PDGFRα + 低細胞クロマチン免疫沈降塩基配列解析法による細胞を精製した急性の転写因子 Olig2 ゲノム結合部位の特定
2018年4月16日
低細胞クロマチン免疫沈降 (チップ) を実行することによってゲノム内でバインド オリゴデンドロ サイトのトランスクリプション要因 2 の (Olig2) 鋭く精製脳オリゴデンドロ サイト前駆細胞 (Opc) を分析するように設計されたプロトコルを紹介します。、ライブラリの準備、高スループット シーケンスおよびバイオインフォマティクス データ解析。
この実験の全体的な目標は、免疫パニング、低細胞クロマチン免疫沈降、ハイスループットシーケンシング、およびバイオインフォマティクスデータ解析を行うことにより、急性精製された脳オリゴデンドロサイト前駆細胞におけるオリゴデンドロサイト転写因子2のゲノムワイド結合を解析することです。この方法は、細胞の分化と発生に重要な役割を果たすゲノムワイドな転写制御とエピジェネティックなメカニズムを研究するための強力なツールです。この技術の主な利点は、in vitroで増殖しない急性精製初代細胞を含む、限られた数の任意の細胞タイプを持つ他の転写因子のChIP-seqに広く適用できることです。
その手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるYanan Youです。彼女はこの論文の共著者です。PDGFR-α陽性細胞を選択するには、イムノパニング用のプレートを1枚用意します。
内皮細胞とミクログリアの枯渇のために、さらに2枚のプレートを準備します。次に、10センチメートルのシャーレに30マイクロリットルのヤギ抗ラット免疫グロブリンをコーティングします。次に、プレートの表面全体がコーティング溶液で均一に覆われるように、プレートを攪拌します。
ペトリ皿を摂氏4度で一晩放置します。次に、40マイクロリットルのラット抗PDGFR-α抗体を、0.2%ウシ血清アルブミンを含む12ミリリットルのDPBSで希釈します。次に、免疫グロブリンGコーティングプレートを10ミリリットルの1X DPBSで3回連続して洗浄します。
次に、免疫グロブリンGコーティングプレートをPDGFR-α抗体溶液と室温で4時間インキュベートします。4時間後、プレートの側壁に沿ってDPBSを慎重に追加し、ラット抗PDGFR-α抗体コーティングプレートを3回洗浄します。プレートのコーティング面を乱さないでください。
次に、20ミリリットルのDPBSと2.3マイクログラム/ミリリットルのBSL-1を使用して、2つの15センチメートルのペトリプレートを2時間コーティングします。インキュベーション後、プレートの側壁に沿って20ミリリットルのDPBSを慎重に追加して、BSL-1プレートを3回洗浄します。コーティングされた表面を乱さないでください。
洗浄後、1細胞懸濁液を300 gで室温で10分間遠心分離します。遠心分離後、15ミリリットルの免疫パニングバッファーを細胞ペレットに加えます。次に、2つのマウス脳からの単一細胞懸濁液を、2つのBSL-1コーティングされたペトリ皿上で順次インキュベートします。
その後、プレートを室温で15分間放置します。インキュベーション中は5分ごとにプレートを攪拌します。次に、プレートを静かに渦巻いて、細胞懸濁液からすべての非接着性細胞を収集します。
次に、ラットPDGFR-α抗体コーティングプレート上に細胞を播種します。プレートを室温で45分間インキュベートします。45分が終わったら、プレートを再度回転させます。
その後、細胞懸濁液を廃棄します。次に、プレートをDPBSで8回すすぎ、非接着性細胞を除去します。顕微鏡でプレートを検査します。
次に、ラットPDGFR-α抗体コーティングプレート上に細胞剥離液を添加します。次に、プレートを摂氏37度で10分間インキュベートします。その間に、プレートを振って付着細胞を取り除き、顕微鏡で調べます。
次に、細胞を室温で300倍gで遠心分離します。遠心分離後、細胞ペレットを1ミリリットルのOPC細胞培養培地で再懸濁します。次に、血球計算盤でトリパンブルー排除法を使用して細胞をカウントします。
血球計算盤でカウントした後、ChIP反応のために1ミリリットルのOPC細胞培養培地に20, 000精製OPCを加えます。次に、27マイクロリットルのホルムアルデヒド36.5%を室温で10分間加えます。これにより、セルが修正されます。
