Name: 細胞培養および皮膚のアプリケーション フィルム複合シリコン エラストマーを薄い: 製造とキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学ぶポリマー薄膜複合構造の製造と特性評価法。PDMSを用いた細胞培養や皮膚接着剤への応用を探索し、接着測定とL929細胞実験で材料性能を評価する。

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サンプルおよび細胞培養プロシージャの確立の準備の彼の援助のマーティン ・ ダナーを認めた著者は、ドイツビスターフェルドベルンハルト Spezialchemie GmbH (ハンブルク、ドイツ)、継続的なサポートおよび議論のため特にロバート ・ Radsziwill に感謝したいと思います。これらの結果につながる研究は、欧州連合の第 7 フレームワーク プログラム (FP/2007-2013) ERC 助成契約名 340929 の下で欧州研究評議会から資金を受けています。

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複合構造物の設計には、ヤング率やサンプルの厚さなどの材料特性の簡単な調整ができます。PDMS のヤングは、2 つのコンポーネント間の混合比を変更することまたは別のシリコーンのエラストマー30,31を使用してブレンドの製造によって広い範囲で効果的に変更できます。説明の方法に限定されない PDMS の現在の調査で使用されるが、特に粘着性能は使用される特定のタイプによって強く決まります。このプロトコルの中で重要なステップは、複合膜 (図 1) の製造プロセスです。フィルムの厚さが大きく (図 5および図 6) 皮膚を含む、異なる基板上に薄膜の付着挙動で影響が示されました。膜厚だけでなく時間と硬化過程の温度32材料特性に影響します。したがって、ポリマー層の厚さとしてパラメーターは慎重に適応し、検証する必要があります。
薄膜の接着特性の解析を行った Ra 最大表面粗さの異なる 2 つのガラス基板を用いた垂直力付着測定 = 0.338 μ m (図 3)。一般に、粗さ影響大幅表面、特に弾性材料33,34の接着です。ガラスの粗さは異なるアスペリティ サイズ、高い粗さ値21を出展基板の作製を許可のサンドペーパーで研磨が簡単に変えることができます。たとえばまた、他の材料は基板15,35の生産のためエポキシ樹脂を使用できます。提案するプロトコルの変更の重要な戦略があります。たとえば、異なる表面自由エネルギーを示す基板が必要なのか地形は必要です。ここでは、引き剥がし応力と PDMS、SSA の製造された薄膜の分離の動作をカスタム セットアップ (巨視的密着性測定装置 (MAD、図 4)) を行った。36基板と圧子の光学配置は、測定結果の分析のための重要なステップです。したがって、チルト角度の調整は、ゴニオメータ、可能な限り正確に実行する必要があります。これは、水平方向の接触を達成するまで手動でフィルム表面と接触する基板を持って来ることによって十分な精度で実現できます。
現在のプロトコルのホールド時間が一定 1 秒後(図 5 と図 7)。特に、大まかな基板表面に弾性膜の接着性能の調査のためホールド時間の延長は、追加情報を示します。たとえば、保持時間の増加とともに引き剥がし応力の増加は、報告された8をされています。現在のプロトコルは、他の方法で実行される測定に加えてたとえば皮テスト実行でした、接着性能37のより包括的な調査を許可します。
複合膜柔らかい肌接着剤の厚さを調べた別のフィルムを展示しています (図 7) との接着。我々 の結果は公開されたデータ、監禁、すなわち、基板直径、膜厚の増加38,39 間の比率としてフィルム厚鉛引き剥がし応力の増加の減少を示すに沿っています。.これらの結果、図 7に示されているデータに基づいて、良好な密着性 p を約 100 μ m (約 60 μ m の厚約 40 μ m で PDMS 膜に適用の SSA 層の厚さ) の合計の厚さ複合膜に展示を終えてください。粗面のプロパティ。
次に、原始的な複合膜の生物学的特性に関連する実験を行ったし、プラズマ処理による複合膜 (図 8)。シリコン ・ エラストマーのプラズマ処理は表面および携帯電話の添付ファイルと携帯40,41を拡散促進の親水性の特性を高めるため多くの場合、汎用性の高い手法です。シリコーンは低毒性の高い biostability よく知られているが、残留モノマーまたは触媒細胞毒性42,43にもつながる生理的プロセスに影響を及ぼす可能性がありますがあります。で、我々 を観察した実験を行った未満 5% 細胞毒性指標とトリパン ブルー排除アッセイ LDH リリースを使用して。提案するプロトコル、全体の携帯電話人口の増殖解析 (図 9 b) 表面分析されているフォームをデタッチ細胞集合体を含みます。プロトコルの変更より差別化された結果を作り出すことができます。各サンプルでは、戸建の細胞凝集体を含む上清を別反応管を転送し、高分子表面から酵素によって削除されたセルと組み合わされていないでした。これは、表面に付着した細胞の正確な評価を許可し、最終的に細胞接着過程に及ぼすポリマーのより詳細な決定を明らかにします。に加えて免疫細胞化学的方法をここで提示、セルのイムノブロット法、蛋白質の表現の詳細な定量的評価を可能と調査のために収穫があります。
要約すると、高度な細胞培養研究用エラストマー複合薄膜の生産のための製造条件を設けています。また、これらの薄膜は、皮膚の粗さ、洗練されたデザインの皮膚接着剤を有効にするのに高い適応性を持っています。

