbmi/spp</td><td></td><td>鎖相互相関プロットの作成</td></tr><tr><td>MACS2 2.2.4</td><td>[17] https://github.com/taoliu/MACS</td><td></td><td>制御上のChIP濃縮領域の検索</td></tr><tr><td>BEDTools 2.25</td><td>[18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/</td><td></td> <td>ゲノム演算</td></tr><tr><td>bedGraphToBigWig</td><td>http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/</td><td></td> <td>bedGraph ファイルをbigwig</td></tr><tr><td>IGVブラウザに変換する 2.3.58</td><td>[19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/</td><td></td> <td>の視覚化と閲覧重要なChIP-seqピーク</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td>Spreasheetプログラム</td></tr><tr><td>ENCODEのブラックリスト</td><td>https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists</td><td></td><td>フィルタリングピーク</td></tr><tr><td>mm10.chrom.sizes</td><td>http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes。</td><td></td><td>bedGraphファイルのbigwig</td></tr><tr><td>ENCODEのモチーフデータベース</td>への変換<td>[25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/</td><td></td> <td>モチーフエンリッチメントに必要な包括的なモチーフデータベース</td></tr><tr><td>MEME-ChIP</td><td>[20] http://meme-suite.org/index.html</td><td></td> qPCR motif <td>enrichmentの分析と発見</td></tr><tr><td><プライマー名></td><td></td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Mbp-F:</td><td></td><td></td><td>CTATAAATCGGCTCACAAGG</td></tr><tr><td>Mbp-R:</td><td></td><td></td><td>AGGCGGTTATATTAAGAAGC</td></tr><tr><td>Iba1-F:</td><td></td><td></td><td>ACTGCCCCTAAGACAACC</td></tr><tr><td>Iba1-R:</td><td></td><td></td><td>GCTTTTCCTCCTCTCGCAAATCC</td></tr><tr><td>Mog-F:</td><td></td><td></td><td>GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC</td></tr><tr><td>Mog-R:</td><td>><</td><td></td><td>TGAATTGTCCTGCATAGCTGC</td></tr><tr><td>GAPDH-F</td><td></td><td></td><td>ATGACATCAAGAAGGTGGTG</td></tr><tr><td>GAPDH-R</td><td></td><td></td><td>CATACCAGGAAATGAGCTTG</td></tr><tr><td>Tuj1-F</td><td></td><td></td><td>TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG</td></tr><tr><td>Tuj1-R</td><td></td><td></td><td>GATGACCTCCCAGAACTTGGC</td></tr><tr><td>PDGFR&α;-F</td><td></td><td></td><td>AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC</td></tr><tr><td>PDGFR&alpha;-R</td><td></td><td></td><td>GTCCCTCCACGGTACTCCT</td></tr></tbody></table>

pdgfrα + 低細胞クロマチン免疫沈降塩基配列解析法による細胞を精製した急性の転写因子 olig2 ゲノム結合部位の特定

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

哺乳類セルの遺伝子の転写はゲノム DNA と転写因子の相互作用によって細胞型固有の方法で調整されます。系統特異的転写因子は、セル仕様と開発中に分化に重要な役割を再生すると見なされます。ゲノム DNA の転写因子 (またはその関連付けられた複合体) のゲノム結合部位を分析する高スループット DNA シーケンス (チップ seq) と相まってチップが使用されています。ただし、多数のセルが 1 つ標準チップの反応、分離細胞または珍しいセル人口の限られた数を検討することは困難になるため必要です。オリゴデンドロ サイトの系統特異的転写調節機構を理解するために因子 Olig2 鋭く浄化されたマウス Opc、チップ seq を使用して Olig2 (または複雑な Olig2) のゲノム結合部位を特定する詳細な方法が表示されます。プロトコルが血小板由来成長因子の受容器のアルファ (PDGFRα) を浄化する方法を説明しますまず、マウスの脳から肯定的な Opc。次に、Olig2 抗体チップとライブラリーの構築が実行されます。最後の部分では、バイオインフォマティクス ソフトウェアと Olig2 チップ seq 解析に使用するプロシージャについて説明します。要約すると、転写因子 Olig2 鋭く精製脳内 Opc のゲノムワイドなバインディングを分析する方法を報告します。

低細胞チップ seq を行い精製急性脳 Opc でゲノム DNA と転写因子 Olig2 の潜在的な相互作用を調査するため情報の解析が行われました。図 1は、実験とデータ解析手順の一般的なワークフローを示します。このプロトコルでは生後マウス脳単一細胞懸濁液に分離。組織解離後 immunopanning は PDGFRα 抗体を用いた Opc を浄化するために行われました。図 2は、PDGFRα、神経細胞マーカー Tuj1 の小さな表現の重要な濃縮 (ニューロン固有のクラス III β-チューブリン)、アストロ サイトのマーカー GFAP (グリア線維性酸性蛋白)、ミクログリア マーカー イオン化カルシウム結合アダプターを示しています分子 1 (Iba1)、髄成熟オリゴデンドロ サイト マーカー ミエリン塩基性タンパク質 (Mbp) やミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 (モグ) 精製 Opc から RT qPCR による評価。さらに、免疫染色結...

