Name: C2C12 細胞によるトランス プラズマ膜電子輸送特性の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 学ぶC2C12細胞を用いたトランスプラズマ膜電子輸送の分光光度法によるリアルタイム測定法。細胞内レドックス環境の維持メカニズムを解明し、レドックス生物学研究に貢献します。

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彼らのテクニカル サポートのトーマス ・ ベル、リン Mattathil、マーク Mannino、Neej patel さんに感謝したいと思います。この作品は、米国公衆衛生サービス賞 R15DK102122 国立糖尿病・消化器・腎臓病 (NIDDK) からジョナサンフィッシャーによって支えられました。原稿内容は著者の責任し、もの、NIDDK または健康の国民の協会の公式見解ではありません。

注: は、主な手順の概要を図 1を参照してください。
1. WST 1 還元能の測定
<ol><li>成長し、C2C12 行 A ~ F を利用した 96 ウェル プレートで標準的な細胞培養手順7を使用して付着性のセルを区別します。<ol>
<li>構成のダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 2% 馬血清、100 U/mL ペニシリン、ストレプトマイシン 0.1 mg/mL と分化培地を使用します。5% CO2と 37 ° C でセルを孵化させなさい。</li>
		<li>アスコルビン酸 tPMET 関与を監視する場合は、100 μ M アスコルビン酸による分化メディアを補足します。24 ~ 48 の分化メディアでインキュベートする h。</li>
	</ol>
</li>
	<li>WST 1 と PMS の貯蔵液を準備します。<ol>
<li>WST 1 の 10 の mM の在庫をするためには、WST 1 の 0.033 g を溶解 (式重量 (FW): 651.34 g/mol) を 5 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)。4 ° C でのストア</li>
		<li>PMS の 5 mM の在庫をするためには、PMS の 0.0023 g を溶解 (FW: 306.34 g/mol) 1.5 ml の脱イオン H2O (式行先方向2O)。-20 ° C で保存し、光から保護します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>11.4 mL の PBS か HEPES に 5 mM の最終濃度緩衝生理食塩水 0.0108 g のブドウ糖を追加 (HBS; 20 mM HEPES ナトリウム塩、140 mM の NaCl、KCl、2.5 mM MgSO4、5 mM 1 mM CaCl2)。5 mM 20 μ M の最終的な集中のための PMS の 48 μ L ・ 400 μ M の最終濃度 10 mm WST 1 480 μ L を追加します。</li>
	<li>アスコルビン酸 tPMET 関与を監視する場合は、ソリューションを 2 つ 6 mL 因数に分割します。1 つの因数に式行先方向2O の 6 μ L を追加し、他の因数 2 区/mL AO 2 U/mL の最終的な集中のための 6 μ L を追加します。</li>
	<li>TPMET 活性酸素関与を監視する場合は、ソリューションを 2 つ 6 mL 因数に分割します。1 つの因数を 0.1 M KPO4バッファーの 55 μ l 添加し他の因数に 6.5 区/mL SOD 60 U/mL の最終的な集中のための 55 μ L を追加します。</li>
	<li>PBS のセルを洗浄します。メディアを吸引し、150 μ L の PBS を追加します。その後、PBS を吸い出しなさい。 注: アッセイは、メッキ、添付の細胞で行われます。したがって、遠心分離または洗浄工程におけるトリプシンの使用はありません。</li>
	<li>WST 1 ソリューション (-) を 100 μ l 添加 SOD または (-) AO 列 1-6 にし 100 μ L WST 1 ソリューション (+) SOD のや (+) AO 96 ウェル プレートの 7-12 列に追加します。G と H の行を使用して、バック グラウンド コントロールとして (すなわち変化を監視するセルのない井戸で試薬のみで吸光度の)。</li>
	<li>438 で 1 時間 10 分毎の分光光度計を使用して吸光度を測定 nm。</li>
