探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

この実験の全体的な目標は、16SリボソームRNA遺伝子のコミュニティプロファイリングを使用して、根のマイクロバイオーム、土壌、根圏、および根の内層の3つのコンパートメントを特徴付けることです。この方法は、マイクロバイオーム構造の重要な推進力である生物的および非生物的要因など、微生物生態学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、根圏と根圏の分離からDNAの抽出、シーケンシングライブラリの準備まで、各ステップを標準化することです。

この手順を実演するのは、Coleman-Derr研究所の大学院生であるTuesday Simmonsです。プロトコルを開始するには、エタノール滅菌した土壌コアコレクターで大量の土壌サンプルを採取し、植物の根を含まない土壌を取得します。植物の根元から約23〜30センチメートルのところにコアを集めます。

次に、土壌をビニール袋に移し、袋を穏やかに振って土壌を均質化し、土壌サンプルの600ミリグラムのアリコートを1本の2ミリリットルチューブに移し、すぐに2ミリリットルのチューブをドライアイスの上に置いてDNA抽出します。根と根圏を採取するには、エタノール滅菌したシャベルを使用して植物を掘り起こし、できるだけ多くの根を得るように注意します。根の表面に約2ミリメートルの土が付着するまで、根から余分な土をそっと振り落とします。

大きな植物の場合は、滅菌ハサミを使用して根の代表的なサブセクションを切断し、最低500ミリグラムの根組織を50ミリリットルの円錐形バイアルに入れます。根を覆うのに十分な着生植物除去バッファーを追加し、すぐにサンプルをドライアイスの上に置きます。根圏を根から分離するには、根のサンプルを氷上で解凍してから、根のサンプルを超音波処理します。

滅菌鉗子を使用して、冷やした清潔な50ミリリットルのチューブに根を移します。元のチューブを緩衝材や土と一緒に廃棄しないでください。これには、根圏分数が含まれます。

次に、バッファーと根圏の入ったチューブを遠心分離します。上清をデカントし、根圏画分をドライアイスに入れます。根を洗うには、根の部分に摂氏4度の滅菌水を約20ミリリットル加えます。

根を15〜30秒間激しく振って洗い、水気を切ります。滅菌ヘラを使用して、250ミリグラムの土壌と根圏を、市販のDNA抽出用DNA分離キットに付属の別々の収集チューブにすばやく移し、キットサプライヤーのプロトコルを使用して続行します。溶出後、アンプリコンライブラリー調製に進む準備ができるまでDNAをマイナス20°Cで保存し、その後、ルートサンプルからDNAを抽出します。

滅菌した乳鉢と乳棒を液体窒素で冷やします。600〜700ミリグラムの根組織を測定し、組織を乳鉢に入れ、根を覆うのに十分な液体窒素を慎重に加えます。根を細かく挽きます。

液体窒素を添加し、根が微粉末になるまで、サンプル間で一貫性を保ちながら、少なくとも2回粉砕するプロセスを続けます。すぐに、ルートパウダーが解凍し始める前に、滅菌ヘラを使用して、ルートパウダーを氷上の事前に計量された1.5ミリリットルのチューブに移します。チューブと粉末の重量を記録します。

滅菌ヘラを使用して、土壌からの抽出用に設計された市販のDNA分離キットに付属の収集チューブに150ミリグラムの根粉末を迅速に移し、キットサプライヤーのプロトコルを使用してDNA分離を進めます。各DNAサンプルをトリプリケートに増幅するのに十分なPCRマスターミックスを調製します。マスターミックスを滅菌済みの25ミリリットルマルチチャンネルピペットリザーバーに注ぎ、新しい96ウェルPCRプレートの各ウェルに66マイクロリットルのマスターミックスを分配します。

次に、正規化されたDNAプレートから1マイクロリットルあたり5ナノグラムの6マイクロリットルをマスターミックスプレートに加えます。次に、マスタープレートに1.5マイクロリットルの10マイクロモルフォワードプライマーを追加し、各列が異なるフォワードバーコードを持つように、1.5マイクロリットルの10マイクロモルリバースプライマーを追加します。プレートをフィルムで覆い、プレートを 3 、 000 RCF で短時間回転させます。

