Name: 記録と電極アレイに結合された齧歯動物の脳スライスにおけるてんかん活動の変調 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学ぶ マイクロ電極アレイを用いた齧歯動物脳スライスにおける4-アミノピリジン誘発てんかん活動の記録と電気変調法。神経回路動態とてんかん治療戦略の理解に貢献します。

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測定は、神経生理学の調査のための貴重なツールし、探査と開発の数十年のおかげで近年の成熟度に達しています。従来のフィールド電位計測と比較して測定は観測点と既知の電極間距離、神経ネットワークの相互作用を正確に特定することが重要である数の増加の大きな利点を提供しています。
MEA の記録技術は、パッチ ・ クランプ記録15、単一ニューロンと神経ネットワークの活動の関係を調査するなど、他の電気生理学のアプローチにも結合できます。さらに、電位とマルチ ユニットの活動を同時に可視化する可能性は小さい神経細胞集団の活動と集団的神経回路の相関に貴重な洞察力を提供できます。膜電位感受性色素、カルシウム イメージング、および光遺伝学29との組み合わせは、多面体のアプローチを用いた神経生理現象を推定できます。薬理学的研究に加えて記録と同じシステムでの刺激の両方の実行の可能性、MEA 記録技術非常に強力で汎用性の高い: たとえば、シナプス可塑性の現象を研究することが可能です、てんかん、各種脳疾患の治療に DBS に関連している記憶形成30、今回紹介したニューロモデュレーション プロトコルを使用してのコア。てんかん脳組織16に MEA 記録技術を正常に適用できる最近の証拠を示しててんかん研究、この破壊的な病気を根本的なメカニズムを理解する両方の非常に貴重な有用性それを改善する DBS アルゴリズムを微調整します。
ただし、MEAs 強制的に脳スライス、水中録音室の要件と脳をさせるための必要性のための '制限' 条件下での電気生理学実験の追求、固体基板上の残りの部分をスライス、微小電極統合されています。したがって、脳組織に録音の質を影響可能性があります十分な酸素の供給を受信できません。
ここで説明されているプロトコルは、信頼性の高い記録し、研究の急性の in vitro における 4AP モデルを用いた測定と結合した齧歯動物の大脳辺縁系ネットワークの発作原性と電気刺激の評価に関連する情報を提供する長期の新紀元を追求するにはDBS のポリシー。
従来のフィールド電位計測の使用に基づくてんかんの辺縁系ネットワークの電気ニューロモデュレーションに関する先行研究と同様の結果24,25; マウスまたはラット脳スライスを使用しています。しかし、ラットの脳組織の使用証明より挑戦的、合理的にマウス7から得られた脳組織に比べて弱い接続のため。MEA の技法に関してマウス脳切片は、サイズが小さいおかげで最適です。また、ラット脳組織対マウスの発作のような放電の発生の高い率を考えると、それはより速くより効率的なデータ収集は順番に、1 つの実験日全体に比べ脳スライスをテストしすることがでくことが可能使用される動物の数を減らします。
既存のメソッドの意義:
ここで説明されているカスタムのチャンバーを使用して記録された発作時の放電期間と従来の MEA リング商工会議所と同じ MEA 型 (平面微小電極、 cf. 17) を使用して観察された発生率に似ているように表示されます。しかし、それがため実験ニューロモジュレーションの成功を追求を妨げる可能性があります低灌流率 (1 mL/分)、と共に従来のラウンド記録室を用いたとき、脳スライス厚が大幅削減しなければならないと強調する必要貧しい人々 に接続します。
このプロトコルでは少量カスタム記録室パッチ ・ クランプ記録室のデザインに触発さは、MEA の録音の成功の追求のために不可欠な安定性と信頼性の層流を提供します。それはまた組織生存率と固有の接続との間の適正なトレードオフを達成するために 400 μ m まで脳スライス厚を増加させます。それは確かに認識されてチャンバ内録音ソリューションを層流が脳スライス生理望ましい温度、酸素の影響を受けませんので、循環型で観察される pH 勾配ラウンド記録部屋19,20,31 (のような市販の MEA で提供されている)。このようなグラデーションと脳スライスに有害も実験的先入観を紹介します。灌流中の適切な交換を可能にする高灌流率 (5-6 mL/分)16,31と共に比較的小さなボリューム (~1.5 mL) の記録室 (3 回/分)。