Name: 探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 学ぶ土壌、根圏、根内細菌群集の16S rRNA遺伝子プロファイリングによる解析法。DNA抽出からシーケンスライブラリ調製まで標準化されたプロトコルで、植物関連微生物群集の組成と多様性を明らかにします。

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この作品は、米国農務省アルス (CRIS 2030-21430-008-00D) によって賄われていた。TS は、NSF 大学院研究フェローシップ ・ プログラムによってサポートされます。

1. 収集とルート Endosphere、根、土壌試料の分離
<ol><li>滅菌オートクレーブ純水 (サンプルあたりの水の少なくとも 90 mL) フィールドを入力する前に。着生植物の除去バッファー (サンプルあたり少なくとも 25 mL) を準備するには、1 L の滅菌水に KH2PO4の 6.75 g、K2HPO4、8.75 g およびトリトン X-100 の 1 mL を追加します。0.2 μ m の細孔径を持つ真空フィルターを使用してバッファーを滅菌します。<ol>
<li>ステップ 1.2 から 1.5] エタノールで滅菌クリーン手袋を着用回、汚染を防ぐために各サンプル間手袋を交換します。70% エタノールですべての機器を滅菌し、サンプル間のすべての機器をきれいに拭きます。サンプリングの前にあなたの実験のための最適なサンプリングの深さを決定して、根と土壌のすべてのコレクションと一致します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>一括土壌サンプルを収集するには、コアを集めることによって無料で植物の根が土壌を取得する、エタノール殺菌土壌コアのコレクターを使用して、植物の根元から約 23 〜 30 センチ。</li>
	<li>ビニール袋に土を転送、穏やかな揺れで土を均質化し、1 つ 2 mL チューブに合わせて土壌サンプル (約 600 mg) の因数を転送します。フラッシュ (ステップ 2) の DNA の抽出を続行する準備ができるまでのリキッド N2管の凍結またはすぐにドライアイスを 2 mL 管を配置します。<ol>
<li>一部の環境で、周囲の土壌は植物材料を含めることができます。この場合、ビニール袋にそれを配置する前に土壌から植物の残骸を分離する滅菌の 2 mm のふるいを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>根と根を収集するには、限り多くできるだけルートの取得に注意しながら、植物を掘るエタノール殺菌のシャベルを使用します。深さは植物に依存しています。小麦など小さな植物を削除するには、いくつかのセンチを掘り、ソルガムなどのより大きい植物が 30 cm 以上必要となります。根面に付着した土の約 2 mm になるまで優しく根から余分な土壌を振り払います。 注: 小さな植物、壊れやすい根、乾燥、高粘土コンテンツ土壌を使用するとき注意してください。理想的には、揺れの後残りの根を土の薄層、だけ必要があります存在。土壌の大きな凝集体のまま、ゴム製木槌がシュートの基部を軽く押すことで土を除去するため使用できます。このプロセスの後の残りの土の量を超えたり、2 mm を下回る場合は、おおよその厚さを注意しなければなりません。</li>
	<li>大きい植物の根の代表的な部分をカットし 50 mL コニカル バイアルに最低 500 mg 根組織の滅菌はさみ/大ばさみを使用します。小さい草は、バイアルに全体のルート システムを配置します。根をカバーし、すぐにドライアイスのサンプルを配置する十分な着生植物除去バッファーを追加またはフラッシュ凍結液 N2のサンプル。 注意: 洗浄ステップを困難にするが、50 mL コニカル バイアルを詰め込み過ぎないようにして注意してください。着生植物のバッファーが下に流れ、バイアル中の根を囲む、上部をカバーすることができるように、十分な空領域があるはずです。いくつかの草がより多くのルート バイオマス 50 mL コニカル バイアルに収まるよりもあるため、根の部分を収集します。しかし、生菌根端数に流失につながる根を切断、ので根を破壊を最小化する必要があります注意する必要があります。-80 ° C で格納できるサンプルが研究室に戻った後すぐに処理されない場合</li>
	<li>根から根圏を分離する氷の上ルート サンプルを解凍し、超音波照射 30 160 W のパルスと 10 分のための 4 ° c ルート サンプル秒、区切って 30 s. 転送根冷蔵 (4 ° C) に、きれいに滅菌鉗子を使用して 50 mL のチューブ。バッファーと土壌では根圏の分数 (図 1) オリジナル チューブを捨てないでください。</li>
	<li>バッファーを含むチューブを遠心し、根圏 4,000 x g.、上清をデカント、4 ° C で 10 分間のフラッシュのため液 N2根画分を含む管を凍結、DNA を続行する準備ができるまで-80 ° C で根の一部を保存抽出 (ステップ 2)。</li>
	<li>根を洗って、ルートの分数に冷蔵 (4 ° C) 滅菌水約 20 mL を追加します。積極的に (によって手やミキサー、15-30 s) を揺することによってルートを洗って水を排水します。</li>
	<li>根の表面に土が残っていないまでに少なくとも二回、この手順を繰り返します。DNA の抽出 (手順 2) をすぐに実行しない場合、滅菌アルミホイルで根を包んで、フラッシュ凍結液 N2ストアまで-80 ° c のサンプルは、DNA の抽出を続行する準備ができての根。</li>
</ol>2. DNA の抽出
注: 手順 2 および 3、全体クリーンなエタノールで滅菌手袋をすべての回で、エタノールで殺菌表面上ですべての作業を実行します。
