Name: 勉強する人間の T 細胞のリコール反応体内吸引水疱プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 学ぶ吸引水疱皮膚リコール法による抗原特異的T細胞とサイトカインの採取技術。ヒトの適応免疫応答を非侵襲的に研究し、ワクチン開発や免疫学の理解に貢献します。

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彼の実用的な学術の助言; マッズ Radmer ジェンセンに感謝したいと思いますラウ lindqvist 氏と技術的な専門知識とスキルを提供するための Kaare Svejstrupヘレーネ ・ Bæk Juel、ジョナサン実際に Filskov、Signe t. シュミット、ソルヴェイグ ・ w ・ Harpøth の彼らのテクニカル サポート;ゲントフテ TB 外来 PPD 管理; 彼らの訓練のスタッフ研究に参加するすべてのボランティア。このプロジェクトは、欧州委員会 H2020 プログラム [許可番号 TBVAC2020 643381] によって資金を供給し、有意義な議論のためのコンソーシアムのパートナーに感謝したいと思います。

人間のボランティアの使用を含む、以下に述べるすべての方法は、デンマークのデータ保護局 (jr.nr. 2015-57-0102) 健康研究倫理 (H-15002988) デンマーク委員会によって承認されています。PPD は、人間の使用のために承認し、製造元から提供される適切な投与量で投与認定製品をする必要があります。投与量または投与の任意の偏差がありますその他の倫理的な承認とボランティアがインフォームド コンセントを与える必要があります。
1. ツベルクリン反応検査
<ol><li>ボランティアからの口頭および書面によるインフォームド コンセントを取得します。注入前にボランティアを理解でき、可能な限り副作用を含むプロシージャを確認します。 注: このプロトコルに固有の選択基準は、> 18 歳、文書化された BCG 予防接種です。研究の質問に応じて基準が異なる場合があります (すなわち、掲載基準が正の TST の証拠をあることができる)。</li>
	<li>人間用 [20 ツベルクリン単位 (TU)/mL] PPD の既製のソリューションを使用します。アルコール綿棒を使用バイアルのゴム栓を消毒します。</li>
	<li>注射部位を準備します。<ol>
<li>ボランティアの前腕の腹側に注射部位を探します。</li>
		<li>平面に腕手のひらアップを置き、前腕、肘関節から約 5-10 cm の上から 3 番目のエリアを選択します。傷、静脈、または損傷した皮膚の明確なまま。</li>
		<li>アルコール綿棒を使用して領域を消毒します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PPD 溶液を調製します。<ol>
<li>1 mL 滅菌注射器を使用、27-30 G/短い (例えば、12 mm) 針を固定します。</li>
		<li>ゆっくり混ぜるし、PPD 溶液 0.1 mL を熱望します。目に見える気泡がないことを確認してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PPD 皮内注射 注: この手順は、単一 PPD 蒸着を行う方法を説明しますが、同じ腕の PPD の複数の証言があります。ただし、これは特定の倫理的な承認を必要があります。<ol>
<li>皮膚を伸ばすし、上向き傾斜で 5 ~ 15 ° の角度で針を皮膚にポイントします。</li>
		<li>皮膚の真皮層に針の先端を挿入し、先端がほぼ表皮を通して見えるかどうかを確認します。</li>
		<li>PPD 溶液 0.1 mL をゆっくりと注入します。 注: 正しく管理されている場合 6-10 mm の薄い丘疹が表示されますすぐに。丘疹は、約 10 分後に消えます。</li>
		<li>2 つ以上の調書を作るときは、注射部位の肘と手首の領域からの良い距離を保ちながら最大分離 (5-10 cm) を目指してください。 注: この皮膚テストの応答の潜在的な合流を防ぎ、吸引両院の連続測位を可能に。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 3 日目 - 皮膚反応の評価
<ol><li>48-72 時間後の皮膚反応の大きさに注意してください。硬結 (腫れ) を測定していない反応の紅斑 (発赤)。</li>
	<li>ハードを触診指を使って腫れし、ボールペンを使用して硬結の端をマークします。定規を使用して硬結径を測定し、mm の結果に注意してください。 注: 硬結径の読書は、吸引のオリフィス径の選択をガイドがあります。</li>
</ol>3. 吸引水疱誘導 - 7 日目
