遺伝子発現解析のためのマウスの目から非常に純粋な小柱網のキャプチャ マイクロダイゼクション

このレーザーマイクロダイセクション手順の全体的な目標は、レーザーキャプチャ顕微鏡を使用してマウスの目から高度に濃縮された海綿網を分離するための堅牢で再現性の高い方法を開発することです。この方法は、誤って制御されると眼疾患につながる可能性のある重要な遺伝子やシグナル伝達経路は何かなど、眼科領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、マウスの眼の線維柱帯から高品質のRNAを遺伝子発現解析のために再現性よく単離できることです。

一般的に、この方法に不慣れな人は、レーザーマイクロダイセクションがプロトコル全体を通じてさまざまなトラブルシューティング手順を含む強力な技術であるため、苦労するでしょう。この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、レーザーマイクロダイセクションに最適な組織収集から開始します。RNase除染液をブラシ、鉗子、カップリングジャー、および取り付けチャックにスプレーします。

十分に拭いた後、装置をヌクレアーゼフリーの水ですすぎ、乾燥させます。クロスコンタミネーションを避けるために、クライオスタットを100%エタノールで拭き取ります。取り付けチャックに少量のOCTを絞り、ティッシュブロックを型から取り外し、ブロックを取り付けチャックに慎重に置きます。

取り付けチャックの組織ブロックが固まったら、クライオスタットの試料ホルダーに挿入します。次に、クライオスタットを調整して8ミクロンの切片を切断し、O.C.T.ブロックを慎重に切片にして組織サンプルに到達させます。組織を観察したら、切片化を停止します。

きれいなカミソリの刃を使用してすべての側面で凍結ブロックを切り取り、ティッシュの周囲に3〜4ミリメートルのOCTを残して、ペイントブラシでの取り扱いを可能にします。目を通してセクション化し、迅速に作業します。3段ごとにスライドにワンステップのH&E染色を60秒間浸すことで染色します。

セクションを水道水ですすぎ、風乾します。清算剤で切片を清算した後、カバースリップでチャージされたスライドガラスに切片を取り付け、顕微鏡で確認します。TMが染色された切片に明らかになるまで、切片化を続けます。

TMが現れ始めたら、2つの切片を切断し、それらを帯電したスライドガラスに取り付けて日常的なH&E染色を行い、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによる切断用のマップを形成します。最初のH&Eマップスライドの後、クライオスタットで厚さ8ミクロンの6つの連続切片を切断して整列させ、同時にPETメンブレンスライドに取り付けます。手袋をはめた親指をメンブレンの裏側に沿って短くスライドさせて、ティッシュを接着します。

取り付け後、すぐにPETメンブレンスライドをドライアイスのスライドボックスに入れます。目の切片化に進みます。それぞれ6つの切片を持つPETメンブレンスライドを2枚ごとに、帯電したガラススライドに2つの切片を採取し、H&E染色用の別のマップスライドを作成します。

TMが見えなくなるまで、厚さ8ミクロンの直列切片を約100個連続して切片化します。TMの欠如を確認するには、帯電したスライドガラス上の1つの切片をすばやく染色します。テキストプロトコルに記載されているようにH&Eマップスライド染色を行った後、顕微鏡を使用してH&Eスライドを視覚的にレビューします。

TMがはっきりと見え、切断しやすいマップスライドを特定します。これらのマップスライドの間にPETメンブレンスライドをLCMに使用します。マイナス80°Cの冷凍庫から凍結したティッシュ切片が入ったスライドボックスを取り出し、ドライアイスの上に置きます。

スライドを 1 枚ずつ処理します。スライドを直ちにRNase阻害剤を含む75%エタノールの冷たい場所に30秒間入れて、切片を固定します。スライドをヌクレアーゼフリーの水に10〜15秒間静かに浸し、組織切片に干渉することなくO.C.T.を溶解します。

300マイクロリットルの1.5%クレシルバイオレットアセテート溶液を切片に直接慎重にピペットで移し、室温で45秒間インキュベートします。次に、切片を75%エタノール浴に30秒間入れて、切片を1回洗浄します。200マイクロリットルのEosin Y溶液を切片にピペットで移し、3〜5秒間インキュベートします。

続いてスライドを75%エタノール、95%エタノール、最後に100%エタノール浴にそれぞれ30秒間入れて、組織を脱水します。スライドの端をティッシュワイプで拭き取り、余分な液体を取り除きます。スライドをボンネットの下で5分間完全に空気乾燥させます。

乾いたら、すぐにLCMを行います。最後の清算ステップにキシレンを使用することは避けてください。キシレン処理は、組織切片がメンブレンスライドに不適切に取り付けられる原因となります。

キシレンはまた、LCMによる組織捕捉の効率を低下させます。染色された組織面を下に向けてPETメンブレンスライドを、顕微鏡ステージにロードされた新しいスライドガラスの真上に置きます。メンブレンとスライドガラスが顕微鏡ステージ上でしっかりとペアになっていることを確認してください。