<ol><li>土壌および根圏のサンプルから DNA を抽出します。<ol>
<li>使用手順 1.3 1.7 から個別のコレクションの管に土と根の 250 mg をすばやく転送する滅菌ヘラが商業 DNA 分離キットで提供される土壌からの抽出のために設計し、キットのサプライヤーを使用して DNA の隔離を続行プロトコル。</li>
		<li>DNA 分離キットによって提供される溶出バッファーで DNA を溶出した後手順 3 を続行する準備ができるまで、-20 ° C で DNA を格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ルート サンプルから DNA を抽出します。<ol>
<li>滅菌の乳鉢と乳棒リキッド N2を使用して冷やします。根組織の 700 に 600 mg を測定し、モルタルに組織を配置します。慎重に、十分な液体 N の2根をカバーするために追加します。</li>
		<li>小さな断片に根を挽きます。リキッド N2を追加して、研磨のプロセスを続行 (2 回以上がサンプル間で一貫して)、根が細かい粉になるまで。根組織でこの手順中に解凍しないことを確認します。 注意: 使用する場合適切な個人用保護具 (白衣、防護用の眼鏡と低温手袋) リキッド N2での作業します。 注: 低品質の DNA の抽出のことができます余分な根をひいて粉にし、-80 ° C で粉を格納する有益です</li>
		<li>すぐに、ルートの前に粉は雪解け、滅菌スパチュラを使用して氷の前体重 1.5 mL チューブに根の粉末を転送を開始します。チューブと粉末の重量を記録します。通常、粉末の 300-400 mg が転送されます。</li>
		<li>使用商業 DNA 分離キットで提供されるコレクションの管に根の粉末の 150 mg をすばやく転送する滅菌ヘラは土壌からの抽出のために設計し、キット サプライヤーのプロトコルを使用して DNA の隔離を続行します。 注: いくつかのルートのサンプルができます PCR 場合は特に、異なる DNA の抽出のプロトコルの間に DNA の増幅を防ぐ DNA の餌の残りの有機物の高濃度 (e.g。、CTAB 抽出) が使用されます。必要な場合は、環境 DNA クリーン アップ キットで提供される指示に従い、DNA をきれい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>高感度卓上型蛍光光度計を使用してすべての DNA サンプルの濃度を測定します。<ol>
<li>DsDNA 高感度アッセイ キットで提供される管に各溶出の DNA サンプルの 1 20 μ L を追加します。200 μ L まで蛍光光度計作業ソリューション (1: 200 染料: バッファー) を追加します。</li>
		<li>標準 2 (100 ng/μ L)、DNA 標準 1 (0 ng/μ L DNA) または 10 μ L の 10 μ L を含む 2 つの追加のチューブを用意し、蛍光光度計作業ソリューションの 190 μ L を各標準に追加します。</li>
		<li>基準と各サンプルの濃度を測定します。それは自動的に行われない場合は、2 つの規格の線形回帰によって吸光度出力から DNA 濃度を計算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 私アンプリコン ライブラリの準備と提出
<ol><li>増幅反応のための材料を設定します。<ol>
<li>4 ° c の DNA のサンプルを解凍し、手順 3 で氷のそれらを保ちます。PCR プレート (表 2) の場所のためのバイアスを最小限に抑えるために DNA のサンプルの順序をランダム化します。</li>
		<li>96 ウェル PCR プレートにグレード分子水の各サンプルから DNA を増幅 (空白) (表 2) のネガティブ コントロールとして 20 μ L。 追加 20 μ L の 4 つのコーナーの井戸に水を分子グレードの総量 5 ng/μ L に希釈します。</li>
		<li>マルチ チャンネル ピペット (図 2) を追加できるような PCR ストリップ管または 96 ウェル プレートでバーコード プライマー (10 μ M) を配置します。</li>
		<li>十分な 3 通の各 DNA サンプルを増幅する PCR マスター ミックスを準備します。BSA (20 mg/mL) の 1.5 μ L、既製の 2 × マスター ミックス ( Taq DNA ポリメラーゼ、dNTPs、MgCl2PCR バッファーの構成) 37.5 μ L、葉緑体 PNA の 0.57 μ L を準備 (100 μ M)、ミトコンドリアの PNA の 0.57 μ L (100 μ M)、および分子グレード水 25.86 μ L。</li>
		<li>マルチ チャンネル ピペット貯水池の滅菌 25 mL にマスター ミックスを注ぐし、マルチ チャンネル ピペットを使用して新しい 96 ウェル PCR プレートの各ウェルにマスター ミックスの 66 μ L を配布します。 メモ: マスター ミックス試薬量の計算している場合、は、プレートごと 4 空井戸も含めるようにしてください。</li>
		<li>マルチ チャンネル ピペットを使用して、5 ng/μ l の DNA (正規化された DNA プレート) からマスター ミックス プレートを 6 μ L を追加します。各列が異なる前方バーコードがあり、各行が異なるリバース バーコード (図 2) プライマーをリバース 10 μ M の 1.5 μ 10 μ M 前方プライマーのマスター プレート 1.5 μ L に追加します。 注: プライマーを追加する前にランダム化されたプレートとマスター ミックスされる可能性があります異なるプライマーを追加した場合、ITS や ITS2 真菌遺伝子を増幅します。この場合、同様のプライマー設計を使用できます。</li>