	<li>読んだ後、メディアを吸引し、それぞれを洗って、150 μ L の PBS。その後、PBS を吸い出しなさい。</li>
	<li>ためにも、その任意の時点での吸光度からも初期の吸光度を差し引くことによって各ウェルの吸光度の変化を計算します。吸光度 (もしあれば) バック グラウンド井戸 (すなわち、分析ソリューションと井戸がない細胞) にみられる変化のこの変更を修正します。</li>
	<li>分析のため 60 分制御測定吸光度データを正規化または PBS または HBS と井戸を洗浄し、ビシンコニン酸 (BCA) タンパク質アッセイを行います。</li>
	<li>2 Mg/ml とウシ血清アルブミン (BSA) 標準を追加 (0.5 ~ 2 範囲セルの合流点の程度に応じて、標準曲線の μ L) 空井戸 (G と H の行) に、すべての井戸に BCA 試薬を追加。</li>
	<li>WST 1 排出削減量 μ g 蛋白の nmol を介してデータを定量化します。438 で減らされた WST 1 の消散係数として 37 mM-1 cm-1 22を使用 nm。</li>
</ol>2. プラズマ還元能の測定
<ol><li>成長し、1.1 の手順と同じ手順で C2C12 付着性のセルを区別するため。</li>
	<li>とおり株式 10 mM プラズマ ソリューションを準備します。プラズマの 0.029 g を溶解 (FW: 290.08 g/mol) 式行先方向2O. 確認 600 で吸光度を測定することによってプラズマの濃度の 10 mL の分光光度計との nm。600 で減らされたプラズマの消散係数として 1 mM-1 cm-1 23を使用 nm。4 ° C でのストア</li>
	<li>0.0108 g のグルコースを最終濃度 5 mM の 11.880 mL の PBS に追加します。10 mm プラズマ最終濃度 100 μ M 120 μ L を追加します。</li>
	<li>アスコルビン酸 tPMET 関与を監視する場合は、ソリューションを 2 つ 6 mL 因数に分割します。1 つの因数に式行先方向2O の 6 μ L を追加し、他の因数 2 区/mL AO 2 U/mL の最終的な集中のための 6 μ L を追加します。</li>
	<li>TPMET 活性酸素関与を監視する場合は、ソリューションを 2 つ 6 mL 因数に分割します。1 つの因数を 0.1 M KPO4バッファーの 55 μ l 添加し他の因数に 6.5 区/mL SOD 60 U/mL の最終的な集中のための 55 μ L を追加します。</li>
	<li>メディアを吸引し、150 μ L の PBS のセルを洗ってください。PBS を吸引し、プラズマ ソリューション (-) を 100 μ l 添加 SOD または (-) AO 列 1-6 に 100 μ L プラズマ ソリューション (+) SOD のまたは 96 ウェル プレートの 7-12 列に (+) AO を追加。行 G と H はバック グラウンド コントロールとして使用 (つまり変化を監視するセルのない井戸で試薬のみで吸光度の)。</li>
	<li>600 nm を使用して吸光度を測定分光光度計 10 分毎 1 時間の 60 分 1.9 1.13 の手順と同様にコントロールに対する相対吸光度の変化を定量化します。</li>
</ol>3. 削減電子アクセプターが AO や SOD 用基板であるかどうかの決定
<ol><li>5.436 mL の PBS か HBS、400 μ M の最終的な集中と 5 mM 20 μ M の最終的な集中のための PMS の 24 μ L の 10 mm WST 1 240 μ L を追加します。<ol>
<li>プラズマ、PBS または HBS 5.940 mL に 10 mM プラズマ、最終濃度 100 μ M の 60 μ L を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞の不在中のフラット底 96 ウェル プレートによく各 438 で分光光度計で吸光度を測定しソリューションを 100 μ l 添加プラズマの WST-1、または 600 nm の nm。</li>
	<li>最終濃度 100 μ M の井戸の半分に 10 mM のアスコルビン酸の 1 μ L を追加します。それが安定するまでは、吸光度を監視します。</li>
	<li>安定化時に各ウェルに 2 U/mL の最終濃度 200 U/mL AO の 1 μ L を追加または各 60 U/mL の最終濃度も、1 h の吸光度を監視、6 区/mL SOD の 1 μ L を追加します。</li>
</ol>

