Name: マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 学ぼう、マウス腹腔マクロファージを用いた貪食のリアルタイム3Dイメージング手法。回転円盤共焦点顕微鏡で粒子摂取動態を可視化し、免疫応答のメカニズム解明に役立つ強力なツールです。

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<li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of immunological. 342, 71-77 (2009).</li>
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<li>Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+natural+IgM%3A+scavenger%2C+protector+and+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator.</a> Nature reviews. Immunology. 10, 778-786 (2010).</li>
<li>Closse, C., Dachary-Prigent, J., Boisseau, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylserine-related+adhesion+of+human+erythrocytes+to+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+haematology%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylserine-related adhesion of human erythrocytes to vascular endothelium.</a> British journal of haematology. , 300-302 (1999).</li>
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著者が明らかに何もありません。

エンドポイントと高スループット試金、特に食作用の試金の大半は、どの粒子実際にキャプチャされ、包まれて、摂取の可視化を提供しません。ムンテ ・ カースらによる先駆的な研究10とカプラン2 1970 年代に著しく異なる細胞骨格の再編成が補完するオプソニン粒子 (羊赤血球) 対 IgG オプソニン貪食に関与していたことが示唆されました。ここで我々 は食作用の試金回転ディスク共焦点顕微鏡を用いた単一食イベントの高解像度、リアルタイム イメージングが可能をについて説明します。私たちのモデルの食細胞は、マウス常駐腹腔マクロファージでは最小限の処理を分離できるので、粒子として新鮮単離ひと赤血球を用いて。ただし、食作用の試金はマウス骨髄由来マクロファージや好中球、マウスのマクロファージ細胞株、ひと単球由来マクロファージひと末梢血好中球などの他の食細胞に適用でした。人間の食やマウス好中球の場合代わりに蛍光標識抗体が蛍光に分類された抗 CD14 抗体 (ひと単球/マクロファージ)16または抗 Gr 1 Ly (6 G) 抗体 (マウスなど、必要になります好中球)。
Unopsonized ひと赤血球、伝統的に使用される羊赤血球細胞のようなこれらの細胞はマウス腹腔マクロファージによって摂取されません (または、少なくとも、非常にまれ) という意味で不活性。これにより、ポリスチレン ビーズと対照をなして低バック グラウンド アクティビティです。ひと赤血球は便利な CD235a に対してマウス IgG または IgM モノクローナル抗体を用いた免疫グロブリンとオプソニンができます (グリコフォリン A) ひと赤血球 (赤い血液細胞)、赤芽球前駆体17,の特異的マーカー18. オプソニン化を確認する平行アッセイ、蛍光標識抗マウス IgG または igm 抗体二次抗体を適用できます。Igg 抗体と IgM 抗体のクラスは、赤血球、赤血球凝集を引き起こす物質 (抗体) です。凝集を避けるためには、我々 断続的に細胞懸濁液 8 分潜伏期間中に抗 CD235a 抗体と混ぜて洗浄ステップなしマクロファージを含むチャネル スライド (フィブロネクチン コート スライド) に直接混合の懸濁液を加えます.洗浄の手順は、遠心沈降法による凝集反応を強く促進する赤血球の沈降を伴います。ひと赤血球を opsonizing 前に脂溶性オレンジ/レッドの蛍光プローブを用いた細胞膜をラベルします。