		<li>3,000 x g に簡単にプレートのスピンダウンは、優しく、ミックスし、反応混合物の 25 μ L で 3 つのプレートに分割マルチ チャンネル ピペットを使用します。 注: 3 つのレプリケートは厳密には必要ないが、技術の変動の影響が低下します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>たちの次の条件に設定を使用して各板の DNA を増幅する: 180 s 98 ° C で、30 のサイクル: 98 ° C、45 s (変化)、10 の 78 ° C (PNA アニール) s、55 ° C、60 s (プライマーアニー リング)、および 90 のための 72 ° C s (拡張子)、その後、600 s 72 ° c 4 ° C に続いてホールド ステップ。増幅後、1 つの単一の 96 ウェル プレートに 3 つの複製版をプールします。</li>
	<li>96 ウェル プレート リーダーの高感度蛍光光度計試薬を用いた DNA を定量化します。<ol>
<li>96 ウェル マイクロ プレート、蛍光光度計作業ソリューション (1: 200 染料: バッファー) 98 μ と共に各 PCR の製品の 2 μ L を追加します。標準として 4 井戸があります: DNA 標準 1 の 5 μ L (0 ng/μ L DNA)、1 μ L の標準 2 (10 ng/μ L)、標準 2 (20 ng/μ L)、2 μ L、5 μ L 標準 2 (50 ng/μ L) の。100 μ L の最終巻の蛍光光度計作業ソリューションを加えます。 注: 各サンプルは、プレート リーダーが使用できない場合、2.3 の手順で説明されているようにベンチトップ蛍光光度計を使用して測定できます。</li>
		<li>4 つの標準の線形回帰によって吸光度出力から DNA 濃度を計算します。</li>
		<li>正常に増幅されたバーコード (これら 15 ng/μ L を超える濃度にしている)、製品プール 100 シングル 1.5 mL チューブ (表 2) に各サンプルの ng。</li>
		<li>スプレッドシート プログラムで =AVERAGE() 関数を使用してプールに追加するサンプルの平均数量を計算します。御府内に「空白」の PCR の製品の量を追加します。 注:「空白」の PCR の製品は、独自の一意のバーコードの組み合わせを持っている、ので、実験室汚染物をチェックするために配置できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステップ 2.3、および DNA の取る 600 ng の説明に従ってベンチトップ蛍光光度計を使用してプールの製品の濃度の測定し、分子グレード 1.5 mL チューブに 100 μ L の最終巻に水で希釈します。-20 ° C で残りのプールの保管します。</li>
	<li>いくつかの例外を除いて 96 ウェル形式で常磁性精製ビーズ確立された PCR 精製プロセスに従う 600 ng DNA 分注を洗ってください。<ol>
<li>70% のエタノールの因数新鮮な 600 μ L を作る。底に沈殿ビーズを再停止する磁気ビーズのボトルを振る。</li>
		<li>DNA の 600 ng 因数にビーズ ソリューションの 1 x ボリューム (100 μ L) を追加します。10 回のピペッティングにより徹底的にミックスします。室温で 5 分間インキュベートします。</li>
		<li>マグネット スタンドを 2 分間 (またはソリューションがクリアされるまで) にチューブを配置ソリューションからビーズを分離します。マグネット スタンドのチューブでは、磁性ビーズに触れることがなく慎重に明確な上清を吸引、明確な上澄みを廃棄します。 注: この時点で、私アンプリコン製品は、磁性ビーズにバインドされます。邪魔紛失中の誤嚥は、すべてのビーズは、DNA の損失になります。</li>
		<li>マグネット スタンドでチューブを残して、管; 70% のエタノールの 300 μ L を追加エタノールと破棄を 30 s. 吸引室温で孵化させなさい。このプロセスを繰り返し、2 番目の洗浄後すべてエタノールを取り外します。マグネット スタンドからチューブを外し、エアーで 5 分間乾燥させます。</li>
		<li>乾燥ビーズにグレード分子水の 30 μ L を追加し、10 回のピペッティングで混ぜます。ソリューションからビーズを分離する 2 分 1 分のマグネット スタンドにリターン チューブの室温で孵化させなさい。溶出液を新しいチューブに転送します。 注: 磁気ビーズは下流の反応を影響しません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>掃除、2.3 の手順で説明されているようにベンチトップ蛍光光度計を用いたプールされた DNA の最終濃度を測定します。10 因数を希釈濃度、30 μ L の最終巻でボリューム シーケンス機能によって優先 nM。</li>
	<li>NGS のプラットフォーム、300 bp ペアエンド シーケンス x 2 で DNA のシーケンスにシーケンス処理施設のサービスを利用します。</li>
</ol>

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著者が明らかに何もありません。

このプロトコルは、ルート endosphere、根、およびサンプル処理し、下流配列にサンプリング、フィールドからの土壌微生物群集組成の基礎の確立されたパイプラインを示します。勉強ルート関連内細菌叢解析特有の課題、ため一部サンプリングの固有の難しさへの土壌から。土壌は非常に物理的・化学的性質の面で変数と異なる土壌条件はわずか数ミリ28,29によって分けることができます。これはかなり異なる微生物群集の組成を持ち、活動30,31隣接するサンプリング サイトから集めたサンプルにつながることができます。したがって、土壌コアのコレクターやシャベルを使用して一貫性のあるサンプリングの深さと DNA の抽出の前に均質化ルート マイクロバイ研究内再現性に不可欠ですを維持します。根と根分画で; を効率的に分離も欠かせません過酷なルート表面殺菌法を用いた潜在的分離エンドファイト DNA の抽出の前に根の内でより保守的な洗浄が根...