<ol><li>吸引装置を組み立てます。 注: デバイス単位で吸引、吸引水疱誘導用添付チャンバーと真空ポンプです。このデモで使用されているデバイスは、カスタムが、吸引装置ユニットも市販されています。ポンプは-20-40 kpa の範囲内で調節可能な安定性と信頼性の否定的な圧力を提供する必要があります。このメソッドを使用して実験を行う前に地域の倫理的な承認を取得必要があります。<ol>
<li>まず、底面オリフィス プレートとチャンバーと接続ホース窓板を組み立てることによって吸引を準備します。真空ポンプ室接続ホースにしっかりと取り付けます。 注: 部屋は、人間の皮膚との接触に適してする必要があります、ブリスター誘導用穴付き底板、ブリスターのビジュアル監視を可能にするウィンドウのトップ プレートを含める必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>皮膚反応のサイズを基準にしてオリフィス プレートの最適なオリフィス径を決定します。オリフィスのサイズが大きくなるほどのブリスター。</li>
	<li>オリフィス プレートやボランティアの皮膚消毒アルコール綿棒を使用します。</li>
	<li>皮膚に吸引を取り付けます。<ol>
<li>ボランティアの腕は快適に休んでいることを確認します。</li>
		<li>吸引部の底板の穴は PPD 反応にして皮膚反応の中心が表示されることを確認します。</li>
		<li>ストラップ緩くチャンバーを確保: 否定的な圧力を適用すると、商工会議所が肌にくっつくし、地位を維持します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>吸引装置をオンにして-20 kpa の圧力を調整します。</li>
	<li>30 分後-25 kPa に負の圧力を高めます。</li>
	<li>60 分後さらに-30 kPa に負圧を上げます。</li>
	<li>水疱が完全に形成されるまで-30 kPa の圧力を維持します。このプロトコルで提供される負圧がカスタマイズされた楽器に固有であることを確認します。他の設定でプロトコルを適用するときに、圧力を少し調整する必要があります。 注: ブリスター誘導フェーズ範囲 60 ~ 180 分 (1-3 h) ブリスターの発生は、しばしばかゆみ感覚関連付け最後 30 分内で発生する実際の水疱形成とです。単一または複数のマージ水疱と水疱が発生します。かどうかブリスター破裂や出血が発生します、ゆっくりと圧力を解放してブリスター誘導を終了することを助言します。</li>
	<li>水疱が完全に形成された後、圧力を解放、水疱が破裂せず皮膚から吸引を慎重に取り外します。</li>
	<li>周辺皮膚の柔らかいドレッシングを適用し、水疱をハード キャップ (例えば、50 mL プラスチック チューブから) を配置します。</li>
	<li>柔らかい伸縮性のある包帯が続く非アレルギー サージカル テープでキャップを固定します。</li>
	<li>次の 12-24 時間のブリスター エリアに過大な物理的な負担を避けるためにボランティアを指示します。</li>
</ol>4 水疱液 - 8 日目の収穫
<ol><li>8 日目に優しく保護ドレッシングを削除し、皮膚消毒スプレーで水疱を消毒します。</li>
	<li>水疱内容を収穫するのに 23 G 針で 2 mL 滅菌注射器を使用します。ブリスター屋根の上・横側に針を挿入し、ゆっくりと液体を吸引します。空洞の床に触れないように、すべての流体を収穫することを確認します。</li>
	<li>折りたたまれたブリスターにあてがいます。</li>
	<li>生殖不能の管に水疱液を転送します。ボリュームに注意してください。</li>
	<li>600 x g 卓上遠心分離機を用いた 4 分でダウン水疱液をスピンします。</li>
	<li>上清を別のチューブに転送し、500 μ L の細胞培地で細胞ペレットを再懸濁します。 注: セルはカウント、さらに分析する準備が整いました。清は、使用するまで-20 ~-80 ° C で保存できます。</li>
</ol>5. 吸引の解析ブリスター細胞や体液
注: セルと皮膚吸引水疱から得られた流体の解析手順を提供してこのプロトコルの範囲内ではありません。しかし、このレポートの代表的な結果を提供するために細胞内染色の流れ、フローサイトメトリーおよびマルチプレックス解析を行った。方法論を簡単に説明します。
<ol><li>フローサイトメトリー<ol>
<li>Ppd ファイルの 10 μ G/ml と 1 BCG 接種ボランティアから吸引水疱から分離された 1 × 105新鮮な細胞の懸濁液を刺激し、37 ° C および 5% で細胞をインキュベート CO2.処理並列培養細胞が含まれます。</li>