このプローブは、時間経過の録音の冒頭に鮮やかな蛍光が信号から徐々 に、おそらく主に退色19のため。さらに、マクロファージとスライドのフィブロネクチン コーティング弱オレンジ/レッドのレコーディング中に蛍光になります。この問題はおそらくひと赤血球のラベル付け後の洗浄不足が原因です。脂溶性蛍光膜マーカーを使用する代わりにアミン反応性染色エステル15,20を使用して pH に敏感なローダミン誘導体とひと赤血球を分類する可能性があります。以来、蛍光強度は増加する pH15、20、減少傾向が、このアプローチがあります反応エステル製剤は現在欠点ファゴソーム成熟の可視化の利点があります。高価で、水溶液に溶解後不安定。
IgG オプソニンひと赤血球が由来マクロファージを用いた NOTAM21またはFcer1g-/- (Fcer1g ノックアウト) 確認することができます FcγRs 経由で摂取されます。NOTAM マクロファージ IgG オプソニンひと赤血球、バインドが、ITAM (細胞チロシン活性化モチーフ) を欠いている - Fcer1gノックアウト マクロファージ表面 FcγRs igg 抗体を発現していないのに対し、貪食能を誘導するために必要なシグナリングを仲介 -。IgM オプソニンひと赤血球は、新鮮単離血清補体 C5 null マウスの細胞を培養によって (これは iC3b へ切断) C3b とまたオプソニンできますか (野生型血清, 溶血が原因)。IgG および IgM オプソニン毛穴 (膜の攻撃の複合体)、セル換散の形成につながる古典的な補をアクティブにします。C3 胸の谷間を補完するために補体 C5 に欠けているマウス、補体カスケードの収入が C5 転換酵素は、ターミナルの経路を触媒に必要な基板を欠いています。補体カスケードの動態を測定する簡単なアッセイを開発しました。一言で言えば、ひと赤血球は共同蛍光赤、膜マーカー、グリーンの蛍光、ゾル性細胞質の蛍光で標識することができます。複雑な膜の攻撃の形成、ゾル性細胞質の蛍光体補体成分、C5 C9 によって形成される急速に (単位は秒) が細胞質から失われました。補体カスケードのエンド エフェクタ (細胞崩壊) 関数の可視化は、4 分インキュベーション時間が人間の赤い血球の C3b/iC3b オプソニン十分であることを示されます。並列の試金のひと赤血球の C3b/iC3b コーティングは簡単に抗マウス C3b の混合物を適用した後に評価、蛍光標識した二次抗体できます。この場合、洗浄手順は、非連結の蛍光抗体を削除する必要です。洗浄ステップには凝集を促進し、遠心分離によって細胞沈降が含まれますが、共焦点顕微鏡による成功オプソニン化を容易に評価できます。いずれか適用する IgG によって視覚化される補体受容体を介した貪食/NOTAM またはFcer1g-/- マクロファージ細胞人間の赤い血を iC3b オプソニン IgM-を導入したり iC3b オプソニンひと赤血球細胞に野生型マクロファージ。IgM オプソニンの血液細胞は、ITAM を含む FcγRs (FcγRI、FcγRIII および FcγRIV) IgG オプソニン粒子22の貪食能に必要なによって認識されません。
イメージを貪食するには、イベント、マクロファージの細胞膜はマウス大食細胞の特異的マーカーとしても緑蛍光蛍光共役アンチ-F4/80 抗体と分類することがことができます。ひと赤血球レンダリングできます赤蛍光孵化によって赤/オレンジ蛍光膜マーカーでは、前述の通り。これは脂溶性の細胞膜マーカー抗体ベースのラベルの潜在的な交絡因子を回避できます。赤蛍光赤血球、オプソニン化、有無できるチャネル スライドの 100 μ L チャンネルに直接戻され、60 X を介して 3 D タイムラプス イメージング/1.49 油浸漬 (または類似の) 対物レンズを用いて、488 nm と 561 nm レーザー ライン、それぞれの回転のディスク共焦点 (または類似の) 顕微鏡。高解像度画像ですが繰り返される Z スタック 16 分以上の獲得のためにシステムを最適化するために魅力的なだからかなり退色、光毒性を引き起こす可能性があります。我々 は 2 × 2 良い信号対雑音比を促進し励起強度および/または露出時間でも光学解像度を犠牲にして削減を許可するビニングを使用しました。さらに、光毒性を減らすためには、我々 はメディアに活性酸素のスカベン ジャーを追加します。将来の研究で、アッセイはアポトーシスひと赤血球の貪食能を画像に修正できます。A23187 など、Ca2 +イオノフォアのアプリケーションは、信号と早期アポトーシス24,25の認刻極印にホスファチジルセリン外在化23、「私を食べて」を誘導するために使用できます。