プラント関連内細菌叢解析は細菌、古細菌、ウイルス、菌類および他の真核微生物から成る動的で複雑な微生物群集から成っています。よく研究植物の病気の原因ではなく、植物共生微生物できますも積極的に影響を与える植物の健康によって生物的・非生物的ストレス耐性の向上、栄養アベイラビリティを推進・強化による植物の成長植物ホルモンの生産。このため、特定の関心は植物根 endospheres、根圏、周辺土壌と関連付ける分類群を特徴付けるに存在します。一方、いくつかの微生物は、生成されたメディアを研究室で分離培養することができます、多くはできない、他の微生物と共生関係に依存している場合がありますので、一部非常にゆっくり育つまたはラボ環境では再現できない条件を必要とします。栽培の必要性を回避できますので、比較的安価な高スループット シーケンスを用いた系統プロファイリング環境とホスト関連付けられている微生物サンプルの微生物群集を試金するため最寄り方法となっています。組成物。
次世代シークエンシング (NGS) のプラットフォーム1各種によって提供される適切なシーケンス テクノロジーの選択は、重要な要因を含むユーザーのニーズに依存して: 必要なカバレッジ、私アンプリコン長さ予想コミュニティ多様性と同様、誤り率、読み取りの長さ、および、コスト-あたり-実行/megabase のシーケンスします。私アンプリコン ベースのシーケンス実験で考慮する必要があるもう一つの変数がどのような遺伝子が増幅され、どのようなプライマーが使用されます。設計またはプライマーを選択するとき、研究者は結果の産物から達成可能な増幅の普遍性と分類学的解像度のトレードオフを作るを強いられる。このため、研究のこれらのタイプは、しばしばプライマーと、マイクロバイの特定のサブセットを選択的にターゲット マーカーを選んだ。細菌群集組成の評価は一般的に細菌の 16S rRNA 遺伝子2,3の超可変領域の 1 つ以上のシーケンスで実行します。本研究では、私アンプリコン ベースについて述べるシーケンス プロトコルはそのターゲット、500 bp V3 V4 の領域に十分な可変性を提供しながら細菌種の広範な増幅を可能にする細菌の 16S rRNA 遺伝子の NGS プラットフォーム用に開発。異なる分類群の間を区別します。さらに、このプロトコルは簡単に他のプライマー セットなどの菌類の ITS2 マーカーや真核生物の 18S rRNA サブユニットをターゲットで使用するために適応できます。
他に近づくような散弾銃メタゲノム、メタトランスクリプトミクス、および単一セルの配列を提供する解決の微生物ゲノムとコミュニティ機能のより直接測定を含む他の利点と、これらの技術が通常より多く高価で、ここで説明した系統プロファイリング4よりも計算量の多い。また、宿主植物ゲノムに属する読み取りの大部分をもたらすルート サンプルに散弾銃メタゲノムおよびメタトランスクリプトミクスを実行して、この制限を克服する方法はまだ開発5,6をされています。
実験プラットフォームでも私アンプリコン ベースのプロファイリングは、実験デザインとデータ解析時に考慮すべき潜在的なバイアスの数を導入できます。検体の採取、DNA 抽出、PCR のプライマーの選択およびライブラリの準備を実行する方法のメソッドが含まれます。さまざまな方法は、生成されると、使用可能なデータの量に大きく影響することができますや、また研究間で結果を比較するための努力を妨げることができます。たとえば、根圏細菌7と異なる抽出技術の使用または DNA 抽出キット8,9の選択を除去する方法につながる下流解析に大きく影響する示されています。異なる結論に関して、微生物が存在し、彼らの相対的な存在量。私アンプリコン ベースのプロファイリングをカスタマイズすることができます、ので研究間で比較することが挑戦することができます。地球マイクロバイ プロジェクトのアプリケーションによって引き起こされる変動を最小限に抑える手段として標準化されたプロトコルの開発からプラント関連マイクロバイなど複雑なシステムを調査している研究が恩恵を示唆しています。研究10,11の間さまざまな方法。ここでは、我々 は上記のトピックの多くについて説明し、場所をベスト プラクティスとして提供提案が適切な。
プロトコルは、ソルガム確立された DNA 分離キット11を使用して抽出 DNA からの収集土、根、およびルート サンプル処理を示します。さらに、我々 のプロトコルには、細菌群集12,13,14の構造を決定する一般的利用 NGS プラットフォームを使用して詳細な私アンプリコン シーケンス ワークフローが含まれています。このプロトコルは、根、根、ソルガム、トウモロコシ、およびコムギの15を含む 18 の単子葉種の関連付けられている土壌の最近出版された調査で植物のホストの広い範囲で使用するために検証されています。このメソッドが他のマーカー遺伝子を使用も検証されたリュウゼツラン マイクロバイ16,17いちごマイクロバイに関する研究真菌 ITS2 マーカー遺伝子を勉強への適用によって示されるように18。