低細胞クロマチン免疫沈降 (チップ) を実行することによってゲノム内でバインド オリゴデンドロ サイトのトランスクリプション要因 2 の (Olig2) 鋭く精製脳オリゴデンドロ サイト前駆細胞 (Opc) を分析するように設計されたプロトコルを紹介します。、ライブラリの準備、高スループット シーケンスおよびバイオインフォマティクス データ解析。

PDGFRα + 低細胞クロマチン免疫沈降塩基配列解析法による細胞を精製した急性の転写因子 Olig2 ゲノム結合部位の特定

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

この実験の全体的な目標は、免疫パニング、低細胞クロマチン免疫沈降、ハイスループットシーケンシング、およびバイオインフォマティクスデータ解析を行うことにより、急性精製された脳オリゴデンドロサイト前駆細胞におけるオリゴデンドロサイト転写因子2のゲノムワイド結合を解析することです。この方法は、細胞の分化と発生に重要な役割を果たすゲノムワイドな転写制御とエピジェネティックなメカニズムを研究するための強力なツールです。この技術の主な利点は、in vitroで増殖しない急性精製初代細胞を含む、限られた数の任意の細胞タイプを持つ他の転写因子のChIP-seqに広く適用できることです。その手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるYanan Youです。彼女はこの論文の共著者です。PDGFR-α陽性細胞を選択するには、イムノパニング用のプレートを1枚用意します。内皮細胞とミクログリアの枯渇のために、さらに2枚のプレートを準備します。次に、10センチメートルのシャーレに30マイクロリットルのヤギ抗ラット免疫グロブリンをコーティングします。次に、プレートの表面全体がコーティング溶液で均一に覆われるように、プレートを攪拌します。ペトリ皿を摂氏4度で一晩放置します。次に、40マイクロリットルのラット抗PDGFR-α抗体を、0.2%ウシ血清アルブミンを含む12ミリリットルのDPBSで希釈します。次に、免疫グロブリンGコーティングプレートを10ミリリットルの1X DPBSで3回連続して洗浄します。次に、免疫グロブリンGコーティングプレートをPDGFR-α抗体溶液と室温で4時間インキュベートします。4時間後、プレートの側壁に沿ってDPBSを慎重に追加し、ラット抗PDGFR-α抗体コーティングプレートを3回洗浄します。プレートのコーティング面を乱さないでください。次に、20ミリリットルのDPBSと2.3マイクログラム/ミリリットルのBSL-1を使用して、2つの15センチメートルのペトリプレートを2時間コーティングします。インキュベーション後、プレートの側壁に沿って20ミリリットルのDPBSを慎重に追加して、BSL-1プレートを3回洗浄します。コーティングされた表面を乱さないでください。洗浄後、1細胞懸濁液を300 gで室温で10分間遠心分離します。遠心分離後、15ミリリットルの免疫パニングバッファーを細胞ペレットに加えます。次に、2つのマウス脳からの単一細胞懸濁液を、2つのBSL-1コーティングされたペトリ皿上で順次インキュベートします。その後、プレートを室温で15分間放置します。インキュベーション中は5分ごとにプレートを攪拌します。次に、プレートを静かに渦巻いて、細胞懸濁液からすべての非接着性細胞を収集します。次に、ラットPDGFR-α抗体コーティングプレート上に細胞を播種します。プレートを室温で45分間インキュベートします。45分が終わったら、プレートを再度回転させます。その後、細胞懸濁液を廃棄します。次に、プレートをDPBSで8回すすぎ、非接着性細胞を除去します。顕微鏡でプレートを検査します。次に、ラットPDGFR-α抗体コーティングプレート上に細胞剥離液を添加します。次に、プレートを摂氏37度で10分間インキュベートします。その間に、プレートを振って付着細胞を取り除き、顕微鏡で調べます。次に、細胞を室温で300倍gで遠心分離します。遠心分離後、細胞ペレットを1ミリリットルのOPC細胞培養培地で再懸濁します。次に、血球計算盤でトリパンブルー排除法を使用して細胞をカウントします。血球計算盤でカウントした後、ChIP反応のために1ミリリットルのOPC細胞培養培地に20, 000精製OPCを加えます。次に、27マイクロリットルのホルムアルデヒド36.5%を室温で10分間加えます。これにより、セルが修正されます。10分後、50マイクロリットルの2.5モルグリシンを固定細胞に室温で5分間加えます。グリシンを添加すると、DNA-タンパク質の架橋が停止します。次に、架橋細胞を1ミリリットルのHBSSバッファーとプロテアーゼ阻害剤カクテルで洗浄します。次に、予冷した遠心分離機で細胞を摂氏4度で300倍gで遠心分離します。精製したOPCを架橋した後、架橋細胞を氷冷HBSS溶液で洗浄し、残りのChIPステップを4°Cで行わないと、抗体はゲノムDNAを適切に沈殿させることができません。