カスタムの商工会議所は簡単にすることができます手頃な価格で商業ソースから取得または 3 D 印刷技術を利用して生成されます。他の研究は、低騒音の蠕動ポンプの助けを借りてから 400 μ m 厚脳スライス16高灌流率 (5-6 mL/分) を実施し、1 mL にアプライドのボリュームを保ちながら従来の MEA リング チャンバーを用いた MEA 録音を報告しています。しかし、著者が細胞外の K+濃度の有意な増加を含む ephaptic 機構の 4AP モデルよりも影響が少ない可能性がある発作原性,すなわち, 低 Mg2 +の別のモデルを使用しています。11,22. 高灌流率はアプライド16記録大幅に増加する必要があります蓄積された細胞外 K+のうち高速洗浄のための 4AP モデルでは望ましくないことがわかった。実際には、発作時のイベント登場より 'チャンク' ASCF 灌流の速度は 2-3 mL/分に増加したし、脳スライスはアプライド厚で水没した堅牢な強直間代コンポーネントを展示する本格的な放電に戻った時に復元するのに対し低灌流率 (1 mL/分) と薄くアプライド層組織表面のレベル (データは示されていない) に右の。このプロトコルで記述されているカスタム記録室灌流中に 3-5 回を交換が可能/1 mL/min の流速で分。したがって、脳スライスへの全体的な酸素供給がまだ安定した温度と高い信号対雑音比を記録を保証しながら比較的低灌流率でも強く向上しました。最も重要なは、生理学的な値に細胞外の K+濃度を維持することが可能です。
発作原性の 4AP モデル低下 Mg2 +または増加 K+などのアプライド イオン組成のどんな重要な修正は不要し、興奮性と抑制性の伝達をそのままに保つためのユニークな利点を提供しています12グルタミン酸と gaba 作動性てんかん同期 (cf. 7) ネットワークの両方の重要な役割に照らしててんかん研究で関連性の高いである側面。このプロトコルで使われる 4AP アプライドでは、生理的 K+濃度 (3.25 mM) と持株アプライド (1.3 mM と 1 mM) よりも若干低い Mg2 +濃度を含まれています。この濃度はまだ齧歯動物の脳脊髄液中の Mg2 +濃度の報告された生理学的な値の範囲内にあり、(例えば見なさい17,18) 多くの実験室で使用されます。説明プロトコルの目的に、我々 は 4AP の効果で支援するためにこのわずかな減少を好むことを発見しました。
前作には既に記録室17,18中置かれていたとき、脳スライスに 4AP が適用されています。実験者は 4AP アプリケーションとてんかんパターンの発症との間の時間遅延を観察する必要があります、しない限り、我々 はこのアプローチがかなり時間がかかるし、長期記録と刺激セッションを追求する適していないを見つけるこのプロトコルで説明します。32 ° C で 4AP で脳スライスの中古インキュベーションは、脳スライスは他の組織切片を用いた実験を追求しながらシリーズで前処理することができますので多く実験の時間を節約できます。
脳スライスの長期生存率は、長期的にネットワーク機能を分析すると便利かもしれません。また、反復的な刺激への回復力向上は、実験者は、統計の信頼性の同じ脳スライスで実行する必要がありますいくつかの刺激のプロトコルを比較したい場合の大きな利点のです。私たちの手で制御フェーズでそれぞれ先行 3 刺激プロトコルをテストする場合、回復期に続いて、実験は 3-5 h を最後可能性があります。このコンテキストでライブ MEA マッピングが正しい経路をアクティブにして抑制ではなく電気刺激による発作原性を支持するために重要です。ユーザーフレンドリーな GUI は、異なる脳構造の電極をマップする、簡単迅速かつ柔軟なツールを表します。商用ソフトウェアに反してプログラミングの基本的なスキルもカスタム MEA レイアウトを追加することが可能です。明るいフィールドに画像を得ることができます。従って、良好な解像度を持ち、顕微鏡に収まる任意の汎用カメラは適しています。これらは正立型顕微鏡を使用している場合は、組織の下に隠しだろうので脳スライスを基準電極位置を視覚化する倒立顕微鏡が欠かせません。ただし、ステレオ顕微鏡は、倒立型に加えては、実験者は、特定の神経経路を妨害するナイフ カットを実行する必要がある場合に推奨されます。
最後に、提案手法のさらなる利点は安価で比較的簡単なアセンブリのカスタム記録室と保持チャンバー、温かいお風呂とスライス アンカーとしての高価な不必要な使用のような必要なツールのほとんどの低騒音蠕動性ポンプ。
技術の制限:
MEA の記録は非常に遅い波、すなわち可視化を許可しません、DC 信号でシフトします。このようなベースラインのたわみは発作時の放電時間の漸近的に測定を助けるかもしれないし、最も重要な皮質拡散うつ病 (現象てんかん32の突然の予想外の死に関連して、共有されるを勉強する基礎です。間てんかんや片頭痛33)。
電気神経について脳スライスの生存率に影響を与えずにいくつかの刺激のセッションを実行できるようにここで説明されているプロトコル。20-45 分、以前作業25に報告したものと同様の最大 3 つの刺激セッションを正常に実行できます。脳スライス刺激セッションまたはより長い刺激プロトコル数の増加に耐える可能性がありますおそらくが脳スライスはこの点ではテストしませんでした。3 刺激プロトコルの数を制限して回避する長期大幅刺激撤退時に回復の不足までのこれらの制限条件下で維持される脳組織に重点を置くことができる (≥60 分) 刺激セッションをお勧めします。
プロトコルの中で重要なステップ:
いくつかの重要な要因には、レコーディングの成功を追求、MEA と結合した脳スライスにおけるてんかん活動の変調を妨げる可能性があります。ほかに使用される齧歯動物種と脳スライス、記録中に灌流率の品質、アプライドの流れのダイナミクス (すなわち層流円形と) 記録チャンバ内であることが回復の条件と。脳スライスの長期のメンテナンスだけでなく、4AP アプリケーションのモードは、最も重要な手順です。
浸漬保持チャンバーを用いた脳組織のネットワーク活動を維持し、4AP アプリケーションによる発作のような放電の誘導を支持するために室温で脳スライスを保存することが重要です。私たちの手で回復および 32 ° C でメンテナンス脳組織スライスの 3-4 時間以内に悪化してください。
脳のインキュベーションを室温で 4AP アプライドでスライスし、32 ° C での記録は、しかし、好ましくはないです。この状態で堅牢な再発発作放電を観察することで多くの難しさがわかりました。確かに、20-24 ° C の範囲で低温を弱めるかも 4AP 誘発発作原性、生体内および34 35を体外と両方を防ぐに報告されています。したがって、4AP インキュベーションおよび記録温度は 30-34 ° C に該当する必要があり、一致する必要があります。4AP と脳スライスの突然の暴露での興奮性亢進の同時誘導のためあまりにも多くのストレスの下で脳組織が室温から暖かい (32 ° C) 4AP アプライドへ置くことを避けるため、中間にあらかじめ温暖を実行する基本的なです。ステップと脳スライスは、このステップをスキップして 20-30 分の 4AP によって発作原性誘導に影響を与える可能性があります 32 ° C で持株アプライドで慣らします。
言及する必要がありますもう一つの側面は、スライス後、アプライド D グルコース濃度の重要性です。25 mM 濃度維持脳スライスよりも多くの実験室で使用されている 10 mM の濃度とは 2 倍速く発作活動の発生率も向上 (したがって、やすく実験の長いシリーズを追求するにはいくつかの脳スライス各日のプロトコル)。
最後に、スライスの処理中にいくつかの重要な細部は、言及する必要があります。まず、許可しない、そのままの脳と脳スライス切断アプライド寒さで凍結します。脳を低温 < 2 分は十分なマウス脳の小さいサイズを与えられました。切片は、室温にリンスのビーカーにバッファー トレイからすぐに移送すべき。切断を洗浄アプライドは高糖度が保持室のナイロン メッシュに固執するスライス脳になるそれ以外の場合非常に重要です。組織を効果的にすすぎにアプライドの持株を過度に汚染しないように転送ピペット内の切削アプライド コンテンツを最小限にすることが重要です。2 段階洗浄汚染を最小限に抑えることに役立ちます。スライスの手順が完了したら、組織切片に転送してくださいすぐにすすぎビーカーからソフト ナイロン メッシュのアプライドにより組織の酸素化、両側保持で中断された半分の方法、開催商工会議所。スライスの手順に従ってすべての段階に適用される同じ原理: 脳スライスはビーカーの底に座っているか、保持室の側面と接触することはできません、彼らは決してお互いに接触するはずもオーバー ラップ。
変更とトラブルシューティング:
アプライドの組成は、実験者のニーズに応じて変更すること。たとえば、特定の神経伝達物質や電気神経調節の効果イオン チャネルの貢献を分析する薬を追加可能性があります。さらに、ピルビンとアスコルビン酸 (参考: 表 2) 省略されるかもしれません、我々 を見つける強力な神経保護役割を出すが。表 3にこのプロトコルと、それらに対処する方法で発生することができます最も一般的な問題を報告する.