10分後、50マイクロリットルの2.5モルグリシンを固定細胞に室温で5分間加えます。グリシンを添加すると、DNA-タンパク質の架橋が停止します。次に、架橋細胞を1ミリリットルのHBSSバッファーとプロテアーゼ阻害剤カクテルで洗浄します。
次に、予冷した遠心分離機で細胞を摂氏4度で300倍gで遠心分離します。精製したOPCを架橋した後、架橋細胞を氷冷HBSS溶液で洗浄し、残りのChIPステップを4°Cで行わないと、抗体はゲノムDNAを適切に沈殿させることができません。次に、25マイクロリットルの完全溶解バッファーを細胞ペレットに加え、氷上に5分間放置します。
次に、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む氷冷HBSSバッファー75マイクロリットルをピペットで移します。次に、予冷した超音波処理システムで細胞溶解物のクロマチンを、プログラムを30秒オンとオフに30秒の5サイクルでせん断します。クロマチンが剪断されたら、細胞溶解物を14,000倍gで摂氏4度で10分間遠心分離します。
遠心分離の最後に、上清を収集します。次に、剪断したクロマチン100マイクロリットルを、プロテアーゼ阻害剤を含む氷冷ChIP緩衝液と等量の希釈します。次に、希釈したせん断クロマチン180μLに1マイクロリットルのウサギ抗Olig2抗体を添加します。
回転するホイールでチューブを摂氏4度、毎分40回転で16時間インキュベートします。次に、10 μリットルの洗浄済みプロテインAコーティングビーズを低温室のChIP反応チューブに加えます。再度、ChIPチューブを4°Cで回転ホイール上でさらに2時間インキュベートします。
2時間後、ChIP反応チューブを磁気ラックに1分間置いておきます。次に、ビーズペレットを100マイクロリットルの4つの洗浄バッファーで、摂氏4度の回転ホイールで4分間洗浄します。次に、200マイクロリットルの溶出バッファーをビーズペレットに加えます。
反応チューブを摂氏65度で4時間インキュベートします。二本鎖DNAが変性したら、エビアルカリホスファターゼを添加して、一本鎖DNAの3プライム末端を脱リン酸化します。次に、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して、一本鎖DNAにpoly-Tテールを添加します。
次に、DNAポリ-dAプライマーを一本鎖DNAテンプレートにアニーリングします。次に、フォワードプライマーとリバースプライマーを使用してChIP配列ライブラリを増幅し、インデックス化します。ライブラリ調製のためのPCRサイクル数は、開始DNAの量によって異なります。
優れたライブラリー調製には、インプットDNA量の正確な定量が必要です。PCRサイクルが多すぎたり少なすぎたりすると、ライブラリの濃度や複雑さに影響を及ぼし、PCRアーティファクトにつながる可能性があります。常磁性ビーズを使用して、PCR増幅ChIP配列ライブラリーから250〜500塩基対の範囲のフラグメントを選択します。
マイクロ流体チップキャピラリー電気泳動デバイスを使用して、選択したChIP配列ライブラリの品質を調べます。イムノパン添加OPCの純度を評価するために、免疫染色研究が行われます。OPC系統マーカーNG2抗体を用いたところ、PDGFR-α抗体免疫パン化細胞の大部分がNG2陽性であることが示されています。
次に、PDGFR-αの濃縮を確認するために定量的PCRを行います。得られたプロットは、解離した脳細胞と比較してPDGFR-αの有意な濃縮を示すニューロンマーカーであるTuj1の発現をほとんど示していません。GFAP、Mog、Mbpなどの他のマーカーすべてについてほとんど発現していないことを示す同様の結果が得られ、PDGFRαの濃縮を示しています。
次に、ChIP配列ライブラリーの品質を解析します。エレクトロフェログラムは、ライブラリPCR産物のサイズ選択後、250〜500塩基対の範囲のOlig2転写因子の明確なピークを表しています。ここでは、ヒストグラムはタグのクローナリティを示しており、ピークコールの前に取得された品質管理メトリックを検証しています。
このバーは、リードの90%以上が1つのゲノム位置のみにマッピングされていることを示しています。次に、主要なフラグメント長に対応する濃縮されたピークを示す鎖相関プロットが得られます。プロットでは、赤い線は50塩基対での読み取り長と130塩基対でのフラグメント長を表しており、高品質のデータを示しています。