1862 年、血液による不溶性色素粒子の貪食で、Metchnikoff の 1882 年に、ヒトデの幼生の貪食間充織細胞の観察と貪食1の彼の理論の後続の開発の前に二十年アーネスト ・ ヘッケル説明テティス fimbris (テティス采)、略奪の海スラグ (アーネスト ・ ヘッケルの種の細胞。Radiolarien (Rhizopoda radiaria) は死ぬ: アイネ ・か。Druck und Verlag ・ フォン ・ ゲオルク ・ ライマー、ベルリン、1862)。彼は明示的に、細胞質に取り込まれ、その後、細胞の核の周囲に蓄積する粒子を包み込む膜の突起を説明します。100 年以上後、カプランによる先駆的な研究は、貪食2の少なくとも 2 つの形態的に異なるメカニズムが示唆されました。カプラン示した走査型電子顕微鏡、マウス腹腔マクロファージ摂取 IgG オプソニン羊赤の血液細胞を達し、粒子をしっかりと包まれて薄い膜の拡張を使用して、最初のカップのような上昇を与える構造体です。貪食カップ形成は、細胞膜透過性の真菌毒素サイトカラシン B、アクチン動態3をブロックする知られていた abrogated 以来アクチン重合を必要です。対照的に、ですが、いくつかの画像膜フリルを沈降粒子のすぐ近くで見ることが、補完とオプソニン羊赤血球は膜拡張を発生せずマクロファージに直接シンクに登場。貪食カップ形成とは異なり補体受容体を介した沈没はサイトカラシン B 処理2insenstive だった。カプランによって記述された実験で免疫グロブリン M の孵化によって補完オプソニン化を行った (IgM) というラベルの付いた羊赤血球は、補体 C5 欠損マウス血清補体 C5 依存端末により溶血を回避すると複雑なを補完します。
カプランによって識別される貪食能、貪食カップ形成と、シンクの 2 つのモードとなっているフィールド4,5,6,7,8,9 に意見を設立し.ただし、超高解像度の画像は、ムンテ ・ カースらによる同様の調査と同様、カプラン2、元の研究で使用10、食イベントのスナップショットを提供するだけ。最近のレビュー、ジャックルージュリらで11では、媒介 FcγR と CR 貪食の形態差は明らかと、また、膜フリルが補体受容体を介した粒子取り込み2の間に観察されていると強調しました。住セルイメージ投射粒子の捕捉から遺伝子と組み合わせて内面にまたがる単一の食イベントのマウス ・ モデルを変更、食をキャプチャし、粒子を摂取の私達の理解が大幅に向上します。1 つのアプローチは、生きている細胞の超高分解能 (10-20 nm) 地形イメージングを可能にする高速原子間力顕微鏡 (AFM) を使用することです。最近、急速に低ノイズでイメージング細胞表面に適している高速原子間力顕微鏡システム12が開発されています。この手法は利点固定と臨界点乾燥を必要と走査電顕とは異なり短い間隔 (秒) でセルを測定ことができる生活の高解像度、地形的、力学的パラメーターセルです。別のアプローチは、コマ撮りの 3 D 共焦点顕微鏡では、光毒性と漂白が録画中に制限要因が広く利用可能であります。この方法は汎用性の高い光学的に高い空間分解能で切断と遺伝的コード化の蛍光蛋白質を含む蛍光プローブの驚異的な範囲にラベルに特別な柔軟性を実現します。ここで我々 は食作用の試金コマ回転ディスク共焦点顕微鏡を用いた特定の受容体を介した貪食イベントの高時空間解像度を許可をについて説明します。