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<li>Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+species+derived+from+the+family+of+NOX+NADPH+oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases.</a> Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).</li>
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我々 は、C2C12 細胞に tPMET を監視する吸光光度アッセイでの細胞外の電子アクセプター、WST 1、プラズマを利用するための 2 つの方法を提示しています。標準培養プロシージャのセルラインの成長と分光光度計プレート リーダー、単純なマイクロ プレート法でこれらの電子アクセプターと tPMET を監視することが可能です。WST 1 削減は、アッセイ内の井戸-井戸から再現が、日々 変動があります。変動 (CV) バッファーとして PBS を活用した日常的な係数は 0.18 と CV バッファーが 0.23 HBS を活用します。
Mpm と WST 1 を利用した先行文献、修正を加えて、このプロトコルでは、具体的には、月経前緊張症の使用のため。したがって、PMS の適切な濃度を決定する含まれているトラブルシューティング、WST-1 であるとの使用のために記載されています。各吸読書の前に板を振動することは重要である、(23-37 ° C の範囲) 内の温度はない、試金のための重要なコンポーネントでことも決定。ただし、アッセイを適用する他の細胞のこれらの問題を調査する必要がありま...

精製膜の電子受容体を減らす機能は、ビュー固有の酸化還元能力1は、細胞膜につながっています。動物、植物、菌類に見られる以前、tPMET、複数生物2,3,4,5一般的なプロセスです。具体的には、このプロセスは、酵母、ニンジン培養細胞、赤血球、リンパ球、骨肉腫、悪性黒色腫、大食細胞、骨格筋、好中球2,3、で実証されています。4,5,6,7. 細胞酸化を減らすために原形質膜の間で電子を輸送するプロセスで tPMET を含む多くの細胞機能に関与している: セル成長5,8, 細胞生存率9, 鉄代謝10、セルシグナ リング11,12,13、および活性酸素種12,14,15からの保護。TPMET の不均衡ががん16, 心血管疾患17を含むいくつかの深刻な健康状態の発展に貢献するという仮説が tPMET のおかげで多くの細胞機能と代謝症候群18。
血しょう膜の間で電子の移動を監視する複数の方法がありますが、最も広く使用されている手法は、比色試金を介して細胞外の電子アクセプターの削減を評価します。一般的に使用される細胞外電子アクセプターはテトラゾリウム塩、プラズマ、FeCN、フェリチト クロム c19,20。最も一般的に使用されるテトラゾリウム塩は、WST 119の第二世代塩知られています。この化合物は 2 つスルホン酸のグループがあり、その水への溶解度21になるため最初の世代テトラゾリウム塩と比較して比色試金で使用する簡単です。WST-1 中間電子アクセプター 1-メトキシ-フェナチン methosulfate (Mpm) と組み合わせて、2 つの単電子転送イベントに削減されます。この減少は、WST 一色弱酸化型をより強烈な黄色の塩20,22に変更します。WST 1 が 37 × 103 M-1cm-1、高モル吸光係数高い測定感度21,22に 。プラズマはまた tPMET を監視するため細胞外の電子受容体として利用されています。これは、プラズマが tPMET 中間電子アクセプター23,24の援助なしで細胞外に減らすことが示されています。中間電子アクセプターの不足、プラズマは直接ピックアップ WST 124とは異なり、細胞膜から電子ことができます。プラズマと同様に、FeCN は細胞外 tPMET 中間電子アクセプター19,24の助けを借りずにフェロシアン化する縮小する示されています。WST 1 やプラズマと違って FeCN が低いアッセイ感度9につながる低分子吸光係数です。TPMET を監視するもう一つの一般的に使用される細胞外電子アクセプターは、フェリチト クロム c 中間電子アクセプター、Mpm22使ってフェリチト クロム c 削減増加、WST 1 と同様です。WST 1 とは異なり、フェリチト クロム科学的方法は高いバック グラウンド化低分子吸光係数22敏感。
吸光光度法による tPMET のリアルタイム解析法をご紹介します。メソッドは、使用されますが一般的、他と比較されて安価フェリチト クロム c など細胞外の電子アクセプター、両者は高分子吸光係数を持っている WST 1、プラズマ、細胞外の電子受容体を利用しました。フェナジン methosulfate (PMS) 利用 Mpm の代わりに類似した化学構造、PMS ははるかに高価です。Mpm は光化学安定した長い貯蔵寿命を必要があります市販キットの重要な特徴であります。しかし、我々 PMS 新鮮なを確認各試金のための安定性の問題をすべきではないです。酵素間の相互作用 (図 1を参照) さらに tPMET のプロセスを特徴付けるために利用されるかもしれない酵素と細胞外の電子受容体を評価する方法を提案する.具体的には、AO と SOD を使用ことができます酵素アスコルビン酸輸送や細胞のスーパーオキシド リリースでは、膜の間で運ばれる電子の 2 つの一般的な方法は、tPMET のどの部分を決定します。