		<li>1 x 106 PBMCs は 10 μ g/ml の ppd ファイルの 1 BCG 接種ボランティアから得られた懸濁液を刺激し、37 ° C で 5% 混合物を孵化させなさい CO2.処理並列培養細胞が含まれます。</li>
		<li>2 時間後、Brefaldin A とモネンシンのすべてのセルを扱うし、37 ° C で 6 時間それらを孵化させなさい</li>
		<li>ライブ/死者-汚れ-BV510、抗 CD4 AF780、抗 CD3 BV421、抗 CD8-PerCP Cy5.5、アンチ CCR7 PE、アンチ CD45RA BV786、反 IFN-γ AF700、アンチ-TNF-α-PE-Cy7、抗 IL-2 FITC のパネルと細胞を染色します。</li>
		<li>PBMC パネルで FMO コントロールが含まれます。</li>
		<li>流れの cytometer で、フローサイトメトリーによる解析を行い、関連するソフトウェアを使用して結果を分析します。</li>
		<li>サイトカイン産生 cd 3 + cd 4 +/cd8-サブセット次ゲート方式のゲート: シングレット - > 実行可能な CD3 + - > cd 4 +/cd8 - - > IFN-γ +、TNF-α + または IL-2 +。</li>
		<li>次のゲートの戦略を使用してエフェクター メモリ セル人口のゲート: シングレット - > 実行可能な CD3 + - > cd 4 +/cd8 - - > CCR7 - CD45RA-。</li>
		<li>論理ゲートを使用して個々 のサイトカイン プロファイルを計算します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サイトカインのリリースのデモ<ol>
<li>サイトカインのデモは、生体内でリリースは、IL-2、IFN-γ、TNF-α、イリノイ州のレベルを定量化するマルチプレックス解析を使用-10、および 4 のボランティアから解凍吸引水疱液で IL 13。</li>
		<li>得られる細胞のサイトカインのリリースのデモ吸引水疱ex vivo、使用新鮮な吸引水疱細胞、PBMCs 1 BCG 接種ボランティアから得られます。</li>
		<li>PBMC に感染しMtb H37Rv の 100 コロニー形成単位 (CFU) ブリスター細胞を吸引し、4 日間それらを孵化させなさい。</li>
		<li>マルチプレックス解析を使用して、IL-2、IFN-γ、TNF-α、イリノイ州のレベルを定量化する-10、およびすべての培養上清中 IL 13。</li>
		<li>上計算制限に試金の計算範囲の上調整します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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本稿では、人間の免疫記憶応答の体内吸引水疱誘導による皮膚の抗原のリコールと細胞の収穫を使用して研究のための実用的な手順について説明します。TST は、皮内反応用抗原沈着と BCG ワクチン リコールの例として使用されました。最後に、エフェクター記憶表現型の抗原特異的多官能性 T 細胞が大体 SB 細胞の 3 分の 1 を示す提供フロー フローサイトメトリーおよび多重サイトカイン解析による SB 標本特性の例であった。
このプロトコルの重要なステップは、皮内注射法、吸引水疱誘導水疱穿刺をなど。まず、正しい皮内沈着訓練された人材が必要です。不適切な沈着は、最適ではない結果を招くことができます。PPD は一般的によく知られている、安全な皮膚抗原が、その組成比較13,20の制限、メーカーによって異なります。このレポートは、2 火の単一の皮内沈着と倫理的な承認を追加する必要があります必要に応じて 2 つの並列調書 (2 x 2 TU) について説明します。しかし、他の研究を使用している 10 TU 強い皮膚反応10、21の可能性を高める。SB の誘導段階では、負圧の小さな段階的増加は出血とふくれ破裂の危険性を減らします。赤い血液細胞や、血液中から白血球の混入の可能性は一般的に低い2です。無菌穿刺法が微生物汚染を防止し、破片や居住者の皮膚細胞の不純物を低減穿刺針と皮膚ブリスター床との接触を避けること。しかし、一部の研究者はパンクのブリスター10圧延圧力を適用することで SB 液を収穫する好みます。水疱内の隔壁に穴を開ける必要があります。SB 技術自体は低侵襲です。折りたたまれた SBs は傷つかないで直るし、感染症は非常にまれです。2ただし、ハイポ色素沈着の程度が発生して、SB 誘導はコロイド瘢痕化の歴史を持つ人々 におそらく避けるべき。