一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば3日で行うことができます。この技術は、その開発後、研究者が初代細胞や希少細胞の転写因子やその他のタンパク質のゲノムワイドなDNA結合部位を探索する道を開きました。このビデオを見れば、イムノパニングによってマウスの脳から初代OPCを精製する方法や、少ない細胞数でChIP-seq実験を行う方法についてよく理解できるはずです。
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概要
本研究では、急性に精製した脳オリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）におけるオリゴデンドロサイト転写因子2（Olig2）のゲノムワイドな結合を解析するためのプロトコルを提示します。この手法には、少細胞数でのクロマチン免疫沈降（ChIP）、ハイスループットシーケンシング、およびバイオインフォマティクスによるデータ解析が含まれており、細胞分化に関与する転写調節とエピジェネティックなメカニズムの理解を深めることを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- ゲノミクス
- 細胞分化
- 転写調節
背景
- オリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）は、中枢神経系における髄鞘形成に不可欠です。
- Olig2などの転写因子の結合パターンを理解することで、分化プロセスの知見を得ることができます。
- 本プロトコルは、一次細胞における転写ダイナミクスの研究を容易にします。
- 少数の細胞で解析可能であることは、サンプル量が限られている研究において有利です。
研究目的
- OPCにおけるOlig2のゲノムワイドな結合を解析すること。
- 転写調節を研究するための堅牢な手法を実証すること。
- OPC分化に影響を与えるエピジェネティックなメカニズムに関する知見を提供すること。
使用した手法
- 主なプラットフォームとして、少細胞数クロマチン免疫沈降（ChIP）とハイスループットシーケンシングの組み合わせを利用しています。
- 生物学的モデルには、マウス脳から急性的に精製したOPCを用いています。
- 主要な工程には、細胞精製のためのイムノパニング、およびChIPのための一連の遠心分離とインキュベーション手順が含まれます。
- 重要な工程として、抗体の効果的な結合を確実にするための架橋とクロマチンのせん断が行われます。
- 解析は、シーケンシングデータを処理するためのバイオインフォマティクス手法によってサポートされています。
主な結果
- このプロトコルにより、ゲノム全体におけるOlig2の結合パターンの解析が可能になります。
- OPC分化における転写調節およびエピジェネティックな影響に関する知見が得られます。
- 得られた知見は、神経疾患における脱髄再形成プロセスのより深い理解につながる可能性があります。
- 本手法は、同様の条件下で他の転写因子を研究する際にも有用であることが示されています。
結論
- 本研究により、初代神経細胞における転写因子のダイナミクスの詳細な解析が可能になります。
- 本プロトコルが、さまざまな転写因子や少数の細胞集団に対しても汎用性があることが示されました。
- これらの知見は、細胞分化のメカニズムおよび潜在的な治療標的への深い理解に寄与します。
よくある質問
業界における重要性
本手法は、希少な初代細胞におけるゲノムワイドな転写因子結合解析を可能にし、神経発達および神経変性疾患プログラムにおけるターゲット検証の主要なボトルネックを解消します。細胞数の制限を克服することで、オリゴデンドロサイト分化経路におけるOlig2などのリネージ特異的転写因子のメカニズム的なリスク低減を支援します。このアプローチは、生理学的に関連のあるシステムにおいて転写調節を細胞運命決定に結びつけることで、早期創薬における予測の信頼性を向上させます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 転写因子Olig2のゲノム結合能を解析することで、オリゴデンドロサイト前駆細胞の分化決定におけるその役割を明らかにできる。