<table><tbody><tr><td>C2C12筋芽細胞アメリカン</td><td>タイプカルチャーコレクション&nbsp;</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコの修正されたワシの媒体 - 低グルコース</td><td>シグマ</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>胎児プレックス動物血清複合体</td><td>ジェミニバイオ製品&nbsp;</td><td>100-602</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Σ</td><td>516106</td><td></td></tr><tr><td>馬血清</td><td>Gibco Technologies</td><td>16050-130</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水</td><td>ΣD8537</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>Σ</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>15 cm 培養皿</td><td>TPP</td><td>93150</td><td></td></tr><tr><td>96 井戸培養プレート</td><td>TPP</td><td>92096</td><td></td></tr><tr><td>2-(4-ヨウドフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルフォフェニル)-2H-テトラゾリウムナトリウム塩(WST-1)</td><td>Accela ChemBio&nbsp;Inc</td><td>SY016315</td><td></td></tr><tr><td>フェナジンメトスルフェート&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>シグマ</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸オキシダーゼ&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A0157</td><td></td></tr><tr><td>スーパーオキシドジスムターゼ&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>S5395</td><td></td></tr><tr><td>2,6-ジクロロインドフェノールナトリウム塩&nbsp;</td><td>ICN Biomedicals</td><td>215011825</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES ナトリウム塩</td><td>Sigma</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>Σ</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP363</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Powerwave X-I 分光光度計</td><td>Biotek Insturments</td><td>販売終了&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spectronic Genesys 5 分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>336001</td><td></td></tr><tr><td>PureGrade 96 ウェルマイクロプレート、F-底、透明、未処理、非滅菌</td><td>MidSci</td><td>781602</td><td></td></tr><tr><td>塩化鉄 (II) 四水和物</td><td>Sigma</td><td>220299</td><td></td></tr><tr><td>鉄 (II) 硫酸塩七水和物</td><td>Sigma</td><td>215422</td><td></td></tr><tr><td>ヒポキサンチン</td><td>Sigma</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>キサンチンオキシダーゼ</td><td>Sigma</td><td>X4500</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R Studio</td><td>Rstudio</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/ KC4</td><td>Biotek Insturments</td><td>販売終了&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

c2c12 細胞によるトランス プラズマ膜電子輸送特性の測定

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

トランス プラズマ膜電子輸送 (tPMET) は、細胞の酸化剤によって損傷からの保護と同様に、細胞内還元ストレスからの細胞の保護の役割を果たします。細胞の酸化細胞内還元剤から電子を輸送のこのプロセスはよく定義されません。細胞外の電子受容体を用いた tPMET を監視する C2C12 細胞によって吸光光度アッセイを紹介: 水溶性テトラゾリウム塩 1 (WST-1) と 2, 6 ‐ ジクロルフェノールインドフェノール (プラズマまたはなった)。これらの電子アクセプターの削減、リアルタイム解析で、このプロセスを監視することがおります。アスコルビン酸オキシダーゼ (AO) やスーパーオキシドディスムターゼ (SOD) アッセイなどの酵素のほか、tPMET のどの部分がアスコルビン酸のエクスポートまたはスーパーオキシド生産、それぞれを判断できます。WST 1 は、低バック グラウンドで安定した結果を生成する示されていたプラズマ AO と吸光光度分析と実証された SOD の付加の後で再酸化することができた。このメソッドは、吸光光度法がリアルタイム、マルチも、クイック フェリシアン (FeCN) フェリチト クロム c 削減などの tPMET を監視するために使用他の方法上の利点を示します。