技術的な制限は、合計セルの低利回りと長期保存のためその結果限られた選択肢に含まれます。白血球収量、臨床の TST 応答、ブリスター サイズおよび赤血球汚染関係がされている別の場所2,10徹底的に説明。ここで示した BCG リコールの実験です (図 1)、各ブリスターから中央総収量 50,000、SBCs は勉強だけで15場合は特に、これらの細胞を使用して小規模な実験の設定を意味でした。ただし、SB サンプルで特定の T 細胞の人口はほとんど両方の相対と絶対のセルのカウントの PBMC サンプルで見つけたものは超えています。図2 の例で、100,000 SB 細胞のサンプルのトリプル正 PPD 特異 T 細胞数、番号で 1 × 106 PBMCs 同じドナー (データは示されていない) からより大きい x 2 以上であった。TST 反応の視覚的得点結核メモリの評価のための最も一般的な臨床方法です。注記のうち、基になる適応免疫反応は臨床皮膚反応2,21と同時に最高になりません。ないすべて BCG 接種またはMtb-被曝者、強い TST 反応や分類、および調査の人口の既存抗酸菌の鋭敏化と同様、レスポンダー、TST 以外からのサンプルの処理のための戦略を開発このメソッドを使用してリコール試験を開始する前に考慮する必要があります。また、SB サンプリングと視覚的得点による削減皮膚反応を持つ個人で理論的なバイアスの可能性があるか、例えば、HIV 感染症、特定の年齢層の2で見られる免疫障害のある皮膚関連 13,18,20。さらに、試験を繰り返して TST 反応の免疫学的後押しはよく知られている20,22です。ただし、Tst が繰り返し10SB 細胞の表現型はむしろ一定のまま。この観測は、細胞性免疫応答の縦断研究で SB リコールの役割をサポートします。
T 細胞免疫の抗原特異的細胞の高画分の収穫の SB リコールことができます。ただし、PPD 蒸着からサンプリングの SB のタイミングは重要な細胞構成とサイトカイン微小環境が時間とともに変化。このプロトコルでは水疱だった誘導 7 日後チャレンジと分離細胞主に cd4 エフェクター メモリー T 細胞細胞の IFN-γ、TNF α や IL-2 の共発現での分数高を含みます。これらの観測は、分化、増殖、活性化 T 細胞が皮膚の PPD 先読み2,15、21のしくみを説明する先行研究に沿っています。PPD 増個人で SB 速度論は、非常に初期の皮膚反応特定; が示唆されました。ただし、既に内 PPD 挑戦に続く最初の日、応答になる cd 4 + T 細胞 (両方の中央のメモリとエフェクターのメモリ表現が記載されている) によって支配されるおよび、3 日後の応答はの高い分数によって支配されます。PPD 特異サイトカインが cd 4 + T 細胞2,8,10,15,21を生産します。この適応サイトカイン応答のまま 2 週間2,8,10,23以上の検出です。日 7 ポスト TST は、2メモリ cd 4 + T 細胞の生産するサイトカインのコレクションのための最適な時点で表示されます。ただし、他時間ポイントは、抗原や関心のある応答に応じて関連はもちろんです。ノートでは、1 つの研究での適応性が PPD 反応は 5 日ポスト TST10で既にプロ炎症性サイトカイン分泌の減少ともう少し早くピークに報告されています。
SB 液には、炎症性サイトカインと皮膚微小環境15,24を代表する示されている他のタンパク質の高レベルが含まれています。動態研究、TNF α や IFN-γ レベル SB 流体ピークで IL-2 レベルのピーク中 3 日後 7 日間2,10後、おそらく適応応答の優位性を反映して、この後の段階で示されています。SB 細胞は、生体内で活性化されている、ので、彼らは高い自発的なサイトカインのリリースとして (図 3および4) メモリセルの再刺激により特定のリリースの可能性を示します。
このレポートは、cd 4 + T 細胞免疫に焦点を当てください。図 2に示す、孤立した T 細胞の大半は実際にあった cd4、あったほとんどない cd 8 + T 細胞吸引ブリスター流体。これは他の SB PPD リコール研究レポート低比率と cd 8 + T 細胞 cd 4 + T 細胞2,8,10,23と比較して劣る渡り鳥容量に沿ってです。Cd8 貢献のさらなる評価は望ましいのでしょうただし、これはこのレポートの範囲を超えています。
T 細胞はMtb; の免疫の制御のために不可欠と見なされますただし、血液25,26から適応免疫応答に反映される保護の信頼性の高いとの相関関係を識別することは困難だった。この障害は、現在大規模な非常に高価な効力試験27に代替がない、厳しく新しい結核ワクチンの開発を妨げています。結核ワクチン開発者は、小さなと一時的な血液28,29ワクチン特定の T 細胞集団の変化を評価することによってワクチンの免疫原性を決定します。しかし、それは疑わしい循環血液の抗原特異的 T 細胞のごく一部が関連するかどうか (すなわち、感染制御する T 細胞豊富な微小環境の代表的な部位への移行が可能Mtb)27,30,31.