<table><tbody><tr><td>24 G プラスチック カテーテル</td><td>B Braun Mesungen AG, Germany</td><td>4254503-01</td><td>腹膜洗浄に使用</td></tr><tr><td>Hank'Ca2+およびMg2+を含まない緩衝塩溶液</td> <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14170120</td><td>腹膜洗浄に使用</td></tr><tr><td>14mLポリプロピレン丸底チューブ</td><td>BDファルコン</td><td>352059</td><td>腹膜細胞の収集に使用</td></tr><tr><td>20 mM Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7388</td><td>アッセイ用基礎培地</td></tr> 熱<tr><td>不活化ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>10082139</td><td>RPMI 1640培地のサプリメントとして使用</td></tr><tr><td>100xペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>15140122</td><td>RPMI 1640培地のサプリメントとして使用</td></tr><tr><td>フィブロネクチンコーティング &micro;-Slide&nbsp;I chambers</td><td>Ibidi, Martinsried, Germany</td><td>80102</td><td>Samples used for assays</td></tr><tr><td>&micro;-スライド(陽極酸化アルミニウム)ラック</td><td>Ibidi, Martinsried, Germany</td><td>80003</td><td>オートクレーブ可能なスタッカブルラック チャンネルスライド用</td></tr><tr><td>RPMI 1640 重炭酸塩を含む培地</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>一晩培養用培地</td></tr><tr><td>N-(2-メルカプトプロピオニル)グリシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6635</td><td>活性酸素種のスカベンジャー</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MF48020</td><td>Mouse macrophage marker and plasma membrane label</td></tr><tr><td>CellMask Orange</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10045</td><td>Red fluorescent plasma membrane stain</td></tr><tr><td>Succinimidyl ester of pHrodo</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P36600</td><td>pHrodo</td></tr><tr><td>マウス(IgG2b)モノクローナル(クローンHIR2)抗ヒトCD235aの</td>アミン反応性スクシンイミジルエステル&nbsp;<td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>MA1-20893</td><td>IgGでヒト赤血球をオプソニン化するために使用されます</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-conjugated&nbsp; ヤギ抗マウス(二次) IgG抗体</td><td>アブカム</td><td>Ab150116</td><td>マウスIgGでヒト赤血球のオプソニン化を確認するために使用されます</td></tr><tr><td>ラット抗マウスC3b/iC3b/C3c抗体</td><td>Hycult Biotech</td><td>HM1065</td><td>ヒト赤血球</td></tr><tr><td>のC3b/iC3bオプソニン化を確認するために使用されますAlexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-11006</td><td>C3b/iC3bオプソニン化を確認する二次抗体として使用</td></tr><tr><td>Calcein/AM サー</td><td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C3100MP</td> Calcein UltraVIEW Vox 3Dライブセルイメージングシステムで<td>ヒト赤血球をロードするために使用されます</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Rodgau, Germany</td><td></td><td>スピニングディスク共焦点顕微鏡システム</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti 逆顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td>倒立顕微鏡</td></tr><tr><td>CSU-X1 スピニングディスクスキャナー</td><td>横河電機株式会社</td><td></td><td>ニプコウ スピニングディスク装置</td></tr><tr><td>14ビット 浜松 C9100-50 電子増倍荷電対デバイス (EM-CCD) ペルチェ冷却カメラ</td><td>浜松ホトニクス株式会社</td><td>スピニングディスク共焦点顕微鏡システムのEM-CCD</td><td></td>カメラ&nbsp;</tr><tr><td>488 nm 固体レーザー、50 mW</td><td>Perkin Elmer、ロドガウ、ドイツ</td><td></td><td>レーザー (488 nm) 回転ディスク共焦点顕微鏡システムの光源</td></tr><tr><td>561 nm 固体レーザー、50 mW</td><td>Perkin Elmer、ロドガウ、ドイツ</td><td></td><td>レーザー (561 nm) 回転ディスク共焦点顕微鏡システムの光源</td></tr></tbody></table>

マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 d イメージング

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

貪食は、ティッシュの開発やメンテナンスと同様、ホストの防衛のために重要な役割を果たしているし、キャプチャし、包む大きな粒子を巻き込むアクチン細胞骨格の急速な受容体を介した語順換えを含みます。貪食受容体、下流のシグナル伝達経路における Rho gtp アーゼなどのエフェクタを特定したら、特定の受容体を介した貪食イベントの動的な細胞骨格改造の不明確なままです。四十年前、Fcγ 受容体 (FcγR) と補体レセプター (CR) に代表される食の 2 つの異なるメカニズムは貪食を介した、走査型電子顕微鏡を使用して識別されました。結合免疫グロブリン G (IgG)-FcγRs をオプソニン粒子トリガーとなり完全に囲まれた、セルに撤回する前に最初の粒子のまわりのいわゆる貪食カップを形成する薄い膜拡張の突起。対照的に、食細胞の受容体を補完するためにバインド、次にシンクするオプソニン補完する粒子が表示されます。貪食能、貪食カップ形成と、シンクのこれらの 2 つのモードは、文献で定評になっています。ただし、2 つのモードの違いがその補体受容体を介した貪食は、様々 な膜の突起を引き起こす可能性がありますレポートでぼやけています。食作用の試金が必要な高解像度イメージング技術の可用性は、できる方法特定の貪食受容体の可視化 3 D (3次元) リアルタイム仲介する個々 の粒子の取り込み。詳細はよく使われる手法エンドポイント アッセイなどの貪食に関する研究のため、粒子と食細胞の界面で起こっているを理解する機会を逃します。ここ我々 単一食イベントの 3 D イメージングができるコマ回転ディスク共焦点顕微鏡を用いた貪食の試金を記述します。さらに、明確にイメージ Fcγ 受容体 - や受容体を介した細胞貪食を補完するための法について述べる。

コマ回転共焦点顕微鏡による貪食のイメージングに使用チャネル スライドの模式図を図 1に示します。分離されたマウス腹腔マクロファージ (Ms) が緑蛍光 Alexa Fluor 488 共役アンチ-F4/80 抗体 (と分類されるに対し、ひと赤血球 (hRBCs) 赤い蛍光膜マーカー CellMask オレンジと汚れる図 2)、マウス大食細胞の特異的マーカーと膜ラベルとしての両方を提供しています。ひと赤血球は、(CD235a として知られているグリコフォリン A はひと赤血球に特異的に発現するタンパク質) igg 抗体 (IgM) の抗 CD235a 抗体と細胞の孵化によってマウス IgG (mIgG)、またはマウス IgM (政経) でオプソニンできます。赤蛍光赤血球は、緑の蛍光マクロファージのコマ撮りの 3 D イメージングでは、単一粒子の貪食イベント (図 2) の可視化を実現。 にします。単一の食イベントの観察では、粒子の捕捉と摂取は線引きするの詳細をことができます。たとえば、mIgG オプソニンひと赤血球マクロファージ filopodium、指のような細い突起によっての捕獲観察できる (図 3 a; Horsthemkeらも参照してください。15). さらに、人間の赤血球の貪食カップ形成の間に絞る観察できる (図 3 a)。