結論:
MEA の記録は間違いなく健康および病気の神経ネットワークの相互作用に対処するための貴重な技術であります。薬理学的研究に加えて、DBS てんかんと他の神経疾患に適用に関連する電気ニューロモデュレーション プロトコルを評価することが可能ですも。このプロトコルでは我々 は従来の細胞外フィールド電位計測で得られるものと同様の結果を持つ典型的な周期の刺激実験を再現することが可能、外部の刺激電極である示されています。業務用の使いやすい機器と高度なソフトウェア ツールの増加空室状況作る MEA 記録技術脳組織へとアドホックの刺激を提供するために、閉ループ刺激実験にも最適神経ネットワークの応答のフィードバック機構の貢献度を調査します。

てんかんは、脳の1; の自由な活動を引き起こす生命を脅かす進行性の障害それは病気および重要な社会的な汚名2,3の最も高い負担の間で運ぶ。TLE は最も頻繁に症候群 (40%) と最もよく (~ 30%) 抗てんかん薬4に耐性。てんかん組織の外科的切除は、患者さんの状態を改善するかもしれません、それすべての患者で現実的ではないと5完全に発作のない生活を保証しないかもしれない。薬物治療や脳神経外科が最適でない場合、電気 DBS によるてんかんの辺縁系ネットワークの変調、有望なアプローチです。
齧歯動物の脳のスライスは、彼らを少なくとも一部、元のアーキテクチャおよび脳の接続に保存電気生理学技術の in vitroによる健康と病気6どのように神経ネットワーク機能を研究するための貴重なツール利益 (率 ROI) の地域。特に、水平結合された海馬内嗅皮質 (海馬-EC) スライス TLE に関わる重要な神経ネットワークを構成して、したがって、定期的に体外TLE 研究7で採用されています。
人工髄液 (アプライド)、カリウム8,9,10を増加させながらマグネシウムの減少などのイオン組成を変更することによって急性発作のような活動脳スライスで誘導することがありますか抑制性の gaba 作動性活性をブロックするなどの薬理学的操作による (11包括的なレビューを参照してください)。ただし、これらのモデルは、興奮と抑制; のアンバランスの変質に基づいていますしたがって、彼らは相互作用と発作原性に興奮性と抑制性ネットワークの協調的貢献を勉強とは認めない。痙攣薬 4AP と脳スライスの持続灌流がそのまま全体的にシナプスの活性を保ちながら急性発作原性を研究するように、興奮性と抑制性の神経伝達を高める12。
測定できる空間的な制約ことができる電極の数を制限、従来の細胞外フィールド電位計測と比較して観測点の大きい数から神経ネットワークによって生成された電気活動を記録脳スライス面に収容されます。さらに、MEA チップの既知の電極間距離をトレース伝播に非常に便利です追加の利点を提供し、記録された信号の進行速度を評価します。培養神経細胞13,14からの録音の最初の着想、MEAs 今も使用目的は齧歯動物15と人間16から得られた急性脳スライスの電気生理学的特徴を特徴付けます。つまり、てんかん研究のコンテキスト、Mea は発作原性16,17,18の中核神経ネットワークの相互作用を特定するための貴重なツールを表します。
しかし、MEA 記録は本質的に取得または長時間 (数時間) 実験的プロトコル全体の安定したてんかんパターンを維持する技術的な課題を運ぶ。まず、組織酸素化がない大きい内になりぐるぐる水没型記録室19,20市販 MEAs の典型的な貧しい信号対雑音比と温度不安定性に影響を与える可能性があります。(たとえばテクニカル ノートの参照暖房と灌流装置21) 脳スライスへの酸素供給を改善するために使用する高灌流率 (6-10 mL/分) 録音の品質。水没型記録室19; を使用する場合、てんかん放電などの高周波成分を備えた第二に、再発の放電が観察されるほとんどこれは、特に急性てんかんパターンが化学的に誘導され、ephaptic メカニズムが含まれます 4AP モデル22のためのケースである (11の包括的な概観を参照)。これらの制限を克服するために研究者によっていくつかの方法が提案されています。たとえば、脳スライス厚 (≤300 μ M) とエリア17,18を削減しながら灌流率19,20を増加する組織に十分な酸素供給を達成するために重要な要因であります。さらに、改善脳スライスの生存率は、両方の側面の18から脳組織を灌を許可する穿孔 Mea (pMEAs) を使用しても実現できます。
説明のアプローチは、脳スライスから MEA 記録の可能性を改善している大幅に対し彼らがテストされていないに対して長時間 (数時間)、後者を表す重要な記録と電気刺激セッション脳組織のストレス。長期にわたるレコーディング セッションは、短期的な測定によるマスクを解除することはできませんてんかんパターンの特定の機能の時間の進化を研究する必要があります。DBS 研究においては、長期にわたる実験的プロトコルを評価し、同じ脳スライス内のいくつかの刺激パラダイムの効果を比較する必要があります。