次に、25マイクロリットルの完全溶解バッファーを細胞ペレットに加え、氷上に5分間放置します。次に、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む氷冷HBSSバッファー75マイクロリットルをピペットで移します。次に、予冷した超音波処理システムで細胞溶解物のクロマチンを、プログラムを30秒オンとオフに30秒の5サイクルでせん断します。クロマチンが剪断されたら、細胞溶解物を14,000倍gで摂氏4度で10分間遠心分離します。遠心分離の最後に、上清を収集します。次に、剪断したクロマチン100マイクロリットルを、プロテアーゼ阻害剤を含む氷冷ChIP緩衝液と等量の希釈します。次に、希釈したせん断クロマチン180μLに1マイクロリットルのウサギ抗Olig2抗体を添加します。回転するホイールでチューブを摂氏4度、毎分40回転で16時間インキュベートします。次に、10 μリットルの洗浄済みプロテインAコーティングビーズを低温室のChIP反応チューブに加えます。再度、ChIPチューブを4°Cで回転ホイール上でさらに2時間インキュベートします。2時間後、ChIP反応チューブを磁気ラックに1分間置いておきます。次に、ビーズペレットを100マイクロリットルの4つの洗浄バッファーで、摂氏4度の回転ホイールで4分間洗浄します。次に、200マイクロリットルの溶出バッファーをビーズペレットに加えます。反応チューブを摂氏65度で4時間インキュベートします。二本鎖DNAが変性したら、エビアルカリホスファターゼを添加して、一本鎖DNAの3プライム末端を脱リン酸化します。次に、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して、一本鎖DNAにpoly-Tテールを添加します。次に、DNAポリ-dAプライマーを一本鎖DNAテンプレートにアニーリングします。次に、フォワードプライマーとリバースプライマーを使用してChIP配列ライブラリを増幅し、インデックス化します。ライブラリ調製のためのPCRサイクル数は、開始DNAの量によって異なります。優れたライブラリー調製には、インプットDNA量の正確な定量が必要です。PCRサイクルが多すぎたり少なすぎたりすると、ライブラリの濃度や複雑さに影響を及ぼし、PCRアーティファクトにつながる可能性があります。常磁性ビーズを使用して、PCR増幅ChIP配列ライブラリーから250〜500塩基対の範囲のフラグメントを選択します。マイクロ流体チップキャピラリー電気泳動デバイスを使用して、選択したChIP配列ライブラリの品質を調べます。イムノパン添加OPCの純度を評価するために、免疫染色研究が行われます。OPC系統マーカーNG2抗体を用いたところ、PDGFR-α抗体免疫パン化細胞の大部分がNG2陽性であることが示されています。次に、PDGFR-αの濃縮を確認するために定量的PCRを行います。得られたプロットは、解離した脳細胞と比較してPDGFR-αの有意な濃縮を示すニューロンマーカーであるTuj1の発現をほとんど示していません。GFAP、Mog、Mbpなどの他のマーカーすべてについてほとんど発現していないことを示す同様の結果が得られ、PDGFRαの濃縮を示しています。次に、ChIP配列ライブラリーの品質を解析します。エレクトロフェログラムは、ライブラリPCR産物のサイズ選択後、250〜500塩基対の範囲のOlig2転写因子の明確なピークを表しています。ここでは、ヒストグラムはタグのクローナリティを示しており、ピークコールの前に取得された品質管理メトリックを検証しています。このバーは、リードの90%以上が1つのゲノム位置のみにマッピングされていることを示しています。次に、主要なフラグメント長に対応する濃縮されたピークを示す鎖相関プロットが得られます。プロットでは、赤い線は50塩基対での読み取り長と130塩基対でのフラグメント長を表しており、高品質のデータを示しています。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば3日で行うことができます。この技術は、その開発後、研究者が初代細胞や希少細胞の転写因子やその他のタンパク質のゲノムワイドなDNA結合部位を探索する道を開きました。このビデオを見れば、イムノパニングによってマウスの脳から初代OPCを精製する方法や、少ない細胞数でChIP-seq実験を行う方法についてよく理解できるはずです。

identifying-transcription-factor-olig2-genomic-binding-sites-acutely

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ここでは、ヒストン結合ドメインが異なるタンパク質アイソフォームのゲノムワイド位置解析のためのクロマチン免疫沈降（ChIP）の手順を提示している。我々はKDM5A/JARID1A/RBP2ヒストン脱メチル化酵素の標的を同定するためのChIP -...