MIgG オプソニン、新鮮なマウス血清や松下政経塾オプソニン、人間の赤血球の溶血性膜の攻撃の複合体の形成で絶頂に達する古典的な補をトリガーします。CellMask オレンジとカルセイン デュアル染色細胞による補体による溶血の動態を測定できます。緑の蛍光細胞質カルセインは溶血 (図 3 b) 細胞から急速に解放されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig1.jpg"> 図 1: チャネルのフィブロネクチン コート スライドの処理します。(A) A チャンネル スライド寸法 50 mm × 5 mm 0.4 mm。 チャネル スライドは最初 2 つの貯水池のいずれかに 1-2 mL の培地を適用し、スライドを傾斜事前入力チャネルによって接続されている 2 つの貯水池で構成されています。(B) のキャップは、孵化する前にタンクの上に配置できます。キャップを便利に使用できるセルのチャネルを播種する前に不要な空気の泡をポンプします。(C) 空気バブル無料 100 μ L チャネルは、チャネルの口の中に直接培地を分注で充填が可能します。この手順する使用されます、たとえば、シード マクロファージにスライドまたは gfluorophore (蛍光グリーン) を追加する-共役のアンチ-F4/80 抗体を膜ラベルとしてマウスのマクロファージ マーカーとして機能します。(D) 蛍光とシードのチャンネルにオプソニンひと赤血球などの粒子をピペッティングした後染色マクロファージ、スライド倒立顕微鏡のステージ上に配置し、コマの回転のディスク共焦点顕微鏡することができます。実行されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig2.jpg"> 図 2: 食の時間経過の 3 D イメージングします。(A) 模式図膜染色 (蛍光レッド) ひと赤血球 (hRBCs) のオプソニン化 (m) マウス抗 CD235a 免疫グロブリン G (mIgG) 抗体とマウスのマクロファージ (Ms) にラベル付き hRBCs のプレゼンテーション(緑蛍光) を緑蛍光蛍光標識抗-F4/80 抗体に付いています。(B)コマ撮り画像 (XZ ビュー)、貪食カップ形成と hRBCs の mIgG オプソニンの摂取を示すディスク共焦点顕微鏡を回転によって得られます。スケール バー = 10 μ m. (C) 3 D 再構成マクロファージ mIgG オプソニン hRBCs を摂取することを示します。(の縦長の 3) 対応する XZ ビューは、B. グリッド間隔を表すに表示されます μ m 5.07<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig3.jpg"> 図 3: 粒子の filopodium でキャプチャします。コマ撮りの画像がマウス免疫グロブリン G (mIgG) をキャプチャ マウスのマクロファージを示すディスク共焦点顕微鏡を回転によって得られる-オプソニン赤血球 (hRBC) filopodium (上部のパネルで矢印) 経由で指のような突起。赤の血液細胞が貪食カップ形成の初期段階でその crenations を失うことに注意してください。さらに、(下のパネルの矢印で示されます) エンベロープの赤血球を圧迫する貪食のカップが表示されます。スケール バー = 10 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