統計は、RStudio 統計ソフトウェア25を使用して反復測定分散分析で行った。サンプル サイズは、図の凡例に示されます。
TPMET を監視するには、C2C12 細胞が細胞外の電子アクセプター、WST 1 とプラズマと共に利用されます。AO は WST 1 のどの部分を決定するために使用されたプラズマ還元されたアスコルビン酸の排出が原因と SOD は、WST 1 削減の部分は細胞のスーパーオキシドのリリースのための決定に使用されました。図 2に示すとおり、C2C12 細胞は WST 1 の減少によって見られるように tPMET が可能です。AO の追加により、WST 1 削減は tPMET の ~ 30% がアスコルビン酸 (図 2 a) の輸出が原因だったことを示す ~ 30% によ...

このプロトコルの目標はオンカラム細胞外の電子受容体を用いたトランス プラズマ膜電子輸送を監視し、これらの細胞外の電子アクセプターに発生する酵素の相互作用を解析します。

C2C12 細胞によるトランス プラズマ膜電子輸送特性の測定

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

この手順の全体的な目標は、分光光度アッセイを通じて、トランスプラズマ膜の電子輸送のプロセスをリアルタイムで監視することです。この方法は、トランスプラズマ膜電子輸送のメカニズムと細胞の酸化還元環境がどのように維持されるかに関するラドックス生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、アッセイがリアルタイム、マルチウェル、迅速な分光光度法であることです。まず、C2C-12接着細胞を96ウェルプレートの列AからFの列に1平方センチメートルあたり10〜4番目の細胞の2倍に座らせ、次に細胞を増殖培地で覆います。摂氏37度のインキュベーターで細胞を5%二酸化炭素とインキュベートします。培養で24時間後、増殖培地を吸引し、150マイクロリットルのPBSで洗浄し、分化培地と交換し、さらに24〜48時間細胞をインキュベートします。次に、ストックWST-1およびPMS溶液を準備します。033グラムのWST-1を5ミリリットルのPBSに溶解することにより、WST-1の10ミリモルストック溶液を作成します。次に、溶液をボルテックスします。次に、0023グラムのPMSを1.5ミリリットルのイオン水に溶解することにより、PMSの原液を調製します。解決策をボルテックスします。作業溶液を調製するには、PBSにグルコースを加えて、11.4ミリリットルの5ミリモルグルコース溶液を作ります。この溶液に、480マイクロリットルのWST-1ストック溶液を添加して最終濃度を400マイクロモルWST-1にし、48マイクロリットルのPMSストック溶液を添加して最終濃度を20マイクロモルPMSにします。溶液を渦巻きにして混ぜます。次に、溶液を2つの6ミリリットルアリコートに分割します。アッセイに応じて、ここで説明する関連成分を添加します。溶液を調製した状態で、細胞から分化培地を吸引し、150マイクロリットルのPBSで1回洗浄します。PBSを取り外し、アリコート1から100マイクロリットルを列1から6に追加します。そして、アリコート2から96ウェルプレートの7列目から12列目に100マイクロリットルを追加します。96ウェルプレートをプレートリーダーにセットし、438ナノメートルで1時間、10分ごとに吸光度値を測定します。最終読み取り後、メディアを吸引し、150マイクロリットルのPBSで各ウェルを洗浄します。次に、PBSを吸引します。分析では、同じウェルの後の時点での吸光度からウェルの初期吸光度を差し引くことにより、各ウェルの吸光度の変化を計算します。バックグラウンドウェルで観察される吸光度の変化に基づいて、この変更を修正します。背景を補正したら、吸光度データを 60 分間のコントロール測定値に正規化します。あるいは、標準的なBCAタンパク質アッセイを使用して、各ウェルのタンパク質含有量で標準化します。最後に、データを定量化して、WST-1 の減少量をマイクログラムのタンパク質で求めます。DPIP還元アッセイを開始するには、WST-1還元アッセイで示されているように、C2C-12接着細胞を増殖させ、分化させます。次に、029グラムのDPIPを10ミリリットルのイオン化水に溶解することにより、10ミリモルDPIPを含むストック溶液を調製します。次に、溶液をボルテックスします。分光光度計を使用して溶液の吸光度を600ナノメートルで測定することにより、濃度を確認します。