<table><tbody><tr><td>0.1-10/20 & マイクロ;Lフィルター付きマイクロピペットチップ</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td>他のサプライヤーからの同等のものと交換できます。</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td>他のサプライヤーからの同等のものと交換できます。</td></tr><tr><td>10 &micro;Lマルチチャンネルピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>3122000027</td><td>他のサプライヤーの同等のものに置き換えることができます。</td></tr><tr><td>10 &micro;L、100 &micro;L、および1000 &micro;L マイクロピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>3120000909</td><td>他のサプライヤーからの同等のものと交換できます。</td></tr><tr><td>100 & マイクロ;Lマルチチャンネルピペット</td><td>Eppendorf</td><td>3122000043</td><td>他のサプライヤーの同等のものと交換できます。</td></tr><tr><td>1000 &マイクロ;Lフィルター付きマイクロピペットチップ</td><td>USA Scientific</td><td>1122-1830</td><td>他のサプライヤーからの同等のものと交換できます。</td></tr><tr><td>2 mL微量遠心チューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1620-2700</td><td>他のサプライヤーからの同等のものと交換できます。</td></tr><tr><td>2 mmの土壌ふるい</td>林<td>業サプライヤー</td><td>60141009</td><td>他のサプライヤーからの同等のものに置き換えることができます。</td></tr><tr><td>200 &micro;Lフィルター付きマイクロピペットチップ</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td>他のサプライヤーからの同等のものと交換できます。</td></tr><tr><td>25 mLリザーバーVWR</td><td>International LLC</td><td>89094-664</td>他の<td>サプライヤーからの同等のものに置き換えることができます。</td></tr><tr><td>50 mLコニカルバイアル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>352098</td>他の<td>サプライヤーの同等のものに置き換えることができます。</td></tr><tr><td>500 mL真空フィルター(0.2 &micro;m孔径)</td><td>VWR International LLC</td><td>156-4020</td><td></td></tr><tr><td>96-well microplates</td><td>USA Scientific</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR plates</td><td>BioRad</td><td>HSP9631</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP beads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9933872</td><td>使用説明書: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180 &documentName=B37419AA.pdf</td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>ボードウォーク</td><td>7124</td><td>他のサプライヤーからの同等のものに置き換えることができます。</td></tr><tr><td>0.001gの分解能を持つ分析スケール</td><td>Ohaus Pioneer</td><td>PA323</td><td>他のサプライヤーからの同等のものに置き換えることができます。</td></tr><tr><td>Bioruptor Plus 超音波装置</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA) 20 mg/mL</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5811000908</td><td>50mL および 96 ウェル プレートを含む バケツアダプター</td></tr><tr><td>極低温手袋</td><td>ミリポア シグマ</td><td>Z183490</td><td>他のサプライヤーからの同等のものに置き換えることができます。</td></tr><tr><td>DNeasy PowerCleanキット(オプション)</td><td>Qiagen Inc.</td><td>12877-50</td><td>以前はMoBio</td></tr><tr><td>DNeasy PowerSoilキット</td><td>Qiagen Inc.</td><td>12888-100</td><td>以前の MoBio</td></tr><tr><td>ドライアイス</td><td>任意の</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁石</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VWR インターナショナル LLC</td><td>89125-188</td><td>を代用しないでください 他のサプライヤーからの同等のものに置き換えることができます。