このプロトコルでは、エラストマのフィルムの生産のための詳細な手順が掲載されています。広く利用可能なドクター刃技法は、複合薄膜の生産のために使用されています。製造技術は、大規模なこれらのフィルムの後続の生産を有効にする polyethylenterephtalate (ペット) 箔に行われています。このプロトコルの重点は、再現性、正確な複合膜の異なる層と最終的な複合材パッチの生物と接着特性の定量の製作の評価です。シリコーンのエラストマー ポリジメチルシロキサン (PDMS) は皮膚接着剤、マイクロ流体アプリケーション、その他の研究フィールド1,2,3 の生産を含む医療技術で広く使用されて ,4。最近、いわゆる柔らかい皮膚接着剤 (SSAs) PDMS の別のサブクラスは導入された、穏やかな皮膚の接着・非接着の特定されています。
シリコーン SSAs は、類似高分子シリカ5を補強の有無によって異なる官能基化ビニール エラストマーです。他の PDMS、SSA のようなヤング合わせることができる広い範囲で変調架橋剤濃度または硬化時間6,7,8。シリコーンエラストマーのヤング率の変化材料の接着特性に大きく影響し、表面9,10上で培養した原核生物と真核生物の細胞にも深遠な影響を持って,11. 細胞の生物学的レベルのそれを示した、真核細胞がマトリックスの弾力性の変調や表面9,10,12 の厚さに信号伝達レベルに対応 ,,1314。したがって、可変機械的性質を持つ高分子の細胞文化アプリケーションで広範な関心が存在します。重要なは、シリコーン系エラストマーの本質的に低表面エネルギーは、真核細胞の細胞培養に最適な条件を提供しません。酸素プラズマ処理は PDMS 低表面エネルギー、一時的に引き剥がし強度の向上につながるを高めるため広く使用されている手法は並列添付ファイル、拡散を推進中の分子の表面吸着を減少し、真核細胞15,16,17,18の増殖。
材料特性に加え表面の地形は細胞接着と接着剤 2 つ材料19,20,21,22相互に大きく影響します。表面粗さは、2 つのサーフェス間接触の形成に関するいくつかの効果: 高接触面積の削減にアスペリティをき裂伝ぱに及ぼす影響は、接着強度23を変えることができるだけでなく周囲の弾性エネルギーが格納されています。 24。人間の皮膚に粘着の接着は新興分野、例えば、創傷被覆材、心電図電極の固定または他ウェアラブル電子機器25,26,27、 28。表面地形に関連しての自己接着剤の接着性能を測定するには、通常接着測定8、21の粗さの度合いとガラス基板を使用できます。ここでは、2 枚のガラス基板は、高分子膜の接着特性を調査する選択されています。混合比の異なる PDMS 10 に 1 の重量部品の混合比の PDMS バッキング層と最初、複合フィルムは特徴付けられました。2 番目のステップでは、両方の成分の等しい重量量とサポート PDMS 膜上の膜厚を変化に接着 SSA 層が準備されました。