自発の電気活動だけが投資収益率を基準電極のマッピングを記録する必要がある場合、通常データ分析; 中には事後、すなわち、行われます代わりに、誘発または電気ニューロモデュレーション パラダイムの研究は、刺激が、実験中に迅速かつ簡単なライブ電極マッピングの必要性を口述特定 ROI(s) に配信されることが必要です。
ここでは、我々 は大人の齧歯動物の脳切片で安定した 4AP 誘発てんかんパターンの誘導と維持は、簡単な実験プロトコルを示しています。観測活動は、従来の細胞電気生理学手法の特徴としてこのモデルの電気生理学的特徴を忠実に再現します。それは数時間持続して繰り返し長時間新紀元の持続的な電気刺激を長持ち。維持し、脳スライスをインキュベート室組み立てることができます簡単に標準的な実験室の供給 (図 1 a) を使用して最適なソリューション為替レートと流 (図 1 b) を可能にするカスタム録音室ができるに対し商業ソースから取得する、または手頃な価格の 3 D 印刷技術を使用しています。リアルタイム監視、および刺激的な電極の選択 ROI(s) の迅速なマッピングは、 mapMEA、自由にリクエストを名前付きカスタム ユーザーフレンドリーな GUI で可能です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57548/57548fig1.jpg"> 図 1: このプロトコル用のカスタム装置。(A) 回復済み温暖化、4AP で前培養室は、ビーカー、シャーレを使用して組み立てている保持。ペトリ皿はブレーカーより直径の小さい、シリンジのプランジャーによって行われています。ペトリ皿の底は、ペトリ皿の縁にシアノアクリ レート接着 (ソフト ストッキング) からナイロン メッシュに置き換えられます。酸素は、ペトリ皿の壁とビーカーの間挿入曲がった脊髄針 (22 G) を介して提供されます。泡は、ビーカーと決してリーチ脳スライス変位を避けるためにナイロン メッシュの側から浮上する必要があります。シャーレの上部は、アプライドの蒸発を避けるために、酸素飽和度を維持、蓋として使用できます。(B) カスタム記録室。: 暖房カニューレ及び参照電極に合わせて入口貯水池。うち: 吸引針に合わせて出口貯水池。rec: レコーディング室。 (C) ガラス パスツール ピペット、火研磨によってカール組織を処理し、記録室内での位置を調整するために使用します。 (D) カスタム スライス ホールド アンカー。(E) 記録室の最終組立は、MEA チップに搭載。脳スライスは、アンカーによって行われての下にかかっています。赤の矢印は赤マル印参照電極、インレット タンクのアプライドで水没した飽和 KCl ペレットに対し暖房カニューレをカバー PTFE チューブ。青の矢印の出口貯水池の吸引針。<a href="/files/ftp_upload/57548/57548fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table><tbody><tr><td>ポリ-D-リジン&nbsp;</td><td>MEAコーティングに必要な</td><td>シグマアドリッチ</td><td>P7886</td></tr><tr><td>NaCl</td>シ<td>グマアドリッチ</td><td>S9888化学</td><td></td></tr><tr><td>薬品KCl</td><td>シグマアドリッチ</td><td>P9541</td><td>化学薬品</td></tr><tr><td>KH<サブ>2</サブ>PO<サブ>4</サブ></td><td>シグマアドリッチ</td><td>795488</td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>CaCl2*2 H2O</td> シ<td>グマアドリッチ</td><td>C3306</td><td>化学</td></tr>薬品 <tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma-Adrich</td><td>RDD016</td><td>化学</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Adrich</td><td>S5761</td><td>化学</td></tr><tr><td>薬品 MgCl2*6 H2O</td><td>Sigma-Adrich</td><td>M2670</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>MgSO4*6 