</td></tr><tr><td>ガロンサイズのフリーザーバッグ</td><td>ジップロック</td><td>NA</td><td>他のサプライヤーからの同等のものに置き換えることができます。</td></tr><tr><td>Gemini EMマイクロプレートリーダー</td><td>Molecular Devices</td><td>EM</td><td>は、96ウェルプレートを上から読み取る別の蛍光光度計を使用することができます。</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>白衣</td><td>Workrite</td><td>J1367</td><td>他のサプライヤーからの同等のものと代替できます。</td></tr><tr><td>液体N2</td><td>Any</td><td>NA</td>は<td>他のサプライヤーからの同等のものと代替できます。</td></tr><tr><td>液体 N2 デュワー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4150-9000</td><td>他のサプライヤーからの同等のものと代替できます。</td></tr><tr><td>Milli-Q 超純水製造装置</td><td>ミリポアシグマ</td><td>SYNS0R0WW</td><td></td></tr><tr><td>ミニ遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5404000014</td><td></td></tr><tr><td>モレキュラーグレードの水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4387937</td><td>他のサプライヤーからの同等のものに置き換えることができます。</td></tr><tr><td>迫撃砲VWR</td><td>International LLC</td><td>89038-150</td>他の<td>サプライヤーからの同等のものに置き換えることができます。</td></tr><tr><td>ニトリル手袋</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>19167032B</td><td>他のサプライヤーからの同等のものと交換できます。</td></tr><tr><td>ペーパータオル</td><td>VWRインターナショナルLLC</td><td>BWK6212</td><td>他のサプライヤーからの同等のものと交換することができます。</td></tr><tr><td>PCRプレートシーリングフィルム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC9684493</td><td></td></tr><tr><td>PCRストリップチューブ USA</td><td>サイエンティフィック</td><td>1402-2700</td><td></td></tr><tr><td>乳棒</td><td>VWR International</td><td>LLC 89038-166</td><td>他のサプライヤーからの同等のものに置き換えることができます。</td></tr><tr><td>プラスチックヘラ</td><td>LevGo, Inc.</td><td>17211</td><td></td></tr><tr><td>プラチナホットスタートPCRマスターミックス (2x)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>13000014</td><td></td></tr><tr><td>PNA - 葉緑体およびミトコンドリア</td><td>PNA Bio</td><td>NA</td><td>バイオインフォマティクスで配列を確認してください</td></tr><tr><td>保護メガネ</td><td>ミリポアシグマ</td><td>Z759015</td><td>他のサプライヤーからの同等のものに置き換えることができます。</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS assay kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>ゴム槌 (オプション)</td> <td>Ace ハードウェア</td><td>2258622</td><td>他のサプライヤーの同等のものと交換できます。</td></tr><tr><td>はさみまたははさみ</td><td>VWR International LLC</td><td>89259-936</td><td>他のサプライヤーからの同等のものに置き換えることができます。</td></tr><tr><td>ショベル</td><td>ホームデポ</td><td>2597400</td><td>他のサプライヤーからの同等のものと交換することができます。</td></tr><tr><td>ソイルコアコレクター(小径:<1インチ)</td><td>ベンメドウズ</td><td>221700</td><td>他のサプライヤーからの同等のものと交換できます。</td></tr><tr><td>スプレーボトルサンタ</td><td>クルス</td><td>バイオテクノロジーsc-395278</td>他の<td>サプライヤーからの同等のものと交換することができます。</td></tr><tr><td>標準的な脱塩バーコード付きプライマー(10 &micro;M) (表 1)</td><td>IDT</td><td>NA</td><td>4 nmole Ultramer DNA オリゴと標準的な脱塩。NGSアダプターとシーケンシングプライマー(表1)は、v3ケミストリーを使用してIllumina MiSeqで使用するように設計されています。</td></tr><tr><td>サーモサイクラー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>E950040015</td><td>他のサプライヤーからの同等のものに置き換えることができます。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>他のサプライヤーの同等品と交換できます。</td></tr><tr><td>ボートの重量を量る</td><td>スペクトラムケミカルズ</td><td>B6001W</td><td>他のサプライヤーからの同等のものに置き換えることができます。</td></tr></tbody></table>

