心臓の遺伝子がマウスでの編集の CRISPR アデノ随伴ウイルスを介した配信

このin vivo心臓遺伝子編集プロトコルの全体的な目標は、組換えアデノ随伴ウイルスrh.74とCRISPR SaCas9およびガイドRNAベクターを使用して、ジストロフィーマウスの心臓におけるジストロフィン発現を回復させることです。この方法は、遺伝子編集がデュシェンヌ型筋ジストロフィーに関連する心筋症の根本原因を治療するための信頼できる治療戦略であるかどうかなど、筋ジストロフィー領域における重要な疑問に答えるのに役立ちます。

これらの技術の主な利点は、修正されたジストロフィン遺伝子の発現がその内因性制御下にあり、このレスキュー効果が永続的であることです。この技術の意味は、CRISPR Cas9遺伝子編集技術によって変異遺伝子の修正を達成できる他の遺伝性疾患の治療にまで及びます。この方法は、ジストロフィー心臓のジストロフィン修復に関する洞察を提供するだけでなく、逆遺伝学的研究のために目的の遺伝子をノックアウトするためにも使用できます。

その手順を実演するのは、私たちの研究室の技術者であるYandi Gaoです。ガイドRNA(gRNA)の適切な設計は、このプロトコルの成功に不可欠です。黄色ブドウ球菌CRISPR関連タンパク質9のジストロフィンイントロン20とイントロン23を標的とする2つのgRNAを選択します。

各gRNAのプロトスペーサー隣接モチーフ配列には下線が引かれ、イタリック体で示されています。gRNAオリゴヌクレオチドをアニーリングするには、1xアニーリングバッファー中に1リットルあたり100マイクロモルのgRNAオリゴヌクレオチドを含む反応を設定します。次のPCRパラメータを使用します:摂氏95度で10分間、摂氏95〜59度の90サイクルでサイクルあたり摂氏0.4度の減少で20秒間、摂氏59度から摂氏32度の90サイクルでサイクルあたり0.3度の減少で20秒間、および摂氏32〜26度の20サイクルでサイクルあたり0.3°Cの減少で20秒間。

次に、アニーリングされたgRNAオリゴヌクレオチドを1回の反応でCRISPベクターにライゲーションする準備をします。チューブに以下を追加します:1マイクロリットルあたり50ナノグラムの1マイクロリットルCRISPRベクター、1マイクロリットルのアニーリングオリゴヌクレオチド、1.5マイクロリットルの10x T4 DNAリガーゼバッファー、0.5マイクロリットルのT4 DNAリガーゼ、1マイクロリットルのBsal、および10マイクロリットルの二重蒸留水。サーモサイクラーで次の反応を実行します:摂氏37度で5分間、摂氏16度で10分間、摂氏37度で20分間、摂氏80度で5分間の5サイクル。

15マイクロリットルのライゲーション産物を30マイクロリットルのコンピテントセルに変換し、100マイクログラム/ミリリットルのアンピシリンを含む寒天プレートに細胞を播種します。摂氏37度で24時間培養します。翌日、寒天プレートから5〜10個のコロニーを選び、摂氏37度、250rpmで100マイクログラム/ミリリットルのアンピシリンを含むLB培地で3〜4時間培養します。

PCRでコロニーをスクリーニングするには、それぞれ10マイクロリットルのPCRマスターミックス、8マイクロリットルの二重蒸留水、1マイクロリットルの大腸菌培養、1マイクロリットルのU6フォワードプライマー、および1マイクロリットルのi20またはi23 gRNAリバースプライマーを含む反応を準備します。次のPCRサイクリングパラメータを使用します:摂氏95度で5分間、続いて摂氏95度で30秒間、摂氏61度で30秒間、摂氏72度で30秒間の35サイクル。陽性クローンが同定されたら、100 μg/ミリリットルのアンピシリンを含む4ミリリットルの新鮮なLB培地を追加し、摂氏37度、250rpmで一晩培養することにより、各陽性クローンの5ミリリットルの培養物を準備します。

翌日、適切なプラスミド抽出キットを使用してプラスミドDNAを精製します。その後、プラスミドは、U6フォワードプライマーを用いたサンガーシーケンシングによって検証されます。プラスミドの遺伝子編集効果をテストするために、10%FBSと1%Pen-Strepを添加したDMEMでC2C12細胞を培養し、細胞が約70%の密度に達するまで

メーカーのプロトコルに従って、合計 5 μg の SaCas9/gRNA プラスミド混合物を 1 対 1 のモル比で C2C12 細胞にエレクトロポレートします。トランスフェクションの 48 時間後、C2C12 細胞を回収し、テキスト プロトコルに記載されているようにゲノム DNA を抽出します。ゲノムDNAをテンプレートとして使用して、マウスジストロフィン遺伝子座のPCRを実行します。

フォワードプライマー、リバースプライマー、グリーンPCRマスターミックス、二度蒸留水、および100ナノグラムのゲノムDNAを含む反応を設定します。陽性クローンのスクリーニングと同じPCR条件を使用してください。この手順を開始する前に、テキストプロトコルで説明されているように、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)を調製します。

3日目のmdxマウスの子犬にウイルス粒子を腹腔内注射により全身投与します。マウスが回復するのを待って、家のケージに戻します。rAAV投与の10週間後に、マウスから組織を採取します。

ゲノムDNAおよびRNA抽出のために組織を急速凍結し、液体窒素中で冷却したイソペンタンを使用して、凍結切片に最適な切断温度化合物で組織を凍結します。免疫蛍光染色プロトコルを開始するには、凍結組織切片を4%パラホルムアルデヒドで室温で5分間固定します。15分後、ティッシュ切片をPBSで2回洗浄します。

ブロッキング溶液と室温で1時間インキュベートします。次に、抗ジストロフィン一次抗体と摂氏4度で一晩インキュベートします。翌朝、スライドをPBSで洗浄し、蛍光二次抗体と室温で1時間インキュベートします。

DAPIを搭載した封入剤を使用してスライドをマウントし、倒立共焦点顕微鏡でイメージングします。細胞培養における標的ゲノムDNA領域の欠失を誘導するgRNAの有効性をPCRによって評価した。約500塩基対のPCR産物は、遺伝子編集によって標的ゲノムDNAの欠失が成功したことを示していますが、対照細胞はバンドを生成すべきではありません。

細胞培養でgRNAの有効性が確認されると、gRNAはrAAVにパッケージ化されます。rAAVウイルス粒子を精製し、SDS-PAGEで純度を分析します。3つのキャプシドタンパク質に対応する3つのバンドのみが存在することは、高純度を示しています。

AAV SaCas9 gRNAで処理した野生型マウス、mdxマウス、およびmdxマウスの心臓切片のこれらの代表的な免疫蛍光画像は、AAV SaCas9 gRNAがジストロフィーマウスのジストロフィン発現を全身的に回復することを示しています。このビデオを見れば、出生後マウスでrAAV rhを使用してin vivo心臓遺伝子編集を行う方法について十分に理解できるはずです。SaCas9およびgRNAの74媒介送達。