再生に関する末梢および中枢神経系を研究するため生体内でショウジョウバエ損傷モデル

このショウジョウバエ幼虫の感覚ニューロン損傷モデルの全体的な目標は、in vivo ライブイメージング、2 光子レーザー軸索切開術/樹状突起切開術、および強力なハエ遺伝ツールボックスを組み合わせて、神経再生の潜在的なプロモーターと阻害剤をスクリーニングするためのプラットフォームにすることです。この方法は、末梢神経系と中枢神経系の両方で、神経生成のための新しい内因性および外因性調節因子を特定するなど、神経発生の分野における重要な問題に対処するのに役立ちます。この技術の主な利点は、神経再生の新規候補を簡単、迅速、安価にスクリーニングできることです。

このシステムは、神経再生に関する洞察を提供するだけでなく、神経変性疾患やニューロンとグリアの相互作用など、他のシステムにも適用できます。一般に、この方法に不慣れな人は、軸索と樹状突起の再生をモデル化するために、さまざまなタイプのニューロンを利用するさまざまな実験設定が使用されるため、苦労するでしょう。幼虫の収集には、次のように培養ボトルを準備します。

ブレードを使用して、ショウジョウバエの培養ボトルの片方の壁に1.5センチの穴を開け、換気のために綿球で穴を埋めます。次に、グレープジュース寒天プレートにイーストペーストを軽くたたき、プレートを使用してボトルのメイン開口部を塞ぎます。そんな瓶に、処女の雌10匹と雄5匹の十字架をセットし、25°Cで培養しながら毎日皿を交換します。

収集したプレートを、コンタミネーションを防ぐためにマイルドなプロピオン酸に浸した湿ったティッシュで培養します。培養したプレートから、鉗子を使用して必要な段階で幼虫を収穫します。摘み取った幼虫をイーストペーストを含まない新しいブドウジュース寒天プレートにそっと移します。

彼らが這い回って体をきれいにした後、彼らをイメージすることができます。各イメージングセッションを開始するには、イメージングレーザーと顕微鏡の電源を入れます。怪我をした場合は、2光子顕微鏡を使用してください。

イメージングソフトウェアで、GFPを930ナノメートル、最大出力1950ミリワットで表示するように設定します。ラインスキャンモードを選択し、ピンホールを完全に開きます。次に、レーザー強度をフルパワーの約20%に増やしてPNS損傷を起こすか、フルパワーの50%から100%に増やしてVNC損傷を引き起こします。

次に、スキャン用に512正方形のピクセルフレームを選択し、可能な限り最高のスキャン速度を使用します。平均数 1 と 8 ビットのビット深度を使用します。次に、ゲインを約 750 に設定し、オフセットを 0 に設定します。

このプリセット実験プロトコルを 2P GFP 930 Ablation として保存し、今後の実験で簡単に再利用できるようにします。損傷後のイメージングには、共焦点顕微鏡を使用してください。まず、アルゴンレーザーを488ナノメートルにセットアップします。

[取得] タブを選択し、[Z スタック] を選択します。[レーザー]で、488ナノメートルのアルゴンレーザーをオンにします。次に、チャネルに移動し、488ナノメートルレーザーを選択し、レーザー出力を5〜10%に増やしますピンホールの場合は、1〜2つのエリアユニットのオプションを使用します。

次に、ゲインを650に調整します。取得モードで、フレームスキャンとして1024正方形ピクセルを選択します。最大スキャン速度を使用します。

平均数 2 と 8 ビットのビット深度を使用します。この実験前プロトコルをGFP Imagingとして保存します。幼虫に麻酔をかけることから始めます。

ドラフトに、60mmのガラス皿を15cmのプラスチック製のシャーレに入れます。次に、ティッシュペーパーを折りたたんでガラス皿に入れます。ジエチルエーテルを追加した後、ブドウ寒天プレートを組織に置きます。

次に、スライドガラスの上に、中央にハロカーボン27オイルを1滴垂らし、四隅のそれぞれに真空グリースのスポットを置きます。次に、鉗子を使用して1匹の幼虫を寒天プレートに移し、ガラス皿を覆って幼虫に麻酔をかけます。幼虫の動きが止まったらすぐに、頭を直立させて慎重にハロカーボンオイルに移します。

次に、スライドの上にカバースリップを置き、幼虫に触れるまでゆっくりと押し下げます。次に、穏やかな力でカバースリップをスライドさせ、アブレーションする細胞を2光子レーザーが最も簡単に当たる場所に転がします。場所は、どのニューロンが標的にされているかによって異なります。

次に、アセンブリを2光子顕微鏡ステージに固定し、40倍油浸対物レンズを使用して目的の細胞に焦点を合わせます。ソフトウェアで、スキャンモードに切り替えて、保存したプロトコルをロードします。ピンホールが完全に開いていることを確認してください。

次に、ライブモードで、関心のある領域の画像を取得します。次に、ライブスキャンを停止して、[切り抜き]ボタンが使用可能になるようにします。クロップ機能を使用して、スキャンウィンドウを調整し、ターゲット領域を損傷の可能性のある場所だけに焦点を合わせます。

次に、新しいイメージングウィンドウを開きます。次に、スキャン速度を下げ、レーザー強度を上げます。次に、[連続]ボタンを切り替えて、スキャンを開始および停止します。

注意深く見守ってください。蛍光が急激に増加したらすぐに、スキャンを終了します。次に、元のイメージングウィンドウに切り替えてライブモードを選択し、フォーカスを調整してターゲットにした領域を見つけます。

怪我が成功したことを示す良い指標は、怪我の部位に小さなクレーター、リング状の構造、または局所的な破片が現れることです。レーザー出力が高すぎると、大きな損傷領域が見え、致命的となる可能性があります。次に、カバースリップを慎重に取り外し、負傷した幼虫をイーストペーストで新しいプレートに移します。

プレートをプロピオン酸に浸したティッシュと一緒に60mmの皿に入れます。その後、プレートを培養温度に戻します。その後の幼虫のイメージングには、保存された共焦点セットアップを利用し、25倍の対物レンズでZスタック画像を収集します。

再生を定量化できるように、正規化ポイントを必ず含めてください。記載されたプロトコルを用いて、クラス3および4のDAニューロンの再生を調査した。通常、腹部セグメントA7〜A2の右側にある3つまたは4つのニューロンが損傷しました。

具体的には、クラス3のDDAFとクラス4のVプライムADAニューロンが標的となりました。幼虫は、損傷後24時間、48時間、および72時間で画像化されました。24時間後、遠位軸索は通常変性を完了し、軸索ステムは容易に見えました。

48時間後、クラス4のDAニューロンの再生を評価することが可能であった。これらのニューロンの約70%は、損傷部位を超えて再生されます。しかし、72時間後でも、クラス3のDAニューロンが再成長しなかったことは明らかでした。

これは、停滞した成長円錐の繰り返しの観察に基づいて評価されました。このビデオを見れば、実験の設定方法、2光子損傷の実施方法、および結果の評価方法について十分に理解できるはずです。このテクニックを習得すると、適切に実行されれば、幼虫1匹あたり15分かかります。

この手順を試行する際は、実験的な成長と対応するコントロールを並べて比較することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、免疫染色のような方法を実行して、軸索損傷がタンパク質転座を引き起こし、経路の変化を引き起こすかどうかなど、より多くの質問に答えることができます。その開発以来、この技術は、神経科学の分野の研究者がショウジョウバエの幼虫の感覚ニューロンの神経再生を探求する道を開きました。

最後に、ジエチルエーテルの取り扱いは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、ヒュームフードで幼虫麻酔を行うなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。