H2O</td><td>Sigma-Adrich</td><td>M5921</td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>シグマ-アドリッチ</td><td>RDD023</td><td>化学</td></tr><tr><td>ピルビン酸、98%&nbsp;</td><td>シグマ・アドリッチ</td><td>107360</td><td>化学</td></tr><tr><td>4-アミノピリジン</td><td>シグマ・アドリッチ</td><td>A78403</td><td>けいれん薬</td></tr><tr><td>STG-2004</td><td>マルチチャンネル システム</td><td>STG4004-1.6mA</td><td>4 チャンネル刺激発生器 電圧付き (&plusmn;8 V)および電流出力(&plusmn;1.6 mA)</td></tr><tr><td>MEA1060</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td>N/A</td><td>MEA amplifier</td></tr><tr><td>planar MEA</td><td>Multichannel System</td><td>60MEA500/30iR-Ti w/o ring</td> カスタム<td>録音チャンバー</td></tr><tr><td>McRack</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td></td><td>録音ソフトウェア</td></tr><tr><td>McStimulus II</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td></td><td>STG4004制御ソフトウェア</td></tr><tr><td>TC02</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td>TC02</td><td>2チャンネルサーモスタット</td></tr><tr><td>PH01</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td>PH01</td><td>加熱灌流カニューレ</td></tr><tr><td>MPH&nbsp;</td><td>マルチチャンネル・システム</td><td>MPH&nbsp;</td><td>PH01と吸引針用のマグネットホルダー</td></tr><tr><td>エラストスティル E43</td><td>ワッカー</td><td>E43</td><td>エラストマー シーラント カスタム記録チャンバーを MEA MEA</td></tr><tr><td>カスタム チャンバー</td><td>クリセル インスツルメント</td><td>SKE チャンバー MEA</td><td>カスタム記録チャンバー</td></tr><tr><td>Ag/AgCl 電極、ペレット、1.0 mm&nbsp;</td><td>Crisel Instrument</td><td>64-1309</td><td>カスタムレコーディングチャンバー用参照電極</td></tr><tr><td>Tergazyme</td><td>Sigma-Adrich</td><td>Z273287-1EA</td><td>酵素クリーナー</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>エレクトロデマッピングのプログラミング環境</td></tr><tr><td>VT1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S</td><td>Vibratome</td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>64-1309</td><td>Ag-AgCl電極ペレット1.0mm(E205)。参照電極。</td></tr></tbody></table>

記録と電極アレイに結合された齧歯動物の脳スライスにおけるてんかん活動の変調

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