<table><tbody><tr><td>2-プロパノール、97%</td><td>ストックマイヤーケミー</td><td>1000452610000</td><td>イソプロパノール</td></tr><tr><td>研磨剤ディアムノッドハンドパッド</td><td>Bohle</td><td>MO 5007522</td><td>グリット:220</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>山羊座科学</td><td>ACC-1B</td><td></td></tr><tr><td>アルブミンフラクションV</td><td>ロス</td><td>0163.2</td><td>BSA</td></tr><tr><td>アレクサフルオア488ファロイジン</td><td>ThermoFischer科学</td><td>A12379</td><td>高有毒</td></tr>な<tr><td>Aquamount</td><td>Polysciences</td><td>18606-20</td><td>水溶性封入媒体</td></tr><tr><td>CytoTox-ONE均質膜完全性アッセイ</td><td>Promega</td><td>G7890</td><td></td></tr><tr><td>DPBS、Ca2+、Mg2+</td><td>ThermoFischer科学</td><td>的な14190094</td><td></td></tr>胎児ウ<tr><td>シ血清金</td>GE<td>ヘルスケアライフサイエンス</td><td>A15-151</td><td>FBS</td></tr><tr><td>ゴニオメーター OCA35</td><td>静水接触角を決定するための</td><td>データ物理学</td><td></td></tr><tr><td>ヘキスト染料 33342</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>B1155-100MG</td><td>ビスベンズイミド H 33342 三塩酸塩、高毒性</td></tr><tr><td>顕微鏡 アクシオーバー 25</td><td>ツァイス</td><td></td><td>細胞培養の文書化に使用される顕微鏡</td></tr><tr><td>顕微鏡 エクリプ</td>ス <td>LV100ND ニコン</td><td></td><td>膜厚測定に使用される顕微鏡</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、水溶液 16%</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>RT 15710</td><td>電子顕微鏡グレード</td></tr><tr><td>ペニシリンとストレプトマイシン溶液</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>フェノム XL 走査型電子顕微鏡 (SEM)</td> <td>フェノム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリ-(ビニルアルコール) 4-88、MW 31000</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>81381-1KG</td><td>Mowiol 4-88</td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン、シルガード 184</td><td>ダウ コーニング</td><td>(400)000108351397</td><td>PDMS</td></tr><tr><td>RPMI 1640 基礎培地</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>ソフト スキン 接着剤 (SSA)</td><td>ダウ コーニング</td><td>(400)000108251792</td><td>MG 7-9800 ソフト スキン 接着剤 (SSA)</td></tr><tr><td>スピード ミキサー DAC 600.2 VAC-P</td><td>ハウスチャイ</td><td></td><td></td></tr><tr>ルド<td>スタイラスプロフィロメータ</td><td>ツァイス</td><td></td><td>モデル:SURFCOM 1500SD3</td></tr><tr><td>Tecan Infinite M200 pro</td><td>Tecan</td><td></td><td>蛍光プレートリーダー</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Calbiochem</td><td>648466</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td>高毒性</td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA溶液</td><td>PAN-Biotech</td><td>P10-023500</td><td>0.05% トリプシン、0.02% EDTA in PBS</td></tr><tr><td>UV接着剤</td><td>Bohle</td><td>BO MV76002</td><td>中粘度</td></tr></tbody></table>