- 実用的な価値： 少量の一次細胞に適用可能であり、in vitroでの増幅を行うことなく、急性的に精製された細胞集団における転写因子の研究が可能となる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： アッセイの標準化および再現性の評価に適した、定量的でゲノムワイドな結合データを取得できる。
- 実用的価値： 最少20,000個の細胞からシーケンス可能なライブラリを構築でき、転写因子のダイナミクスのスケーラブルなスクリーニングが可能となる。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値：一次OPCにおけるOlig2結合をマッピングすることで疾患関連のシステムモデリングを支援し、再髄鞘化バイオマーカー戦略に有用な情報を提供します。
- 運用的価値：エピジェネティックに基づいた転写プロファイリングを通じて、発見から前臨床検証までの連続性を確保します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲットの仮説検証からリード化合物の同定に至るディスカバリー・コンティニュアムに適合しており、特にグリア生物学における転写因子駆動型のプログラムに有用です。
- 探索生物学：天然の細胞コンテキストにおけるOlig2-DNA相互作用をマッピングすることにより、仮説検証およびパスウェイの解明をサポートします。
- スクリーニング：結合条件の比較を可能にする定量的なChIP-seq出力により、アッセイの準備を可能にします。
- 解析：90%以上のユニークリードマッピングを伴う信頼性の高いゲノムピークコールを提供し、条件間の比較を容易にします。
- トランスレーショナルリサーチ：一次神経細胞におけるエピジェネティックなメカニズムの知見を通じて、前臨床段階への継続性を構築します。
- 企業レベルの再利用：転写因子や一次細胞の種類を問わず、低細胞数ChIP-seqに幅広く適用可能なプラットフォームとして設計されています。
運用および企業への影響
- 科学的価値：希少な一次細胞において直接的な結合部位のマッピングを可能にすることで、転写調節におけるメカニズム的な曖昧さを軽減します。
- 運用の価値：低インプットのChIPワークフローを標準化し、希少細胞群を研究する研究室間での再現性を向上させます。
- 戦略的価値：創薬の初期段階でエピジェネティクスに基づいた標的検証データを提供することで、Go/No-Go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響：疾患関連細胞におけるゲノムワイドな結合忠実度に基づき、転写因子標的のリスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の考慮事項
- イムノパニング、クロマチン操作、および次世代シーケンシングライブラリ調製に関する専門知識が必要です。
- クロマチン断片化のための超音波破砕装置および磁気ビーズを用いた免疫沈降インフラストラクチャに依存します。
- 再現性のあるChIP効率を得るためには、抗体バリデーションおよび洗浄ストリンジェンシーについて、チーム間での標準化が必要です。
- モデルシステム間で適応させるには、多様な一次組織に合わせた細胞固定およびライシス条件の最適化が必要です。
- 実用的制限：入力DNA量はPCRサイクル数およびライブラリの複雑性に直接影響するため、アーティファクトを避けるための正確な定量が必要です。
バイオファーマに関するよくあるご質問
Chapters in this video
0:04
Title
1:10
Purification of PDGFRα Positive Oligodendrocyte Lineage Cells from Mouse
5:03
Low-cell ChIP Preparation and ChIP Library Construction for High-throughput Sequencing
9:41
Results: Use of ChIP Analysis to Study Genome-wide Binding of the Olig2 in OPCs
11:42
Conclusion
