記録と電極アレイに結合された齧歯動物の脳スライスにおけるてんかん活動の変調

この方法は、てんかん治療のための神経調節の分野における重要な疑問、例えば、どの脳領域や刺激プロトコルが最適かなど、答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、げっ歯類の脳スライスが脳回路の単純化された現実的なモデルを表しているのに対し、微小電極アレイは既知の電極間距離で複数の観察点を可能にすることです。MEAを準備するには、エラストマーシーラントを記録チャンバーの底面に均等に広げ、気泡がないことを確認します。

次に、ピンセットを使用して記録チャンバーをMEAに取り付け、穏やかな圧力をかけます。記録室の外側の境界の周りにシーラント層を広げます。次に、MEA/チャンバーアセンブリを密閉された湿った環境に置き、室温で一晩硬化させます。

録音ベンチを準備するには、温浴を摂氏32度に設定します。次に、保持ACSFを保持チャンバーと予備加温チャンバーに注ぎます。95%の酸素と5%の二酸化炭素の混合物で溶液を泡立て、閉じ込められた気泡を逆パスツールピペットで取り除きます。

保持室を室温に保ち、予熱室を温かい浴槽に入れます。標準的な手順に従って水平海馬-皮質脳スライスを準備し、室温で少なくとも60分間保持チャンバーで回復させます。4AP ACSFをインキュベーションチャンバーに注ぎます。

次に、95%の酸素と5%の二酸化炭素の混合物で泡立て、閉じ込められた気泡を逆パスツールピペットで取り除きます。その後、チャンバーを覆い、温かいお風呂に移します。温暖化前のACSFと4APのACSFの温度が摂氏30〜32度であることを確認してください。

逆ガラス製のパスツールピペットを使用して、1つの脳スライスを予備加温チャンバーに移し、組織を25〜30分間休ませます。次に、脳スライスを4AP ACSFインキュベーションチャンバーに移し、60分間休ませます。4AP ACSFを灌流チューブを通ってビーカーに流し、内部に空気が入らなくなるようにします。

次に、溶液の流れを停止します。ドライMEAチップをMEAの内側に置きます amplifier、そして固定します amplifierヘッド。その後、プラスチック製のパスツールピペットを使用して、4AP ACSFを記録チャンバーの入口と出口のリザーバーに移します。

加熱カニューレを磁気ホルダーに固定し、その先端を記録チャンバーの入口ポートの内側に置きます。次に、磁気ホルダーをMEAの磁気ストリップに取り付けます amplifierヘッド。灌流チューブをカニューレに接続し、カニューレをサーモスタットに接続します。

その後、吸引針を出口リザーバーに入れます。吸引針をACSFに沈めて負圧があることを確認し、低周波吸引音が一定でないか確認してください。次に、フローレギュレーターを1分間に1ミリリットルの流量を許容するように設定し、灌流を開始します。

4AP ACSFがカニューレを通って流れたら、サーモスタットをオンにします。加熱カニューレを摂氏37度に、MEAベースを摂氏32度に設定して、記録チャンバー内の温度を摂氏32〜34度にします。次に、外部参照電極を記録チャンバーインレットリザーバーに配置します。

4AP ACSFレベルと記録温度が必要に応じて安定したら、灌流ストップコックと吸引ストップコックをオフの位置に回して一時的に停止させます。倒立ガラス製パスツールピペットを使用して、1つの脳スライスをMEA記録チャンバーに素早く移します。必要に応じて、ファイヤーポリッシュでカールしたパスツールピペットまたは柔らかくコンパクトな小さなブラシを使用して、MEA記録エリアでの位置を調整します。

ホールドダウンアンカーをブレインスライスに置きます。灌流と吸引を再開するには、ストップコックをオンの位置に戻します。倒立顕微鏡ステージに取り付けられたカメラを使用して、脳のスライスを撮影します。

次に、コンピュータソフトウェアでスクリプトmapMEAを実行して、電極をマッピングするためのGUIを起動します。[参照]ボタンをクリックして、脳のスライスの画像をロードします。参照電極がMEAの左半分の上部の列に表示されていることを確認します。

次に、[ポインタのアクティブ化]ボタンをクリックします。アレイの左端の列で上部と下部の電極を選択して、画像の矯正と電極マッピングのXY座標をマークします。スライス タイプのドロップダウン メニューから [Horizontal] を選択します。

「デフォルト構造」チェックボックスにチェックを入れます。ブレインスライス画像の下にある番号付きのプッシュボタンを使用して、ROIに対応する電極を選択し、構造パネルの対応するプッシュボタンをクリックして電極を割り当てます。ROI ごとにこの手順を繰り返します。

その後、保存ボタンを押します。ソフトウェアは、選択した電極とROIを報告するテーブルを含む結果フォルダを生成します。電気生理学研究では、刺激プロトコルの少なくとも10分前に刺激ユニットをオンにして、自己校正と安定化を可能にします。

次に、刺激制御ソフトウェアを起動し、刺激制御ソフトウェアのメインパネルにある緑色のLEDで示されているように、刺激装置とMEAアンプが正しく接続されていることを確認します。バイポーラ構成で刺激を設定します。刺激ユニットを地面に接続します。

次に、CA1/近位下細胞の錐体細胞層と接触している電極ペアを、スクリプトmapMEAでマッピングされた電極ペアの中で接続します。データを取得するには、録音ソフトウェアのメインパネルにある再生ボタンを押します。少なくとも 4 回の発作放電を記録します。

次に、高速入力/出力テストを実行して、最適な刺激強度を特定します。これを行うには、メインパネルを使用して、位相あたり100マイクロ秒の持続時間を持つ正方形の二相性正負電流パルスを設計します。[パルス振幅]タブで、位相ごとに100マイクロアンペアの初期パルス振幅を入力します。

刺激パルスを0.2ヘルツ以下に設定するには、パルス間間隔を5秒以上追加します。刺激が海馬傍皮質で発作間欠性のようなイベントを確実に呼び起こすことができるまで、各試行で刺激振幅を50〜100マイクロアンペアステップ増加させます。大脳辺縁系の発作発生の電気的調節のために、目的の刺激プロトコルを送達するように刺激ユニットをプログラムし、入出力テスト中に特定された刺激振幅を使用します。

刺激が停止した後、少なくとも 4 回の発作放電を記録して、刺激前の状態へのネットワークの回復を確認します。この図は、制御条件、1ヘルツでの周期的なペーシング、および刺激離脱時の回復中の嗅内皮質および鼻周囲皮質における4AP誘発性発作活性の記録を示しています。このグラフは、1ヘルツでの周期的なペーシングの効果を定量化したもので、刺激中の総捕捉時間が大幅に減少したことを示しています。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば3〜4時間で完了します。この手順を試行する際は、脳スライスをMEAに迅速かつ正確に配置することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、てんかん様活動および神経調節の効果に対する神経伝達物質またはイオンチャネルの寄与に関する追加の質問に答えるために、薬理学的操作などの他の方法を実行することができます。

この技術の開発後、この技術は、神経科学の分野の研究者が、健康と病気におけるニューロンネットワークの相互作用を、培養ニューロンや脳スライスで探求する道を開きました。このビデオを見れば、MEAに結合したげっ歯類の脳切片で4-アミノピリジンによって誘発されるてんかん様活動を記録し、電気的に調節する方法を十分に理解できるはずです。