細胞培養および皮膚のアプリケーション フィルム複合シリコン エラストマーを薄い: 製造とキャラクタリゼーション

Thin Film Composite Silicon Elastomers for Cell Culture and Skin Applications: Manufacturing and Characterization

このプロトコルの皮膚接着剤の開発、高度な細胞培養用エラストマ複合膜を作製する方法を提案する.(PDMS、柔らかい皮膚接着剤 (SSA))、2 つの異なるポリ-(dimethyl siloxanes) は、生物学的効果と接着特性の深さの調査に使用されています。複合フィルムは、柔軟なバッキング層・接着剤の上塗りで構成されます。両方のレイヤーは、ドクター刃アプリケーション技法によって製造されています。現在の調査で層の厚さの関数またはトップ層のヤング率の変化として複合膜の接着挙動を調べた。PDMS のヤングは、架橋剤の混合比にベースを変化させることにより変更されています。さらに、SSA の膜の厚さは約 16 μ m から約 320 μ m. 走査型電子顕微鏡 (SEM) に多様されている、光学顕微鏡は、厚さ測定のために使用されています。エラストマー フィルムとの接着は、膜厚、ポリマーと表面特性のヤング率によって強く決まります。したがって、表面粗さを示すガラス基板上にこれらのフィルムの通常の接着が検討されています。引き剥がし応力との分離作業は、シリコーンエラストマーの混合比に依存。
さらに、支持の支持層の上に置かれた柔らかい肌接着剤の厚さは、皮膚用パッチを生成するために多様されています。(混合比 10:1) PDMS 薄膜や SSA 映画 (混合比 50: 50) L929 マウス線維芽細胞の細胞接着、増殖細胞毒性が行われています。我々 は示されているここでは、初めて、両ポリマーの製造複合薄膜の横に並べて比較とその生物と粘着特性の調査を提示します。

異なるヤング係数または厚さを有する高分子薄膜複合構造体の製造のためのプロトコルが表示されます。フィルムは、高度な細胞培養研究または皮膚接着剤として生産されています。

In this protocol, we present methods to fabricate thin elastomer composite films for advanced cell culture applications and for the development of skin ...