ここでイメージの単一食イベントに回転ディスク共焦点顕微鏡を用いたマウス腹腔マクロファージの方法について述べる。他の貪食細胞に、プロトコルを拡張できます。

マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

このエッセイの全体的な目標は、3次元時間経過顕微鏡による食道細胞の可視化のためのマクロファージおよびオプスン化赤血球を調製することです。この方法は、食細胞が粒子を捕捉し、摂取する方法など、免疫学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術は、粒子が摂取されたかどうかの評価のみを可能にする従来のエンドポイントアッセイとは異なり、リアルタイムで粒子取り込みを視覚化することを可能にする。一般に、この方法に慣れ加えた個人は、細胞分離手順に慣れるまで苦労する可能性があります。この共焦点顕微鏡を回して、3D回経過イメージングのファゴサイトーシスを実現する利点を実現したとき、私たちは最初にこの方法のアイデアを得ました。腹膜マクロファージを分離するには、生後3〜4ヶ月のマウスの腹膜に24ゲージのプラスチックカテーテルを入れ、プラスチック製の5ミリリットルの注射器を使用して、1回の洗浄あたりカルシウムとマグネシウムなしで4.5ミリリットルの氷冷HBSSで空洞を2回洗浄します。吸引した懸濁液を14ミリリットルのポリプロピレン丸底管に移し、回収する。両方のサンプルが収穫されると、遠心分離して吸引し、腹膜細胞を完全な重炭酸塩フリーRPMI 1640培地の1ミリリットルで再懸濁し、ミリリットル濃度当たり60〜6細胞程度を達成する。次に、プレフィルスライドに、フィブロネクチン被覆チャネルスライドの1つの貯留層に完全なHEPES補充培地の1ミリリットルを加え、下流の貯留層から吸引されるようにスライドを傾ける。不要な気泡を取り除くために、2つの貯水池のいずれかに新鮮な媒体の1〜2ミリリットルを追加し、しっかりと貯水池のキャップを適用します。その後、必要に応じてスライドを傾け、スライドから任意の空気をポンプにキャップにリズミカルな親指の圧力を適用します。すべての空気が排出されたら、スライドを貯留槽を含む上限のない媒体に向かって傾け、空気がチャネルに吸い戻されるのを避けるためにキャップを取り外します。次に、細胞溶液を数回ピペットして凝集を減らし、二酸化炭素がない場合は37°Cの湿ったチャンバーで2時間インキュベーションするためにスライドの1つのチャネルに100マイクロリットルの細胞を加えます。インキュベーションの終わりに、ちょうど実証したように完全な重炭酸塩補充培地で各スライド内のHEPES含有培地を交換してください。その後、細胞を摂氏37度の湿気の多いインキュベーターに入れ、一晩培養するために5%の二酸化炭素を含めます。翌朝、得られた新鮮な健康なドナー血液の1ミリリットルを2ミリリットルの丸底ポリプロピレンマイクロ遠心分離管に移す。次にサンプルを遠心分離します。上清を含むプラズマとバフィーコートを取り除く。そして、慎重に完全なHEPES補充培地の100マイクロリットルを含む2ミリリットルのミルコ遠心分離管に沈積赤血球の100マイクロリットルを移す。チューブ1:1にラベルを付け、希釈した赤血球の4マイクロリットルを、完全なHEPES補充培地の2ミリリットルを含む新しい2ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。その後、このチューブ4:2000にラベルを付け、希釈された赤血球サンプルチューブを氷の上に置きます。腹膜マクロファージにラベルを付けるには、各チャンネルスライドの重炭酸塩培地をHEPESを補充した完全な培地に置き換えます。次にスライドを傾けて、目的の蛍光タグ付きマウスマクロファージ特異的抗体の100マイクロリットルをスライドの100マイクロリットルチャネルの開口部に滴下させて下さ。下流の貯水池に流れ込む培地を吸気し、二酸化炭素が存在しない場合は37°Cの湿ったチャンバーで細胞を20分間インキュベートする。腹膜細胞は、4:2000赤血球サンプルを穏やかに混合し、新しい2ミリリットルマイクロ遠心チューブに400マイクロリットルを移し、層流フード内の加熱されたアルミニウムブロックで約5〜8分間標識されています。細胞が37°Cに温まったとき、適切な赤蛍光形質膜染色の0.4マイクロリットルを細胞と混合する。次に、セルをヒートブロックに戻します。5分後、完全な培地と遠心分離機を補充した新鮮なHEPESの1.6ミリリットルを加えることによって細胞を洗浄する。チューブを回転させて、赤血球ペレットを特定します。1~1.5ミリリットルのピペットチップを使用して、ペレットを邪魔することなく2つのボリュームで上清を慎重に除去し、2000マイクロリットルの新鮮なHEPESを細胞と完全な培地を混合します。遠心分離機を400マイクロリットルの培地中に再懸濁した。次に、プラズマ膜染色のチューブPMSにラベルを付けます。20分間の腹膜細胞標識インキュベーションの終わりに、新鮮な完全なHEPES補充培地の1ミリリットルでスライドを洗浄する。赤血球をオプゾン化するには、マウスIGG2Bモノクローナル抗ヒトCD235A抗体をPMSサンプルチューブに1マイクロリットル添加する。37°Cで8分後、1分に1回混合して、100マイクロリットルの血漿膜を染色し、ヒト赤血球を腹膜マクロファージにチャネルスライドを含む。ヒトの赤血球が追加されるとすぐに、回転ディスク共焦点顕微鏡にスライドを取り付けます。ステージインキュベーターを摂氏37度に設定すると、すぐに細胞のイメージングを開始します。ヒト赤血球細胞の赤色蛍光性を呈した緑色蛍光マクロファージのタイムラプス3Dイメージングにより、単粒子食細胞性事象の可視化が可能となる。例えば、マクロファージフィロポジェードによるマウスIGGオプゾン化ヒト赤血球の捕捉が観察できる。同様に、食細胞性カップ形成中のヒト赤血球の圧迫。このビデオを見た後、マウス常駐腹膜マクロファージ、蛍光標識された細胞、およびオプスニ化粒子を分離する方法をよく理解する必要があります。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