ワーキングソリューションを作成するには、10ミリモルのDPIPストック溶液の120マイクロリットルをグルコースとPBSの5ミリモル溶液の11.88ミリリットルに加えて、100マイクロモルの最終DPIPワーキング濃度にします。次に、溶液をボルテックスします。次に、溶液を2つの6ミリリットルアリコートに分割します。アッセイに応じて、ここで説明する関連成分を添加します。溶液を調製した状態で、細胞から分化培地を吸引し、150マイクロリットルのPBSで1回洗浄します。PBSを取り外し、アリコート1から100マイクロリットルを列1から6に追加し、アリコート2から列7から12に96ウェルプレートを追加します。96ウェルプレートをプレートリーダーにセットし、600ナノメートルで1時間、10分ごとに吸光度値を測定し、WST-1還元アッセイ分析で説明されているように結果の値を分析します。まず、2つの解決策を準備します。まず、PBSに400マイクロモルのWST-1と20マイクロモルのPMSを6ミリリットル調製します。次に、DPIPとPBSの100マイクロモル溶液を6ミリリットル調製します。細胞が存在しない平底板の列AからDに100マイクロリットルのWST-1/PMS溶液を加えて最初の96ウェルプレートを調製し、438ナノメートルの分光光度計で吸光度を測定します。次に、細胞が存在しない平底板の列AからDに100マイクロリットルのDPIP溶液を加えて、2番目の96ウェルプレートを調製し、分光光度計で600ナノメートルの吸光度を測定します。次に、ウェルの半分に1マイクロリットルの10ミリモルアスコルビン酸を加えて、最終濃度を100マイクロモルにします。プレートが安定するまで、プレート内の吸光度を監視します。この後、DPIPで繰り返します。安定化したら、生成された電子受容体が基板であるかどうかを判断します。スーパーオキシド変異化物用アスコルビン酸オキシダーゼは、アスコルビン酸オキシダーゼまたはスーパーオキシド変異化物のいずれかを各ウェルに添加し、吸光度の変化を1時間観察します。トランスプラズマ膜の電子輸送をモニターするために、アスコルビン酸オキシダーゼを使用してアスコルビン酸を介した還元の影響をブロックし、スーパーオキシドジスムターゼを使用してスーパーオキシドを介した還元をブロックして、WST-1 の還元のどの部分が各成分によるものかを決定しました。アスコルビン酸オキシダーゼの添加により、WST-1の減少が約30%抑制され、トランスプラズマ膜の電子輸送の約30%がアスコルビン酸の輸出によるものであることが示されました。スーパーオキシドジスムターゼの添加により、WST-1の減少は約70%抑制され、トランスプラズマ膜の電子輸送の約70%が細胞外スーパーオキシド放出によるものであったことが示された。減少したDPIPがアスコルビン酸オキシダーゼまたはスーパーオキシドジスムターゼの基質であるかどうかを判断するために、DPIPレベルをアスコルビン酸で低減しました。20分後、アスコルビン酸オキシダーゼを添加し、吸光度をモニターしました。回収率は、DPIPの低下がアスコルビン酸オキシダーゼの基質であることを示しています。スーパーオキシドジスムターゼを添加すると、DPIPも再酸化されましたが、速度は遅くなりました。したがって、還元DPIPはこれらの酵素の基質であり、これらの酵素とともに利用される適切な細胞外電子受容体ではありません。このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば2時間で完了することができます。この手順を試す際には、すべての試薬を毎日新鮮にすることを忘れないようにすることが重要です。その開発後、この技術は、酸化還元生物学の分野の研究者がさまざまな細胞タイプにおける細胞膜貫通電子輸送を研究する道を開きました。このビデオを見れば、細胞外電子受容体を利用したトランスプラズマ膜の電子輸送の測定方法や、その電子受容体がアッセイで利用される酵素の基質であるかどうかを判断する方法について、十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

規制エンドサイトーシスは、膜タンパク質の大部分の細胞表面発現レベルを制御します。ここでは、ドーパミントランスポーター（DAT）、ポリトープ膜​​タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するために還元、膜非透過性ビオチン化試薬を利用する。メソッドは、ほとんどの細胞膜タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するための直接的なアプローチを促進する。...