側頭葉てんかん (TLE) は、最も一般的な部分複雑なてんかん症候群と薬に応答性が最小です。薬理学的治療の障害や、脳神経はお勧めしませんが、脳深部刺激療法 (DBS) は有望なアプローチです。微小電極アレイ (Mea) と結合した急性期脳スライスは、電気刺激による神経ネットワークの相互作用とその変調を研究するための貴重なツールを表します。従来の細胞外記録法と比較すると彼らは観測点と既知の電極間距離、伝搬経路とスピード, 電気生理学の勉強をするのより多くの利点を提供します。通知します。ただし、組織酸素化が MEA 記録、減少した信号対雑音比と高い振動実験温度を犠牲にして来る高灌流率を必要とする時に大きく損なわれます。電気刺激をさらに難しく長期記録/刺激の新紀元を追求する脳組織に重点を置きます。また、脳スライスの電気変調は、電極マッピング簡単かつ迅速にライブ中に実行する実験を必要とする脳スライス内の特定構造/経路を対象とする必要があります。ここでは、4-アミノピリジン (4AP) の記録と電気変調を実行する方法を示します-プロポフォ平面測定の使用齧歯動物脳スライスを誘発。マウスから得られた脳組織ラット脳組織よりも優れているし、MEA の実験に適していますこのようにことを示す.このプロトコルは、世代と忠実に従来フィールド電位計測による電気生理学的特徴を再現、数時間持続する、長持ちする安定したてんかんパターンのメンテナンス維持保証します。電気刺激による長期新紀元。実験を通して組織の生存率は、層流と低 (1 mL/分) でもクイック ソリューション exchange 灌流率を可能にする少量のカスタム記録室の使用のおかげで達成されます。リアルタイムの監視と刺激電極の選択クイック MEA のマッピングは、カスタム グラフィック ユーザー インターフェイス (GUI) によって実行されます。

微小電極アレイを用いたげっ歯類脳スライス 4 アミノピリジン誘発てんかん活動の記録と電気変調を実行する方法を示します。カスタム記録室は、長期の実験的セッションを通して組織実行可能性を維持します。電極マッピングをライブ、刺激的なペアの選択は、カスタム グラフィカル ユーザー インターフェイスによって実行されます。

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

この方法は、てんかん治療のための神経調節の分野における重要な疑問、例えば、どの脳領域や刺激プロトコルが最適かなど、答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、げっ歯類の脳スライスが脳回路の単純化された現実的なモデルを表しているのに対し、微小電極アレイは既知の電極間距離で複数の観察点を可能にすることです。MEAを準備するには、エラストマーシーラントを記録チャンバーの底面に均等に広げ、気泡がないことを確認します。次に、ピンセットを使用して記録チャンバーをMEAに取り付け、穏やかな圧力をかけます。記録室の外側の境界の周りにシーラント層を広げます。次に、MEA/チャンバーアセンブリを密閉された湿った環境に置き、室温で一晩硬化させます。録音ベンチを準備するには、温浴を摂氏32度に設定します。次に、保持ACSFを保持チャンバーと予備加温チャンバーに注ぎます。95%の酸素と5%の二酸化炭素の混合物で溶液を泡立て、閉じ込められた気泡を逆パスツールピペットで取り除きます。保持室を室温に保ち、予熱室を温かい浴槽に入れます。標準的な手順に従って水平海馬-皮質脳スライスを準備し、室温で少なくとも60分間保持チャンバーで回復させます。4AP ACSFをインキュベーションチャンバーに注ぎます。次に、95%の酸素と5%の二酸化炭素の混合物で泡立て、閉じ込められた気泡を逆パスツールピペットで取り除きます。その後、チャンバーを覆い、温かいお風呂に移します。温暖化前のACSFと4APのACSFの温度が摂氏30〜32度であることを確認してください。逆ガラス製のパスツールピペットを使用して、1つの脳スライスを予備加温チャンバーに移し、組織を25〜30分間休ませます。次に、脳スライスを4AP ACSFインキュベーションチャンバーに移し、60分間休ませます。4AP ACSFを灌流チューブを通ってビーカーに流し、内部に空気が入らなくなるようにします。次に、溶液の流れを停止します。ドライMEAチップをMEAの内側に置きます amplifier、そして固定します amplifierヘッド。その後、プラスチック製のパスツールピペットを使用して、4AP ACSFを記録チャンバーの入口と出口のリザーバーに移します。加熱カニューレを磁気ホルダーに固定し、その先端を記録チャンバーの入口ポートの内側に置きます。次に、磁気ホルダーをMEAの磁気ストリップに取り付けます amplifierヘッド。灌流チューブをカニューレに接続し、カニューレをサーモスタットに接続します。その後、吸引針を出口リザーバーに入れます。吸引針をACSFに沈めて負圧があることを確認し、低周波吸引音が一定でないか確認してください。次に、フローレギュレーターを1分間に1ミリリットルの流量を許容するように設定し、灌流を開始します。4AP ACSFがカニューレを通って流れたら、サーモスタットをオンにします。加熱カニューレを摂氏37度に、MEAベースを摂氏32度に設定して、記録チャンバー内の温度を摂氏32〜34度にします。