勉強する人間の T 細胞のリコール反応体内吸引水疱プロトコル

このビデオの全体的な目標は、in vivoでの適応免疫応答を代表する抗原特異的T細胞とサイトカインを採取できる吸引ブリスター皮膚リコール法を実証することです。この方法は、ヒトの細胞応答と適応免疫の研究に使用できます。この技術の主な利点は、比較的非侵襲的で安全な方法を使用して、免疫反応の部位から直接抗原特異的T細胞を採取できることです。

皮膚リコールの基本原理は、抗原を皮膚の真皮層に沈着させることです。抗原の既存の免疫学的記憶を持つ個人では、T細胞は反応部位に移動し、特定のT細胞がクローン的に増殖し、その場で分化する局所免疫応答を誘導します。この反応に吸引水疱を誘導することで、これらの特定のT細胞とin vivoで産生されたサイトカインを採取することができます。

このビデオデモでは、リコール抗原としてPPDを使用しています。PPDは、結核菌感染症の診断に一般的に使用されます。しかし、このビデオで見られるように、以前にBCGワクチンを接種した人の皮膚反応も誘発します。

ツベルクリン皮膚試験の材料には、アルコール綿棒、27〜30ゲージの短い針が付いた1ミリリットルの注射器、および人間の使用が承認されたPPDの溶液が含まれます。ミリリットルあたり20ツベルクリン単位のPPD溶液を使用してください。アルコール綿棒を使用してバイアルを消毒します。

また、メーカーによって構成が異なる場合があることに注意してください。次に、ボランティアの前腕の腹側に注射部位を見つけ、アルコール綿棒を使用してその領域を消毒します。29ゲージ、12ミリメートルの固定針を備えた1ミリリットルの滅菌シリンジを使用してください。

0.1ミリリットルのPPD溶液を穏やかに混合し、吸引します。目に見える気泡がないことを確認してください。皮膚にストレスを与え、斜角を上に向けて針を5〜15度の角度に向けます。

針の先端を皮膚の真皮層に挿入し、先端が表皮からほぼ見えることを確認します。0.1ミリリットルのPPD溶液をゆっくりと注入します。正しく投与すれば、6〜10ミリメートルの丘疹がすぐに現れます。

丘疹は約10分後に消えます。PPDの複数の登録が可能ですが、追加の倫理的承認が必要になる場合があります。2回の注射を行う場合は、肘と手首の部分から十分な距離を保ちながら、最大限の分離を目指します。

臨床皮膚反応は最初の24時間以内に現れ、かゆみを伴います。注射後48〜72時間で皮膚反応のサイズを測定します。.反応を評価するときは、紅斑ではなく硬結を測定することが重要です。

帽子の腫れを指で触診します。次に、ボールペンを使用して硬結の端に印を付けます。最後に、ソフト定規を使用して硬結直径を測定し、結果をミリメートル単位で記録します。

7日後、吸引水ぶくれを誘発する時が来ました。皮膚吸引ブリスターの誘導には、吸引チャンバーが取り付けられた真空ポンプを使用してください。市販のデバイスまたはカスタマイズされたデバイスを使用してください。

重要なことは、ポンプはマイナス20キロパスカルからマイナス40キロパスカルの範囲で調整可能で、安定した信頼性の高い負圧を提供する必要があるということです。吸引チャンバーの底部は、皮膚に接触する小さな穴のあるプレートで構成されています。プレートには1つまたは複数の穴があり、皮膚反応に合わせて異なるサイズを適用できます。

チャンバーの上部は、ブリスターを視覚的に監視できる必要があります。導入前に、皮膚とチャンバープレートを消毒してください。腕が快適に休んでいることを確認してください。

ここで調節可能なストラップを使用して、チャンバーを取り付けて固定します。皮膚反応の中心は、底板の穴を通して見えるはずです。吸引装置の電源を入れ、負圧をマイナス20キロパスカルに調整します。