以前の研究と提示されたデータに基づいて、SB 皮膚リコール モデルはワクチン特定の T 細胞の研究のための潜在的な可能性を表します。だけでなく、モデルはワクチン生成された応答十年前のリコールを有効にする、それはまた組織に固有のコンテキストの15,18,19、21の潜在的な真のメモリの評価を可能します。小説、候補サブユニット結核ワクチンの抗原も構成を含めるには、特定の皮膚テストでは、このモデル28,32を使用してワクチン評価のための新しい機会をお勧めします。さらに、トランスクリプトーム解析は、細胞性免疫応答 PPD 挑戦皮膚の生成がMtbの反応に似ていることを提案する-感染肺18。
また皮膚パンチ生検、皮膚から細胞収穫を可能にするし、SB サンプリングと比較して、空間情報を提供するメソッドはもっと侵襲と単一細胞懸濁液33を準備する酵素やメカニックの処理が必要です。サイトカインと細胞マーカーの測定は、2 つの方法2,10間比較。
吸引水疱メソッドが既に皮膚科のほか医学研究の多くの分野で適用されている単独で、または全身あるいは皮膚の挑戦との組み合わせで。などの敗血症、エプスタイン ‐ バーウイルス関連リンパ増殖性疾患、糖尿病性ニューロパチー、グルココルチコイド摂取の効果、治療用抗体や T 細胞標的療法10 のためのモデルをテスト人間の臨床試験研究、34,35,36,37,38。
治療の観点から SB 皮膚再生法は潜在的な中央の T 細胞の記憶を研究するユニークな利点を提供していますと -の視点、皮膚が関連するサンプリング コンパートメント2を提供するよう両方生物から、技術的な 15,18,19,21。SB 皮膚再生法 PBMCs の循環の伝統的なパッシブ サンプリングと比較して、特に、自分の関連する抗原に対する反応のリンパ節から移行し、ローカルを完了する能力を証明している T 細胞の研究のため可能します。拡張は、生体内で組織固有コンテキスト15,18,19、21の分化。
結論としては、モデルを示したここで研究者人間の適応免疫の T 細胞ターゲット エージェント (すなわち、伝染病ワクチン学やがん研究) フィールド内の関連するかもしれない。このプロトコルに適用される TST モデルはもちろん、結核ワクチン学の分野で特別な関連性の。ただし、このモデルの基本概念は、研究の他の分野で応用性です。

皮膚の SB は人工的に誘導されたブリスター、細胞や皮膚から直接流体の収穫を可能にします。真空で SBs を上げる技術は健康と病気1,2,3,4,5,で皮膚免疫学の研究に使用される皮膚科の分野でよく知られているツール6,7,8します。 このレポートは、皮膚抗原リコール (SB 皮膚再生法) と組み合わせて SB 技術が適応免疫応答の生体に直接洞察力を提供する方法を示します。
SB 誘導の背後にある原理は簡単です: 光真空が皮膚の小さな領域に適用されます。否定的な圧力は最終的に満ちている流体セル1,2,9ローカルまめを作成する、真皮から分離する表皮が強制されます。水疱液を穿刺吸引によって収穫できるし、さらに研究生体外のコンテンツを使用できます。
近年、SB体内免疫疾患皮膚10,11に制限以外の研究法が注目されています。人間の免疫の研究は、細胞や関心のサイトカインを末梢血からサンプリング容認できないと非倫理的なリンパ節や消化管粘膜組織の侵襲的なサンプリングがあるため、事実によって制限されます。例はワクチン接種12後長命の人間記憶 T 細胞応答の研究です。このような試験で免疫に関与する細胞の関連する人口はリンパ系組織に存在するため、関連する T 細胞のサンプリングは大きな挑戦をすることができます、特定の T 細胞数が非常に限られた末梢血液中を循環します。
SB 手法では、メモリー T 細胞の研究にユニークな機会やその他特定の細胞集団を提供しています。抗原の皮膚予防接種に伴った抗原の特定の T 細胞は皮膚にそのリンパの隠れ家から採用され、SB から簡単にサンプリングすることができます。アクバルらによって記述されていたこの皮膚モデルの方法論と研究アプリケーション20132。皮膚のリコールのための一般的に使用される抗原は市販の精製タンパク質誘導体 (PPD) 抗酸菌実行ツベルクリン皮膚試験 (TST)13, PPD を皮膚の真皮層に注入する場所に使用します。抗原沈着の結果 [例えば、結核菌(Mtb) 感染症や細菌カルメットゲラン桿菌 (BCG) 接種個人] PPD に向けて既存免疫記憶を持つ個人、肌と PPD 特異 cd4 T 細胞2,11,14,15の体内のクローン性増殖に移行と応答を思い出してください。その結果、PPD 特異多官能性の高い分数 cd4 T 細胞は SB サンプリングの準備ができて肌に蓄積されます。このメソッドによって収集された T 細胞は堅牢なことがわかって、イムノアッセイの範囲と長期の in vitro培養15に特徴付けられる十分に豊富です。したがって、皮膚リコール モデルおよび SB 誘導前のヴィヴォ解析による生体内でT 細胞応答を検討する貴重な方法を証明するかもしれないし、このアプローチの知識の増加は、細胞免疫学に興味を持つ研究者ワクチン学。
このレポートでは、人間の皮膚 PPD 注射皮膚に吸引水疱を誘導する方法について最初の段階的なガイドを提供します。皮膚の抗原リコール モデルは、BCG 予防接種のボランティアで、TST を使用して示されています。最後に、関連する前のヴィヴォ解析細胞やサイトカイン SB によって分離は例示.SB 手法によって得られる PPD 特異 T 細胞の表現型および機能特性が徹底的に16,1711,2,10、、、を別の場所に説明18,19します。 このレポートは、他の研究グループによるこの技術のアプリケーションを容易にするための方法論の実践的および免疫学的側面について議論することを目的とします。