次に、外部参照電極を記録チャンバーインレットリザーバーに配置します。4AP ACSFレベルと記録温度が必要に応じて安定したら、灌流ストップコックと吸引ストップコックをオフの位置に回して一時的に停止させます。倒立ガラス製パスツールピペットを使用して、1つの脳スライスをMEA記録チャンバーに素早く移します。必要に応じて、ファイヤーポリッシュでカールしたパスツールピペットまたは柔らかくコンパクトな小さなブラシを使用して、MEA記録エリアでの位置を調整します。ホールドダウンアンカーをブレインスライスに置きます。灌流と吸引を再開するには、ストップコックをオンの位置に戻します。倒立顕微鏡ステージに取り付けられたカメラを使用して、脳のスライスを撮影します。次に、コンピュータソフトウェアでスクリプトmapMEAを実行して、電極をマッピングするためのGUIを起動します。[参照]ボタンをクリックして、脳のスライスの画像をロードします。参照電極がMEAの左半分の上部の列に表示されていることを確認します。次に、[ポインタのアクティブ化]ボタンをクリックします。アレイの左端の列で上部と下部の電極を選択して、画像の矯正と電極マッピングのXY座標をマークします。スライス タイプのドロップダウン メニューから [Horizontal] を選択します。「デフォルト構造」チェックボックスにチェックを入れます。ブレインスライス画像の下にある番号付きのプッシュボタンを使用して、ROIに対応する電極を選択し、構造パネルの対応するプッシュボタンをクリックして電極を割り当てます。ROI ごとにこの手順を繰り返します。その後、保存ボタンを押します。ソフトウェアは、選択した電極とROIを報告するテーブルを含む結果フォルダを生成します。電気生理学研究では、刺激プロトコルの少なくとも10分前に刺激ユニットをオンにして、自己校正と安定化を可能にします。次に、刺激制御ソフトウェアを起動し、刺激制御ソフトウェアのメインパネルにある緑色のLEDで示されているように、刺激装置とMEAアンプが正しく接続されていることを確認します。バイポーラ構成で刺激を設定します。刺激ユニットを地面に接続します。次に、CA1/近位下細胞の錐体細胞層と接触している電極ペアを、スクリプトmapMEAでマッピングされた電極ペアの中で接続します。データを取得するには、録音ソフトウェアのメインパネルにある再生ボタンを押します。少なくとも 4 回の発作放電を記録します。次に、高速入力/出力テストを実行して、最適な刺激強度を特定します。これを行うには、メインパネルを使用して、位相あたり100マイクロ秒の持続時間を持つ正方形の二相性正負電流パルスを設計します。[パルス振幅]タブで、位相ごとに100マイクロアンペアの初期パルス振幅を入力します。刺激パルスを0.2ヘルツ以下に設定するには、パルス間間隔を5秒以上追加します。刺激が海馬傍皮質で発作間欠性のようなイベントを確実に呼び起こすことができるまで、各試行で刺激振幅を50〜100マイクロアンペアステップ増加させます。大脳辺縁系の発作発生の電気的調節のために、目的の刺激プロトコルを送達するように刺激ユニットをプログラムし、入出力テスト中に特定された刺激振幅を使用します。刺激が停止した後、少なくとも 4 回の発作放電を記録して、刺激前の状態へのネットワークの回復を確認します。この図は、制御条件、1ヘルツでの周期的なペーシング、および刺激離脱時の回復中の嗅内皮質および鼻周囲皮質における4AP誘発性発作活性の記録を示しています。このグラフは、1ヘルツでの周期的なペーシングの効果を定量化したもので、刺激中の総捕捉時間が大幅に減少したことを示しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば3〜4時間で完了します。この手順を試行する際は、脳スライスをMEAに迅速かつ正確に配置することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、てんかん様活動および神経調節の効果に対する神経伝達物質またはイオンチャネルの寄与に関する追加の質問に答えるために、薬理学的操作などの他の方法を実行することができます。この技術の開発後、この技術は、神経科学の分野の研究者が、健康と病気におけるニューロンネットワークの相互作用を、培養ニューロンや脳スライスで探求する道を開きました。このビデオを見れば、MEAに結合したげっ歯類の脳切片で4-アミノピリジンによって誘発されるてんかん様活動を記録し、電気的に調節する方法を十分に理解できるはずです。

recording-modulation-epileptiform-activity-rodent-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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