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート endosphere から細菌群集のデータを抽出

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

植物宿主と病原性菌の親密な相互作用は植物の適応度を決定する上で重要な非生物的ストレスや病気に対する耐性を改善を促進することができます。工場マイクロバイは、非常に複雑な低コストにすることができます、私アンプリコン ベース 16S rRNA 遺伝子の塩基配列決定など高スループット方法が多いその微生物の組成と多様性を特徴付けるため。しかし、そのような実験を行う際の適切な方法の選択は、難しい分析とサンプルと研究間の比較を行うことができますバイアスを減らすため重要です。このプロトコルは、コレクション、土壌、根圏、およびルート サンプルからの DNA の抽出のための標準化された方法論を詳しく説明します。さらに、我々 はこれらのサンプルの細菌群集組成の調査は、確立された 16S rRNA 増幅シーケンス パイプラインを強調表示し、他のマーカー遺伝子のため簡単に適応することができます。このパイプラインは、ソルガム、トウモロコシ、小麦、イチゴ、アガベを含む植物種の様々 な検証されている、植物細胞小器官からの汚染に関連する問題を克服するを助けることができます。

推奨されるプロトコルを実行する必要があります結果、データセットの各サンプルに戻る一致し、いずれか細菌に代入することができますインデックス付きのペアエンド リードの操作分類単位 (乙) または順序の変形 (ESV、増幅とも呼ばれますシーケンス バリアント (ASV) と sub-operational 分類単位 (sOTU)) は、下流の分析によって異なります。高品質シーケンス データを取得するためにサンプル間の整合性を維持し、サンプル処理やライブラリの準備の間に任意の潜在的なバイアスの導入を最小限に抑えるために各ステップで注意する必要があります。収集した後、処理、および (手順 1 と 2) のサンプルから DNA を抽出すると、はっきりと増幅を抑制すると有機物の無料結果溶出液が表示されます。微量分光光度計による各 DNA のサンプルを測定することにより純度を確認ことができます、我々 は土壌 DNA 抽出キットがすべての汚染物質を確実に削除することを発見しました。予測可能な DNA の品質結果特異 DNA を結合する蛍光ベースの染料に依存して定量化方法が紫外線吸光度<su...

ここでは、土壌、根圏、ルート endosphere 内細菌叢解析・増幅シーケンス データを取得するためのプロトコルについて述べる。この情報は、組成やプラント関連の微生物群集の多様性を調査するため、植物種の広い範囲での使用に適しています。

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

この実験の全体的な目標は、16SリボソームRNA遺伝子のコミュニティプロファイリングを使用して、根のマイクロバイオーム、土壌、根圏、および根の内層の3つのコンパートメントを特徴付けることです。この方法は、マイクロバイオーム構造の重要な推進力である生物的および非生物的要因など、微生物生態学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、根圏と根圏の分離からDNAの抽出、シーケンシングライブラリの準備まで、各ステップを標準化することです。この手順を実演するのは、Coleman-Derr研究所の大学院生であるTuesday Simmonsです。プロトコルを開始するには、エタノール滅菌した土壌コアコレクターで大量の土壌サンプルを採取し、植物の根を含まない土壌を取得します。植物の根元から約23〜30センチメートルのところにコアを集めます。次に、土壌をビニール袋に移し、袋を穏やかに振って土壌を均質化し、土壌サンプルの600ミリグラムのアリコートを1本の2ミリリットルチューブに移し、すぐに2ミリリットルのチューブをドライアイスの上に置いてDNA抽出します。根と根圏を採取するには、エタノール滅菌したシャベルを使用して植物を掘り起こし、できるだけ多くの根を得るように注意します。根の表面に約2ミリメートルの土が付着するまで、根から余分な土をそっと振り落とします。大きな植物の場合は、滅菌ハサミを使用して根の代表的なサブセクションを切断し、最低500ミリグラムの根組織を50ミリリットルの円錐形バイアルに入れます。根を覆うのに十分な着生植物除去バッファーを追加し、すぐにサンプルをドライアイスの上に置きます。根圏を根から分離するには、根のサンプルを氷上で解凍してから、根のサンプルを超音波処理します。滅菌鉗子を使用して、冷やした清潔な50ミリリットルのチューブに根を移します。元のチューブを緩衝材や土と一緒に廃棄しないでください。これには、根圏分数が含まれます。次に、バッファーと根圏の入ったチューブを遠心分離します。上清をデカントし、根圏画分をドライアイスに入れます。根を洗うには、根の部分に摂氏4度の滅菌水を約20ミリリットル加えます。根を15〜30秒間激しく振って洗い、水気を切ります。