<table><tbody><tr><td>実験室用手袋</td><td>Imtex, Denmark</td><td>1013</td><td></td></tr><tr><td>消毒スプレー&nbsp;</td><td>Apotek、デンマーク</td><td></td><td>82%アルコール、グリセリン、人間の皮膚用&nbsp;</td></tr><tr><td>アルコールスワップ</td><td>メディク、デンマーク</td><td>1131892</td><td></td></tr><tr><td>PPD RT 23 "SSI" (2 T.U./0.1ml)</td><td>AJ Vaccines</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;固定針付きMyjectorシリンジ&nbsp;</td><td>テルモ</td><td>A236</td><td>1ml/29G/12mm</td></tr><tr><td>定規&nbsp;</td><td>関係</td><td></td>ありません<td>&nbsp;皮膚反応評価用</td></tr><tr><td>ボールペン</td>は<td>関係</td><td></td>ありません<td>&nbsp;皮膚反応評価用</td></tr><tr><td>ポータブル肺吸引ユニット</td><td>Laerdal Medical, Denmark</td><td>78000011</td><td>NOTE.&nbsp;-40kPa未満の範囲用に変更され、圧力計が付属しています&nbsp;(参照1031107) 技術部、Hvidovre病院</td></tr><tr><td>負圧チャンバーアセンブリ、接続チューブで非加熱</td><td>Electronic Diversities、Finksburg、MD、USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オリフィスプレート、47mm、10mm穴</td><td>Electronic Diversities、Finksburg、MD、USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>負圧計シールキット</td><td>Electronic Diversities、Finksburg、MD、USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>負圧チャンバーストラップ&nbsp;</td><td>Electronic Diversities、Finksburg、MD、USA12</td><td></td><td>インチ</td></tr><tr><td>Micropore外科用テープ</td><td>&nbsp;3M</td><td>1533-1</td><td>2.5cm x 9.1m</td></tr><tr><td>キャップ 15ml プラスチックチューブ</td><td>Sarstedt, Germany</td><td>62,547,254</td><td></td></tr><tr><td>Tubigrip 包帯</td><td>M&ouml;lnlycke Health Care、スウェーデン</td><td>1443</td><td></td></tr><tr><td>Cosmopor 滅菌接着ドレッシング</td><td>Hartmann</td><td>9008337</td><td>7.2 x 5 cm</td></tr><tr><td>2ml シリンジ 同心円ルアー スリップ&nbsp;</td><td>ベクトン・ディキンソン&nbsp;</td><td></td><td></td>300185</tr><tr><td>Microlance 23G/30mm needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>300700</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock microcentrifuge tubes (オートクレーブ)</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp;0030120086</td><td>オートクレーブ滅菌済み</td></tr><tr><td>Minispin plus 遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5453000011</td><td></td></tr><tr><td>Gibco AIM V Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12055-091</td><td></td></tr></tbody></table>

勉強する人間の t 細胞のリコール反応体内吸引水疱プロトコル

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

皮膚の抗原リコール モデル人間の記憶の応答in vivoの研究を可能にします。皮膚吸引水疱 (SB) 誘導と組み合わせると、このモデルは、抗原特異的 T 細胞の代表携帯電話のメモリの応答だけでなく、サイトカイン微小環境、その場の特殊な集団にアクセシビリティを提供します。
このレポートでは、皮膚再生、SB 誘導、抗原特異的 T 細胞の収穫の実践的な手順について説明します。この研究の前に、細菌カルメットゲラン桿菌ワクチンの感染を受けた人における抗原再生メソッドを実証するため、ツベルクリン反応検査を使用結核。最後に、SB 標本の多重化、フローのフローサイトメトリーによる解析の例、血液から分離した細胞と比較してこのサンプリング法による抗原特異的多官能性 cd 4 + T-細胞利用の高い分数を示すものです。