アイソフォーム特異的遺伝子標的を同定するためのチップを使用してゲノムワイド解析

Chirpが長い非コードRNAのゲノム結合部位（lncRNAs）をマッピングするための新規かつ迅速な手法である。メソッドは、lncRNAバインドされたゲノムサイトの列挙を許可するアンチセンスタイルオリゴヌクレオチドの特異性を利用しています。...

RNA精製によってクロマチンの単離（チャープ）

このビデオでは、タンパク質-DNA相互作用を実証する古典的な手法であるクロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイのプロトコールについて説明しています。この技術は、ヒト慢性リンパ性白血病細胞の標的遺伝子を同定するために使用されます。...

クロマチン免疫沈降アッセイ:細胞内のタンパク質-DNA相互作用を研究する技術

このビデオでは、タンパク質結合クロマチンフラグメントの選択的免疫沈降を介して、オリゴデンドロサイト前駆細胞のゲノムDNAの特定の領域上のタンパク質結合部位を特定するクロマチン免疫沈降技術を示しています。この方法は、遺伝子調節に関与する転写因子を含む、いくつかの調節タンパク質の相互作用を研究するのに役立ちます。...

ゲノムDNA上の標的タンパク質結合部位を同定するためのクロマチン免疫沈降法

我々は、一次T細胞を用いたクロマチン免疫沈降のための堅牢な方法が記載されている。メソッドは、標準的なアプローチの上に成り立ったが、細胞の数量限定のために効率を改善条件や試薬の特定のセットを使用しています。重要なことは、データ分析段階の詳細な説明が提示される。...

バイオマスの制限額を使用して効率的なクロマチン免疫沈降

クロマチン免疫沈降法と超高スループットシーケンシング（チップ-SEQ）の組み合わせは、所定の組織または細胞株におけるタンパク質-DNA相互作用を特定し、マッピングすることができます。概説としては、例えば、転写因子TCF7L2の経験を使用して、その後の配列決定のための高品質のChIPテンプレートを生成する方法である。...

ハイスループットシーケンシングのための高品質クロマチン免疫沈降DNAテンプレート（チップ-SEQ）の生成

この作業では、活性エンハンサーがどのように特定され、実験的に検証されるかについての実験的なワークフローを提供します。...

レチノイン酸誘導された胚性幹細胞分化の間に活性化された予測と遺伝子調節要素の検証

このプロトコルは、チップ seq、4sU seq、総 RNA シーケンス、およびリボソームが細胞および細胞のためプロファイリングの組合せの使用を説明します。転写因子のバインド、 de novo転写、RNA...

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

慢性リンパ性白血病 (CLL) は西部の世界で最も一般的な白血病です。NFAT 転写因子は、開発と様々 な細胞タイプにおける活性化の重要なレギュレータです。NFAT2 の新規標的遺伝子を識別するために CLL 細胞のクロマチン免疫沈降 (チップ)...

慢性リンパ性白血病の新規 NFAT2 ターゲット遺伝子を識別するクロマチン免疫沈降法

我々は、胚性幹細胞から生成された胚体における高スループットシーケンシングに続く定量染色体立体構造捕捉の適用を報告する。この技術は、胚性幹細胞分化中に所定の遺伝子の推定エンハンサーとプロモーター領域との接触を同定し、定量することを可能にする。...

定量染色体立体構造捕捉による胚体におけるエンハンサー・プロモーター接触の同定(4C)

本質的に障害が発生したドメインは、発癌性融合転写因子機能にとって重要である。これらのタンパク質を治療的に標的にするためには、これらのドメインで採用される調節機構のより詳細な理解が必要である。ここでは、Ewing肉腫における本質的に無秩序なEWSドメインの重要な構造的特徴をマッピングするために、トランスクリプトミクスを使用する。...

トランスクリプトーム解析を用いた無秩序発がん性転写因子の構造機能関係のマッピング

学ぶ低細胞ChIP-seq法によるOlig2転写因子のゲノム結合部位解析。マウス脳由来OPCを精製し、エピジェネティック機構と細胞分化の理解を深めるバイオインフォマティクス解析手法を習得する。

PDGFRα + 低細胞クロマチン免疫沈降塩基配列解析法による細胞を精製した急性の転写因子 Olig2 ゲノム結合部位の特定

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