滅菌ヘラを使用して、250ミリグラムの土壌と根圏を、市販のDNA抽出用DNA分離キットに付属の別々の収集チューブにすばやく移し、キットサプライヤーのプロトコルを使用して続行します。溶出後、アンプリコンライブラリー調製に進む準備ができるまでDNAをマイナス20°Cで保存し、その後、ルートサンプルからDNAを抽出します。滅菌した乳鉢と乳棒を液体窒素で冷やします。600〜700ミリグラムの根組織を測定し、組織を乳鉢に入れ、根を覆うのに十分な液体窒素を慎重に加えます。根を細かく挽きます。液体窒素を添加し、根が微粉末になるまで、サンプル間で一貫性を保ちながら、少なくとも2回粉砕するプロセスを続けます。すぐに、ルートパウダーが解凍し始める前に、滅菌ヘラを使用して、ルートパウダーを氷上の事前に計量された1.5ミリリットルのチューブに移します。チューブと粉末の重量を記録します。滅菌ヘラを使用して、土壌からの抽出用に設計された市販のDNA分離キットに付属の収集チューブに150ミリグラムの根粉末を迅速に移し、キットサプライヤーのプロトコルを使用してDNA分離を進めます。各DNAサンプルをトリプリケートに増幅するのに十分なPCRマスターミックスを調製します。マスターミックスを滅菌済みの25ミリリットルマルチチャンネルピペットリザーバーに注ぎ、新しい96ウェルPCRプレートの各ウェルに66マイクロリットルのマスターミックスを分配します。次に、正規化されたDNAプレートから1マイクロリットルあたり5ナノグラムの6マイクロリットルをマスターミックスプレートに加えます。次に、マスタープレートに1.5マイクロリットルの10マイクロモルフォワードプライマーを追加し、各列が異なるフォワードバーコードを持つように、1.5マイクロリットルの10マイクロモルリバースプライマーを追加します。プレートをフィルムで覆い、プレートを 3 、 000 RCF で短時間回転させます。マルチチャンネルピペットを使用して内容物を穏やかに混合し、25マイクロリットルの反応混合物で3つのプレートに分割し、プレートをPCRフィルムで覆います。サーモサイクラーを使用して各プレートのDNAを増幅します。増幅後、3つのレプリケートプレートを1つの96ウェルプレートにプールします。コンピューターのスプレッドシートを使用して、各サンプルの100ナノグラムの容量と、すべてのサンプルの平均容量を計算します。ブランクPCR産物ごとに、計算された平均容量を1本の1.5ミリリットルチューブに加えます。増幅に成功したサンプルについては、各サンプルの100ナノグラムを同じチューブにプールし、ベンチトップ蛍光光度計を使用してプールされた製品の濃度を測定し、分子グレードの水で600ナノグラムのDNAを1.5ミリリットルのチューブで最終容量100マイクロリットルまで溶出させます。残りのプール製品は、摂氏マイナス20度で保管してください。600ナノグラムのDNAアリコートを精製する前に、600マイクロリットルの新鮮な70%エタノールを調製します。常磁性ビーズを使用して確立されたPCR精製プロセスに従います。磁気ビーズのチューブを振って、底に沈殿するビーズを再懸濁します。1倍容量の100マイクロリットルのビーズ溶液をDNAの600ナノグラムアリコートに加えます。溶液とビーズを10回ピペッティングして完全に混合します。十分に混合した後、室温で5分間インキュベートします。チューブをマグネティックスタンドに2分間、または溶液が透明になるまで置き、ビーズを溶液から分離します。チューブをスタンドに入れたまま、透明な上清を磁気ビーズに触れないように注意深く吸引し、廃棄します。チューブをスタンドに残し、チューブに300マイクロリットルの70%エタノールを加え、ビーズを室温で30秒間インキュベートします。エタノールを吸引し、廃棄します。このプロセスを繰り返し、2回目の洗浄後にすべてのエタノールを取り除きます。マグネットスタンドからチューブを取り外し、内容物を5分間風乾します。乾燥させたビーズに30マイクロリットルの分子グレードの水を加え、10回ピペッティングして混合します。室温で2分間インキュベートします。チューブを磁気スタンドに1分間戻し、ビーズを溶液から分離します。溶出液を新しいチューブに移します。洗浄したプールされたDNAの最終濃度を、ベンチトップ蛍光光度計で測定します。アリコートを最終容量30マイクロリットルで10ナノモルに希釈するか、シーケンシング施設が好む濃度と容量に希釈します。増幅ステップに続いて、シーケンシングを行い、各サンプルの細菌群集組成を決定しました。調査した植物宿主の葉緑体およびミトコンドリアの16SリボソームRNA遺伝子にPNA配列をアラインメントしても、ミスマッチは明らかにならないはずです。13塩基対のPNA配列に対する単一のミスマッチは、提供された葉緑体PNA配列とLactuca sativaまたはレタスの葉緑体16SリボソームRNA遺伝子の場合のように、有効性を劇的に低下させる可能性があります。サンプルごとに同量の増幅DNAがプールされたため、シーケンシング後、細菌分類群に一致する偶数の読み取りがサンプルごとに取得され、バーコードインデックスに基づいてソートされました。この手法を習得すると、8つのプラントで約8時間で行うことができます。この手順を試行する際は、実験間で一貫性を保つことが重要です。DNA抽出方法やPCRマスターミックスの変更などの小さな詳細がバイアスを引き起こす可能性があります。この手順に続いて、メタトランスクリプトミクスなどの他の方法を使用して、どの微生物が活動しているか、どの遺伝子を発現しているかなどの追加の質問に答えることができます。液体窒素の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、適切なPPEの着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Genetics

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