この手順の全体的な目標は、高度な細胞培養研究または皮膚接着剤として、ポリマー薄膜複合構造を製造および特性評価することです。この方法は、エラストマー複合材料を使用して、不規則な表面でも最適な接着作用を実現する方法に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。これらの手法の主な利点は、シンプルで普遍的に適用できることです。これにより、非常に高い精度で大規模な製造が可能になります。一般的に、この方法に不慣れな個人は、接着測定が必要な精度を達成するために集中的なトレーニングと練習を必要とするため、苦労するでしょう。細胞培養手順と血漿アプリケーションのデモンストレーションは、私たちの研究室の技術者であるAngela Rutzです。PDMSを調製するには、1.1グラムのプレポリマー混合物を、真空下で2350RPMのスピードミキサーで3分間混合し、脱気します。PDMSバッキングレイヤーを準備するには、自動制御のドクターブレード塗布機を使用します。100%イソプロパノールで洗浄したPETホイルの上にドクターブレードを置き、マイクロポジショニングネジを使用してバッキング層の厚さを調整します。PDMSを使い捨ての10ミリリットルシリンジにセットします。ドクターブレードのリザーバーにポリマーを充填し、毎秒約2ミリメートルの速度でブレードの動きを開始します。PETフィルムをコーティングしたら、フィルムを摂氏95度のオーブンに1時間移します。複合フィルムの最上層を準備するには、ブレードを使用して、バッキングレイヤーの長辺から薄いストリップを取り除きます。ドクターブレードをPETホイル上でスライドさせ、前述のようにPDMSの2番目の層を塗布します。次に、ホイルをオーブンに入れます。接着性測定用のサンプルを準備するには、かみそりの刃を使用してPETホイル上のフィルムを4つの正方形の領域に切断し、UV接着剤を使用してスライドガラスに固定します。UVライトで3分間ピースを照らし、最初のポリマーサンプルをサンプルホルダーにマウントします。ゴニオメーターを使用して、カメラ画像で視覚化されているように、基板が両方の表面が完全に平行に整列してポリマーフィルムに接触するまで、傾斜角度を調整します。サンプルに対する基板の光学的アライメントは、測定結果を解釈するために非常に重要です。そのため、傾斜角度の調整は、傾斜計を使用してできるだけ正確に行う必要があります。13±5キロパスカルのプリロードストレスが達成されるまで、整列した基板をポリマーフィルム表面に移動し、LabViewで記述されたカスタムプログラムソフトウェアパッケージを開始します。次に、必要な測定パラメータを設定して、各フィルム表面の6つの異なる場所で3つの独立した製造サンプルの接着特性を測定します。光学顕微鏡用のフィルムを調製するには、カミソリの刃を使用してポリマーサンプルを0.25平方センチメートルの小片に切断し、スライドガラスの端に取り付けます。次に、スライドを垂直向きにして直立顕微鏡の下に置き、フィルムの断面の厚さを測定します。細胞培養実験の準備は、まずメスを使ってPET支持層から約5×5mmのピースを切り取り、ピンセットを使って12mmのガラスカバースリップに転写します。カバースリップをプラズマ装置の反応チャンバー内に移し、装置の蓋を閉めます。10の1.6倍からマイナス2ミリバールの圧力に達するまでチャンバーを排気し、フィルムをプラズマで3分間処理します。次に、反応チャンバーを換気し、サンプルを24ウェルプレートの個々のウェルに移します。次に、70〜80%コンフルエントなL929細胞培養物をカルシウムおよびマグネシウムを含まないDPBSで層流キャビネットで30秒間洗浄します。その後、2ミリリットルの適切なタンパク質分解およびコラーゲン分解溶液を摂氏37度、および5%CO2で5分間インキュベートします。細胞が分離したら、8ミリリットルの血清添加培地を追加し、細胞を15ミリリットルの円錐管に移します。次いで、カウント後、ポリマーサンプルを含む24ウェルプレートのウェルあたり培地1ミリリットルあたり60,000細胞をシードし、プレートを細胞培養インキュベーターに3日間置いてから、位相差画像のキャプチャと固定を行います。トップフィルムの厚さにもよりますが、基板表面のテクスチャーに関係なく、フィルムの厚さが増すと引き抜き応力の減少が観察されます。ただし、分離の仕事は、一般に、粗い基板表面の方が滑らかな表面に比べてわずかに少なくなります。剥離機構を記録すると、薄い膜ではキャビテーションがほとんど観察されず、厚い膜では指のような亀裂が見られます。細胞培養実験では、手付かずのポリマー上に播種された細胞は接着性および細胞拡散挙動が不十分であるのに対し、プラズマ処理された表面で培養された細胞ではコンフルエント単層が観察されることが明らかになりました。一般に、乳酸デヒドロギアーゼのレベルは、両方の高分子材料で培養した細胞で同等であり、細胞毒性は5%未満です。一度習得すれば、ポリマーフィルム複合材料の製造は約3時間で完了することができます。通常のタック試験によるその後の分析にはトレーニングが必要ですが、フィルムの接着特性を調査するための非常に強力なツールです。このビデオを見れば、薄いポリマー複合フィルムの製造方法と、特定の接着試験や細胞生物学的ツールによる分析方法について十分に理解できるはずです。化学物質や生体材料の取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。したがって、必須の安全手順に従う、個人用安全保護具を着用する、これらの材料を安全キャビネットで取り扱うなど、適切な予防措置を講じてください。

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細胞培養および皮膚のアプリケーションフィルム複合シリコンエラストマーを薄い: 製造とキャラクタリゼーション

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