ここで説明する方法は安全かつ低侵襲、両方自然免疫と適応免疫応答は生体内で、勉強するユニークな機会を提供します、細胞性免疫能と人間を扱う研究者の幅広いコミュニティに有益である可能性があります。ワクチン開発のコンテキストで、メモリの応答

8 健康な成人ボランティア (年齢の中央値: 30 年: 26 43 年) 文書化された前 BCG 予防接種 (BCG 予防接種の期間の中央値: 5.5 年の範囲: 1-30 年) 含まれていた。参加者は、PPD TST 評価 3 日目に続いての 2 火と掻きに挑戦しました。SBs は 7 日目に誘発され、8 日目に収穫し、オリフィス径が 10 mm 吸引水疱チャンバを使用してすべての水疱が提起されました。7 人の個人は 2 並列 SB 帰納法に続いて同じ腕で 2 独立した PPD 予防接種を同時に与えられた (プロトコルの手順 1.4 以下複数の PPD 沈着に関する注記を参照してください)。末梢血は、密度勾配遠心法によるプラズマと PBMCs 分離のため 7 日目に描かれました。SBs からプラズマ ・流体の清が-20 ° C で保管しました。Nigrosine 染色と顕微鏡を用いた新鮮な SB 細胞 (SBCs) が数えられました。
臨床の TST 応答と SBC の収量は、図 1に掲載されています。TST 異物の平均サイズは 10.25 mm (範囲: 0 - 20 mm) ブリスター当たり平均細胞数が 50,000 をされ (範囲: 15,000 210,000 細胞、水疱の数: 15)。ボランティアの 2 つは 2 継次のいずれかのと 15,000 セル/ブリスターの対応する合計セルの低収量の臨床応答がありませんでした。細胞収率は TST の平均臨床応答に関連付けられていた (スピアマンのr = 0.643、 p = 0.094)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig1.jpg"> 図 1: 吸引水疱細胞収率。(、) このパネルを示しています代表 SBs nigrosine 染色細胞の顕微鏡発生 7 日ポスト TST。(b) このパネルは 8 BCG 接種ボランティアで平均 TST 硬結 (mm) とセルの平均収量 (n/blister) 間の関係を示す (水疱の数 = 15)。ドットの個々 の平均測定を表します。0 mm の TST の硬結と 15,000 の細胞収量 2 ボランティアの両方を持っていたと 2 点が重なっていることに注意してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
流動フローサイトメトリー法による SB 特性を示すためには、Sbc が BCG 接種 30 年前にされていた 43 歳のボランティアから得られたし、していたMtb。半角英数字に知られている露出分離されたが, 単一の水疱 (誘導硬結: 1.4 mm/100,000 SBCs)。図 2は、Sbc対PBMCs の細胞内サイトカイン染色の代表的なプロットを示しています。
このボランティア CD3 + cd 4 +/cd8 SBCs の割合から処理細胞で 67% に増加、PPDの in vitro<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig3.jpg"> <img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig4.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig4large.jpg" target="_blank"></a>

ここで、吸引水疱皮膚リコール モデルのデモンストレーションを提供します。モデルは、人間体内適応免疫応答の研究、ワクチン開発のコンテキストでインスタンスに簡単にアクセスできます。

勉強する人間の T 細胞のリコール反応体内吸引水疱プロトコル

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

このビデオの全体的な目標は、in vivoでの適応免疫応答を代表する抗原特異的T細胞とサイトカインを採取できる吸引ブリスター皮膚リコール法を実証することです。この方法は、ヒトの細胞応答と適応免疫の研究に使用できます。この技術の主な利点は、比較的非侵襲的で安全な方法を使用して、免疫反応の部位から直接抗原特異的T細胞を採取できることです。皮膚リコールの基本原理は、抗原を皮膚の真皮層に沈着させることです。抗原の既存の免疫学的記憶を持つ個人では、T細胞は反応部位に移動し、特定のT細胞がクローン的に増殖し、その場で分化する局所免疫応答を誘導します。この反応に吸引水疱を誘導することで、これらの特定のT細胞とin vivoで産生されたサイトカインを採取することができます。このビデオデモでは、リコール抗原としてPPDを使用しています。PPDは、結核菌感染症の診断に一般的に使用されます。しかし、このビデオで見られるように、以前にBCGワクチンを接種した人の皮膚反応も誘発します。ツベルクリン皮膚試験の材料には、アルコール綿棒、27〜30ゲージの短い針が付いた1ミリリットルの注射器、および人間の使用が承認されたPPDの溶液が含まれます。ミリリットルあたり20ツベルクリン単位のPPD溶液を使用してください。アルコール綿棒を使用してバイアルを消毒します。また、メーカーによって構成が異なる場合があることに注意してください。次に、ボランティアの前腕の腹側に注射部位を見つけ、アルコール綿棒を使用してその領域を消毒します。29ゲージ、12ミリメートルの固定針を備えた1ミリリットルの滅菌シリンジを使用してください。0.1ミリリットルのPPD溶液を穏やかに混合し、吸引します。目に見える気泡がないことを確認してください。皮膚にストレスを与え、斜角を上に向けて針を5〜15度の角度に向けます。針の先端を皮膚の真皮層に挿入し、先端が表皮からほぼ見えることを確認します。0.1ミリリットルのPPD溶液をゆっくりと注入します。