このビデオは、マクロファージを介した独立性赤血球(RBC)食作用イベントを監視するためのアッセイを示しています。マウス免疫グロブリンG(IgG)-オプソニン化ヒト赤血球をマウスマクロファージとインキュベートし、共焦点顕微鏡で観察します。赤血球は、食細胞カップ形成を介してマクロファージに飲み込まれ、リソソーム分解の標的となります。...

IgGオプソニン化赤血球のマクロファージ食作用のリアルタイムイメージング

このビデオは、ガラス底皿の表面に付着したIgGオプソン化赤血球(RBC)のマクロファージ媒介性食作用におけるファゴソームの形成と閉鎖をリアルタイムで可視化するための高解像度の全反射蛍光(TIRF)顕微鏡法を示しています。マクロファージはRBCの周囲に偽足を伸ばし、ファゴソーム内に飲み込み、ガラス表面から分離します。...

TIRF顕微鏡法によるファゴソームの形成と閉鎖の可視化

我々は、のライブセルビデオ顕微鏡のための方法を説明します...

真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

ライブマクロファージにおけるファゴリソソーム生合成の研究

ここでは、接着性マクロファージ細胞株による蛍光粒子の食作用を蛍光測定法を用いて定量化するプロトコールを紹介します。この方法により、粒子の内在化とそれに伴うアクチン重合のハイスループット定量が容易になります。...

マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術

全反射蛍光顕微鏡を用いて、生きたマクロファージにおける前例のない高分解能のファゴソーム形成とクロージャを3次元で可視化するための実験設定について説明します。これにより、食細胞カップの基部、伸びる偽足、および食細胞の正確な部位を監視できます。...

「ファゴソーム閉鎖アッセイ」全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）を用いて、三次元的にファゴソーム形成を可視化します

癌細胞に対するマクロファージ貪食活性、具体的には4T1マウス乳腺癌細胞を、本研究で画像化した。生細胞共培養モデルを確立し、蛍光干渉造影造影顕微鏡の組み合わせを用いて観察した。この評価は、イメージングソフトウェアを使用して画像化し、マルチポイントタイムラプスビデオを開発しました。...

M1マクロファージ-4T1マウス乳腺癌細胞における食細胞活性のタイムラプス2Dイメージング

ここでは、C5a勾配を化学戦術補体で画像マウス常駐腹膜マクロファージにタイムラプス、位相コントラスト顕微鏡を用いた方法について説明する。プロトコルは、他の免疫細胞に拡張することができます。...

マウスマクロファージ・ケモタクシスのタイムラプスイメージング

ここで提示されるプロトコルは、pH感受性蛍光分子に結合された非オプゾン化酵母(zymosan)粒子のマクロファージ(MΦ)食作用の間葉幹細胞(MSC)媒介性調節の動的画像を定量化し、生成するプロトコルです。...

間葉系幹細胞のマクロファージ食前細胞の調節;定量とイメージング

本プロトコルでは、末梢血単核球由来マクロファージと自動顕微鏡を用い、緑色蛍光タンパク質で標識したトリプルネガティブ乳がん細胞の抗体依存性マクロファージ貪食を可視化するためのタイムラプス生細胞イメージング法について解説します。...

緑色蛍光タンパク質標識トリプルネガティブ乳がん細胞の抗体誘導性マクロファージ食作用のタイムラプスイメージング

学ぼう、マウス腹腔マクロファージを用いた貪食のリアルタイム3Dイメージング手法。回転円盤共焦点顕微鏡で粒子摂取動態を可視化し、免疫応答のメカニズム解明に役立つ強力なツールです。

マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

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