誘導多能性幹細胞由来肝細胞を用いた家族性高コレステロール血症ひと肝臓キメラマウス モデル

この方法は、ヒト肝キメラマウスモデル、家族性高コレステロール血症を生成する方法など、分野の重要な質問に答えてきました。この技術の主な利点は、in vivoで薬物検査を行う.この技術は、家族性高コレステロール血症の治療のためのシンジケーションを有する。

この疾患の新しい治療法として、そのようなキメラ動物モデルを用いて試験することができる。この方法は、家族性高コレステロール血症に関する洞察を提供することができますが、他の遺伝性肝疾患にも適用することができます。生着の24時間前に、マウス当たり40マイクロリットルの細胞外マトリックスを解凍し、氷箱に入れることで、冷たい部屋に入れる。

注射する各マウスのインスリン注射器と4度の冷蔵庫に200マイクロリットルの先端の箱を冷やします。生着の1時間前に、細胞解離酵素を温め、DNAase1の1ミリリットル当たり50マイクログラムを添加し、室温にしてRPMI 1640培地に入れ、氷上で20%の血清置換を加えた。iHepsの位相コントラスト画像を撮影して、細胞の形態、成長、細胞密度などのステータスを記録します。

次に、iHepsの各ウェルを2ミリリットルの室温カルシウムとマグネシウムイオンフリーPBSで2回洗浄し、各ウェルに事前温め細胞解離酵素を1ミリリットル加えます。細胞をインキュベーターに8~10分間戻します。顕微鏡下で細胞の形態を監視します。

ほとんどの細胞が丸くなったら、ウェルあたり同じ量の冷たい媒体を加え、細胞を穏やかにピペットしてプレートから取り外し、細胞懸濁液を新しい15ミリリットルチューブに移します。このステップは、肝細胞の信頼性にとって重要です。細胞がプレートから取り外しが困難な場合は、一部はプレート上に残すことができます。

細胞が剥離する場合と、遠心分離後にピペットを穏やかに、単一細胞懸濁液を得た。ほぼすべての接続されたセルが収集されるまで、各ウェルのセル分離手順を繰り返します。その後、摂氏4度で3分間200gで遠心分離機。

遠心分離後、上清を取り除き、15ミリリットルチューブに冷たいPBSを2ミリリットルで再懸濁します。細胞を穏やかにピペットし、単細胞懸濁液を得た。次いで、40ミクロンの細胞ストレーナーを介して細胞を通過させ、凝集体を除去する。

通常、約100万〜200万個の細胞は、数回の後に収穫することができる。次に、0.4%のトリパンブルー溶液のマイクロリットルを20マイクロリットルの細胞懸濁液に加えます。細胞を数え、細胞懸濁液の濃度をC.マウスごとに100万個の細胞を注入するために必要な細胞懸濁液量を計算する。

次に、必要なセル懸濁液の容量を15ミリリットルチューブに、遠心分離機を200 gで摂氏4度で3分間割り当てます。上清を除去した後、マウス1個につき27.5マイクロリットルの冷たいPBSで細胞を再懸濁する。そして、マウスあたり55マイクロリットルの最終体積のための細胞外マトリックスの等しい体積を追加します。

さて、冷たいインスリン注射器の1つを氷の上に置きます。ピストンを抜き、55マイクロリットルのセルサスペンションをシリンジに移し、ピストンを戻します。気泡を慎重に排出し、シリンジを氷の上に戻します。

LRGマウスが適切に麻酔されていることを確認してから、注射手順を開始してください。麻酔の手順中に乾燥を防ぐために目の上に獣医の軟膏を適用します。マウスが刺激に対する筋肉反射を失ったら、右、横方向、褥瘡の位置に置きます。

脱毛クリームの厚い層を左脇腹の切開領域に塗布し、5〜8分間放置します。水湿したガーゼパッドで部分を拭いて脱毛クリームと髪を取り除きます。左脇腹を70%エタノールで3回スクラブします。

その後、左脇腹に見える脾臓を見つけます。その後、殺菌のためのベタジンを最後に浸す。はさみを使って皮膚や腹壁に0.5~1センチの切開を行った後、周囲の脂肪組織を優しく引っ張って脾臓を外装するために鉗子を使用します。