30分後、圧力をマイナス25キロパスカルに上げます。60分後、圧力をさらにマイナス30キロパスカルまで上げます。そして、1つのブリスターが完全に形成されるまで、ここで圧力をかけ続けます。

水疱導入フェーズには通常約1〜3時間かかります。実際のブリスター形成は、ここで高速に示されているように、最後の30分以内に徐々に発生します。水疱の破裂や出血の兆候がある場合は、ゆっくりと圧力を解放し、誘発を早期に停止することをお勧めします。

ブリスターは、単一または複数のマージブリスターとして表示される場合があります。このプロセスは、しばしばかゆみを伴う感覚と関連しています。ブリスターが完全に形成されたら、圧力を解放し、吸引チャンバーを慎重に取り外します。

正しく誘導された水疱では、表皮層は皮膚の真皮層から完全に分離され、液体で満たされた空洞が残ります。周囲の皮膚領域に柔らかい包帯を塗布し、ここでは15ミリリットルのプラスチックチューブから、ブリスターの上にハードキャップを置くことにより、ブリスターを保護します。ノンアレルギー性のテープでキャップを固定し、その後、柔らかく伸縮性のある包帯を巻きます。

ボランティアに保護包帯を一晩中保管するように指示します。翌日、ドレッシングを慎重に取り外し、スプレーを使用して水ぶくれ部分を消毒します。23ゲージの針が付いた2ミリリットルの滅菌シリンジを使用して、ブリスターの内容物を採取します。

ブリスタールーフの上部側面に針を挿入し、液体をゆっくりと吸引します。キャビティの床に触れないようにしますが、この例のようにブリスターの量が少なくなる可能性があるため、すべての液体を必ず収集してください。崩壊した水ぶくれは傷跡が残らずに治ります。

水ぶくれの上に保護ドレッシングを追加します。次に、ブリスター液を滅菌チューブに移します。卓上型遠心分離機を使用して600 Gで4分間スピンダウンします。

その後、上清を採取し、細胞ペレットを500マイクロリットルの細胞培地に再懸濁します。これで、新鮮な細胞をカウントし、さらに分析する準備が整いました。吸引ブリスター細胞は、フローサイトメトリーなどのin vitro分析に使用できます。

BCGワクチン接種を受けたボランティアを対象としたこの実験では、細胞収量はブリスターあたり15, 000から200, 000を超える細胞の範囲でした。ここでは、1回の吸引ブリスターから細胞を単離し、in vitroでPPDで細胞を刺激した後、染色とフローサイトメトリーを行いました。比較のために、同じPCGワクチン接種を受けたボランティアのPBMCについて並行して分析を行いました。

パネルには、TNF-α、インターフェロン-γ、およびIL2の細胞間産生のために染色されたCD4陽性T細胞の集団が見られます。このボランティアでは、皮膚から単離されたCD4陽性T細胞の30%以上が抗原特異的であった。PBMCでは、この割合は1%未満でしたさらに、ブリスター細胞の個々のサイトカインプロファイルは、中枢記憶T細胞とエフェクターT細胞の両方を代表しており、この方法により、in vivoで生成された長寿命の記憶応答をどのように研究できるかを示しています。

ここで、図Aは、吸引ブリスターから得られた液体がin vivoで産生されるサイトカインについて分析できることを示しています。図Bでは、吸引水疱から得られた細胞を結核菌の存在下で4日間培養し、吸引水疱細胞が生体外でインターフェロン-γおよびTNFαを産生できることを示しています。このビデオを見れば、皮膚抗原沈着後の吸引水疱から細胞を誘導し、採取する方法についてよく理解できるはずです。

このデモンストレーションでは、結核研究の分野で特に関連性のある抗原を使用しました。しかし、この方法論の基本原理は、適応免疫の分野や、T細胞標的薬の研究試験に役立つ可能性があります。また、人間のボランティアと一緒に働く際には、倫理と安全が最優先事項であることを覚えておいてください。

また、ヒトサンプルの取り扱いは危険な場合があり、ラボでは常に安全上の注意に従う必要があることにも注意してください。