正しく投与すれば、6〜10ミリメートルの丘疹がすぐに現れます。丘疹は約10分後に消えます。PPDの複数の登録が可能ですが、追加の倫理的承認が必要になる場合があります。2回の注射を行う場合は、肘と手首の部分から十分な距離を保ちながら、最大限の分離を目指します。臨床皮膚反応は最初の24時間以内に現れ、かゆみを伴います。注射後48〜72時間で皮膚反応のサイズを測定します。.反応を評価するときは、紅斑ではなく硬結を測定することが重要です。帽子の腫れを指で触診します。次に、ボールペンを使用して硬結の端に印を付けます。最後に、ソフト定規を使用して硬結直径を測定し、結果をミリメートル単位で記録します。7日後、吸引水ぶくれを誘発する時が来ました。皮膚吸引ブリスターの誘導には、吸引チャンバーが取り付けられた真空ポンプを使用してください。市販のデバイスまたはカスタマイズされたデバイスを使用してください。重要なことは、ポンプはマイナス20キロパスカルからマイナス40キロパスカルの範囲で調整可能で、安定した信頼性の高い負圧を提供する必要があるということです。吸引チャンバーの底部は、皮膚に接触する小さな穴のあるプレートで構成されています。プレートには1つまたは複数の穴があり、皮膚反応に合わせて異なるサイズを適用できます。チャンバーの上部は、ブリスターを視覚的に監視できる必要があります。導入前に、皮膚とチャンバープレートを消毒してください。腕が快適に休んでいることを確認してください。ここで調節可能なストラップを使用して、チャンバーを取り付けて固定します。皮膚反応の中心は、底板の穴を通して見えるはずです。吸引装置の電源を入れ、負圧をマイナス20キロパスカルに調整します。30分後、圧力をマイナス25キロパスカルに上げます。60分後、圧力をさらにマイナス30キロパスカルまで上げます。そして、1つのブリスターが完全に形成されるまで、ここで圧力をかけ続けます。水疱導入フェーズには通常約1〜3時間かかります。実際のブリスター形成は、ここで高速に示されているように、最後の30分以内に徐々に発生します。水疱の破裂や出血の兆候がある場合は、ゆっくりと圧力を解放し、誘発を早期に停止することをお勧めします。ブリスターは、単一または複数のマージブリスターとして表示される場合があります。このプロセスは、しばしばかゆみを伴う感覚と関連しています。ブリスターが完全に形成されたら、圧力を解放し、吸引チャンバーを慎重に取り外します。正しく誘導された水疱では、表皮層は皮膚の真皮層から完全に分離され、液体で満たされた空洞が残ります。周囲の皮膚領域に柔らかい包帯を塗布し、ここでは15ミリリットルのプラスチックチューブから、ブリスターの上にハードキャップを置くことにより、ブリスターを保護します。ノンアレルギー性のテープでキャップを固定し、その後、柔らかく伸縮性のある包帯を巻きます。ボランティアに保護包帯を一晩中保管するように指示します。翌日、ドレッシングを慎重に取り外し、スプレーを使用して水ぶくれ部分を消毒します。23ゲージの針が付いた2ミリリットルの滅菌シリンジを使用して、ブリスターの内容物を採取します。ブリスタールーフの上部側面に針を挿入し、液体をゆっくりと吸引します。キャビティの床に触れないようにしますが、この例のようにブリスターの量が少なくなる可能性があるため、すべての液体を必ず収集してください。崩壊した水ぶくれは傷跡が残らずに治ります。水ぶくれの上に保護ドレッシングを追加します。次に、ブリスター液を滅菌チューブに移します。卓上型遠心分離機を使用して600 Gで4分間スピンダウンします。その後、上清を採取し、細胞ペレットを500マイクロリットルの細胞培地に再懸濁します。これで、新鮮な細胞をカウントし、さらに分析する準備が整いました。吸引ブリスター細胞は、フローサイトメトリーなどのin vitro分析に使用できます。BCGワクチン接種を受けたボランティアを対象としたこの実験では、細胞収量はブリスターあたり15, 000から200, 000を超える細胞の範囲でした。ここでは、1回の吸引ブリスターから細胞を単離し、in vitroでPPDで細胞を刺激した後、染色とフローサイトメトリーを行いました。比較のために、同じPCGワクチン接種を受けたボランティアのPBMCについて並行して分析を行いました。パネルには、TNF-α、インターフェロン-γ、およびIL2の細胞間産生のために染色されたCD4陽性T細胞の集団が見られます。このボランティアでは、皮膚から単離されたCD4陽性T細胞の30%以上が抗原特異的であった。PBMCでは、この割合は1%未満でしたさらに、ブリスター細胞の個々のサイトカインプロファイルは、中枢記憶T細胞とエフェクターT細胞の両方を代表しており、この方法により、in vivoで生成された長寿命の記憶応答をどのように研究できるかを示しています。ここで、図Aは、吸引ブリスターから得られた液体がin vivoで産生されるサイトカインについて分析できることを示しています。図Bでは、吸引水疱から得られた細胞を結核菌の存在下で4日間培養し、吸引水疱細胞が生体外でインターフェロン-γおよびTNFαを産生できることを示しています。このビデオを見れば、皮膚抗原沈着後の吸引水疱から細胞を誘導し、採取する方法についてよく理解できるはずです。このデモンストレーションでは、結核研究の分野で特に関連性のある抗原を使用しました。しかし、この方法論の基本原理は、適応免疫の分野や、T細胞標的薬の研究試験に役立つ可能性があります。また、人間のボランティアと一緒に働く際には、倫理と安全が最優先事項であることを覚えておいてください。また、ヒトサンプルの取り扱いは危険な場合があり、ラボでは常に安全上の注意に従う必要があることにも注意してください。

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Research

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