綿棒を使用して脾臓を穏やかに安定させる。インスリン注射器の針を脾臓のパレンチマに3~4ミリメートル挿入し、約50マイクロリットルの細胞懸濁液を静かに注入する。針を引っ込み、綿棒を注射の上に1分間置き、材料の出血やこぼれを防ぎます。

脾臓を腹膜に戻し、5オーナイロン縫合糸で傷口を閉じます。縫合後、マウスを清潔なケージに入れ、食料と水に簡単にアクセスできます。脊椎に平行な下降大タオルが見えるように、新たに安楽死させたマウスから内臓を取り除くことから始めます。

その後、隣接する組織を解剖し、心臓を取り除く。細かいはさみを使って大オータエを解剖し、それぞれを冷たい酸素化されたクレブス溶液に入れる。コレクション後、クレブス溶液中の大石をシリコーンコーティングされたペトリ皿に移します。

結合組織を固定して、大器官の位置を伸ばさずに固定します。滅菌顕微鏡の下で、細かい鉗子とスプリングはさみを使用して、周囲の脂肪や冒険組織から自由に大動脈を解剖し、血管壁を損傷することなく使用します。その後、各大間を1.5ミリメートルから2ミリメートルの長さのセグメントにカットします。

次に、厚さ40ミクロンの細長さ2センチの長さを切り、大間腔にそっと挿入します。ワイヤーを保持して、セグメントをワイヤミオグラフチャンバーに移し、酸素化されたクレブス溶液で満たします。収縮性を研究する際に大掛節の長さを測定するには、各セグメントを顎の間に垂直に配置し、マイクロメーターにD1の読み取りを記録します。

次に、セグメントを削除し、一緒に顎を移動します。D0 の読み取りを記録し、セグメントの長さを計算します。次に、ワイヤーをクランプし、顎の間に伸ばしていないセグメントを配置しながら、ドライバーで固定します。

実験前に正規化するには、伸長していない位置でミオグラフをゼロに設定します。その後、ゆっくりと顎を離して移動し、3ミリニュートンに達するまで大間緊張変化を観察します。15分後、ミオグラフチャンバーから溶液を排出し、新鮮なクレブス溶液に交換してください。

さらに15分待った後、再び3ミリニュートンに緊張を調整します。次に、標準のクレブス溶液を60ミリモルの塩化カリウムを添加したクレブス溶液に変更し、少なくとも15分間収縮を誘発する。新鮮なクレブス溶液を3回リンスし、フェニレフリンの濃度を増加させます。

例えば、10ナノモル〜100マイクロモル。次いで、標準的なクレブス溶液で洗い流した後、最大収縮の約70%でフェニレフリンの単一濃度を加える。収縮が安定している場合, 2 分間隔でアセチルコリンの増加濃度を追加します。.

例えば、1〜3ナノモルから10〜30マイクロモルは、血管拡張を誘導する。この画像は、低密度リポタンパク質受容体欠損iHepsで再移植されたマウス肝臓におけるヒトアルブミン染色の代表的な全セクションスキャン画像を示しています。矢印は、マウス肝臓に生着したヒトiHepsのクラスターを示す。

生着したヒトiHepsのクラスターは、ここでより詳細に見られます。この散布図グラフは、マウス肝臓のiHep含有領域に対応する、異なるドナーiPSCからの再移植されたヒトアルブミン陽性細胞の割合を示す。これは、マウス肝臓におけるヒト核の免疫学的染色の代表的な画像であり、家族性高コレステロール血症iHepsを有する。

棒グラフはLRGマウス肝臓の異なったドナーiPSからの再移植されたヒト核陽性iHepsの割合を示す。これらは、野生型iHepsで再設定されたマウス肝臓の2つの連続したセクションに染色するヒトアルブミンとヒト核の代表的な画像です。最後に、この画像は、アセチルコリンの濃度の増加に応答して、ヒト肝キメラマウスの家族性高コレステロール血症における大動脈の内皮依存的な血管拡張を示す。

このビデオを見た後、ヒトiPSC由来肝細胞を使用して、ヒト肝キメラマウスを生成する方法をよく理解する必要があります。