マルチチャンネルピペットを使用して内容物を穏やかに混合し、25マイクロリットルの反応混合物で3つのプレートに分割し、プレートをPCRフィルムで覆います。サーモサイクラーを使用して各プレートのDNAを増幅します。増幅後、3つのレプリケートプレートを1つの96ウェルプレートにプールします。

コンピューターのスプレッドシートを使用して、各サンプルの100ナノグラムの容量と、すべてのサンプルの平均容量を計算します。ブランクPCR産物ごとに、計算された平均容量を1本の1.5ミリリットルチューブに加えます。増幅に成功したサンプルについては、各サンプルの100ナノグラムを同じチューブにプールし、ベンチトップ蛍光光度計を使用してプールされた製品の濃度を測定し、分子グレードの水で600ナノグラムのDNAを1.5ミリリットルのチューブで最終容量100マイクロリットルまで溶出させます。

残りのプール製品は、摂氏マイナス20度で保管してください。600ナノグラムのDNAアリコートを精製する前に、600マイクロリットルの新鮮な70%エタノールを調製します。常磁性ビーズを使用して確立されたPCR精製プロセスに従います。

磁気ビーズのチューブを振って、底に沈殿するビーズを再懸濁します。1倍容量の100マイクロリットルのビーズ溶液をDNAの600ナノグラムアリコートに加えます。溶液とビーズを10回ピペッティングして完全に混合します。

十分に混合した後、室温で5分間インキュベートします。チューブをマグネティックスタンドに2分間、または溶液が透明になるまで置き、ビーズを溶液から分離します。チューブをスタンドに入れたまま、透明な上清を磁気ビーズに触れないように注意深く吸引し、廃棄します。

チューブをスタンドに残し、チューブに300マイクロリットルの70%エタノールを加え、ビーズを室温で30秒間インキュベートします。エタノールを吸引し、廃棄します。このプロセスを繰り返し、2回目の洗浄後にすべてのエタノールを取り除きます。

マグネットスタンドからチューブを取り外し、内容物を5分間風乾します。乾燥させたビーズに30マイクロリットルの分子グレードの水を加え、10回ピペッティングして混合します。室温で2分間インキュベートします。

チューブを磁気スタンドに1分間戻し、ビーズを溶液から分離します。溶出液を新しいチューブに移します。洗浄したプールされたDNAの最終濃度を、ベンチトップ蛍光光度計で測定します。

アリコートを最終容量30マイクロリットルで10ナノモルに希釈するか、シーケンシング施設が好む濃度と容量に希釈します。増幅ステップに続いて、シーケンシングを行い、各サンプルの細菌群集組成を決定しました。調査した植物宿主の葉緑体およびミトコンドリアの16SリボソームRNA遺伝子にPNA配列をアラインメントしても、ミスマッチは明らかにならないはずです。

13塩基対のPNA配列に対する単一のミスマッチは、提供された葉緑体PNA配列とLactuca sativaまたはレタスの葉緑体16SリボソームRNA遺伝子の場合のように、有効性を劇的に低下させる可能性があります。サンプルごとに同量の増幅DNAがプールされたため、シーケンシング後、細菌分類群に一致する偶数の読み取りがサンプルごとに取得され、バーコードインデックスに基づいてソートされました。この手法を習得すると、8つのプラントで約8時間で行うことができます。

この手順を試行する際は、実験間で一貫性を保つことが重要です。DNA抽出方法やPCRマスターミックスの変更などの小さな詳細がバイアスを引き起こす可能性があります。この手順に続いて、メタトランスクリプトミクスなどの他の方法を使用して、どの微生物が活動しているか、どの遺伝子を発現しているかなどの追加の質問に答えることができます。

液体窒素の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、適切なPPEの着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。