リバーシブルビオチン化によって原形質膜タンパク質エンドサイトーシス率を測定

細胞内のミトコンドリアの機能をプロファイリングするための方法の説明が表示されます。基礎呼吸速度、ATP...

C2C12筋芽細胞を用いた生体エネルギープロファイル実験

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

単離ミトコンドリアマウス心臓におけるミトコンドリア透過性遷移孔の開口部を測定するための分光蛍光プロトコルがここに提示されます。アッセイは、ミトコンドリアCaの同時測定を含む...

単離ミトコンドリアマウス心臓における透水性遷移孔の開口部のマルチパラメータ測定

骨格筋は歩行のために不可欠であり、団体「メインタンパク質店です。 C.エレガンス内の筋肉の健康の測定について説明する。筋肉の構造と機能の将来の変更は、ローカライズされたGFPおよびカチオン染料を使用して評価される。...

筋肉の細胞内コンパートメントを評価するための方法 C。エレガンス

広筋のヘイケボタルの生検、精製されたミトコンドリアの準備、および呼吸計測プロファイリングのための方法が記載されている。小さな筋肉量の使用は、臨床研究用途のためにこの技術に適しています。...

経皮針生検によって得られた骨格筋組織から単離されたミトコンドリアの調製と呼吸計測評価

提示された方法は、マウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用したマイクロプレートベースの呼吸測定アッセイのコレクションの性能について、段階的な指示を提供します。これらのアッセイは、一般的に使用される動物モデルにおけるミトコンドリア酸素消費量の機構的変化/適応を測定することができます。...

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

ここでは、プロトコルを提案単一リポソームの脂質膜を渡るプロトン透過の分子機構の研究例としてシトクロムbo3を使用します。電気化学、蛍光顕微鏡、単一小胞、含む単一または複数の酵素のルーメン内の pH...

電気化学と蛍光顕微鏡を用いたプロトン ポンプ膜酵素の研究のための単一リポソーム測定

以前に凍結したアーカイブされた固体組織からのミトコンドリア濃縮サンプルを調製し、研究者は様々な実験モダリティでミトコンドリアの機能的および分析的評価を行うことを可能にした。この研究は、凍結した心臓組織からミトコンドリア濃縮製剤を調製し、ミトコンドリアの分析評価を行う方法を示す。...

ソウの子孫から以前に凍結した心臓組織におけるミトコンドリア電子伝達複合体の測定:運動誘発ミトコンドリアバイオエネルギーの変化を評価するモデル

ミトコンドリアは、骨格筋の表皮形成性の高いレベルを示す重要な代謝小器官です。細胞質ゾルからのタンパク質のインポートは、レチクルムの拡張とミトコンドリア機能の維持に不可欠なオルガネラ生物形成のための重要な経路です。 したがって、タンパク質のインポートは、細胞の健康のバロメーターとして機能します。...

骨格筋ミトコンドリアのタンパク質輸入能の測定

このプロトコールは、部分的にセグメント化された機能的CoQプールの存在を研究するために、Na+の存在または非存在下でのミトコンドリア複合体活性CI+ CIIIおよびCII +...

Na+ に対するミトコンドリア内膜感受性が部分的にセグメント化された機能的CoQプールを明らかにする

学ぶC2C12細胞を用いたトランスプラズマ膜電子輸送の分光光度法によるリアルタイム測定法。細胞内レドックス環境の維持メカニズムを解明し、レドックス生物学研究に貢献します。

C2C12 細胞によるトランスプラズマ膜電子輸送特性の測定

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