LCM を開始するには、まずスライドの制限を設定します。対物レンズパネルで最小の4倍倍率を選択し、顕微鏡のXYステージを動かして、金属とメンブレンが交わる左上隅がライブビデオフィードに表示されるまで、メンブレンスライドの作業領域を定義します。この時点で、Limit 1ボタンを押すと、ロードマップに赤い長方形が表示されます。

次に、XYステージを反対側の角に移動し、制限2ボタンを押します。スキャンボタンを押すと、設定された制限値の間の膜と組織のロードマップ画像が作成されます。ロードマップ内のいずれかの目のセクションのTMの近くをダブルクリックします。

TMは、虹彩角膜角の頂点近くに配置できます。TMが特定されたら、倍率を10倍に上げ、手動でTMに焦点を合わせます。20Xと40Xの対物レンズで繰り返します。TMが40X対物レンズにピントが合っているときは、空白の領域に移動し、フリーハンドの描画ツールを選択して、組織の空白領域に長い線を引きます。

カット速度が34%、フォーカスが58%、パワーが70%になるようにレーザーパラメータを設定し、カットボタンを押します。速度、フォーカス、パワーのパラメータをレーザーで微調整し、明確で細かい切断線が観察されます。正確な切断のためには、切断動作が引かれた線に沿っていることを確認してください。

次に、アイソレーションチューブの蓋をキャップホルダーにセットし、チューブを開きます。キャップホルダーをキャップリフトに取り付け、チューブが反転していることを確認します。また、粘着キャップの材料がキャップの先端を超えて突き出ていることを確認して、目的の組織が適切に捕捉されるようにします。

小柱メッシュワークがピックアップされ、アイソレーションキャップに取り付けられていることを視覚的に確認することが重要です。ソフトウェアパネルで手動解剖モードを選択します。慎重にview TMがアイソレーションチューブの真下にあること

ホワイトバランスを設定し、明るさを調整して、最適な画質を取得します。カットを開始するには、手動でピントを調整し、フリーハンドツールを使用して線を引きます。コレクションキャップがまだメンブレンに触れていない状態で、上の位置に留まっていることを確認してください。

TMが強膜と出会う場所の近くに部分的な円を描き、Cutを押します。最初のカットが完了したら、キャップを下の位置に配置してフォーカスを再調整し、オープンスペースまたはフリースペースに2本の線を引いて2つの部分的な円を接続し、TMの周りの円を完成させます。次に、Cutを押して、切片からティッシュを採取します。TMがマイクロダイセクションキャップによってピックアップされたことを確認します。

キャップを上の位置に戻し、残りのセクションで繰り返します。キャップの位置を少し調整して、分離されたすべてのサンプルがキャップに収まり、重ならないようにします。次のPETメンブレンは、新しいアイソレーションチューブを挿入し、このセクションを繰り返します。

マイクロダイセクションTM組織の溶解を行うには、10マイクロリットルの溶解バッファーをコレクションチューブの蓋に慎重にピペットで固定し、溶解バッファーがマイクロダイセントTMを完全に覆うようにします。粘着キャップを静かに閉め、採取チューブを逆さまにして室温で10分間インキュベートします。インキュベーション後、800 gで2分間遠心分離し、ライセートをドライアイスの上に置きます。ライセートは、後で精製および分析するためにマイナス80°Cで保存してください。

RNAの急速な分解は、ダウンストリームのRNA分析に影響を与える可能性があります。RNAの品質は、マイクロ流体ベースのプラットフォームを使用して測定および定量する必要があります。ここでは、海綿網から精製した高品質なトータルRNAの遺伝子発現解析の代表的な結果を示します。

レーザーマイクロダイセクション後の眼組織からの残りの全RNAのデジタルゲルは、その後の下流のRNA分析に必要な高いRNA完全性数を示しています。組織から良質なRNAが抽出されると、マイクロアレイ、RNA-Seq、qPCRなどのダウンストリーム解析を行うことができます。ここでは、定量的デジタルPCR分析を使用して、LCMで収集されたRNAから海綿網膜関連遺伝子、ミオシリン、およびACTA2の発現を解析しました。

マイクロアレイ解析から得られたデータから生成されたヒートマップから、この手法を使用して、野生型マウスやIOP表現型が上昇したノックアウトマウスの海綿網の遺伝子発現変化を理解できることが示されています。このテクニックを習得すると、適切に行えば、生物学的動物1匹につきわずか1日で行うことができます。レーザーマイクロダイセクションステップは、目的の細胞の視覚化が困難であり、これらのユニークなサンプルの標準がないため、学習が難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションが不可欠です。

熟練したオペレーターに頼ることが重要です。この手順を試みる際には、少量の組織中のRNAが急速に分解される可能性があることを覚えておくことが重要です。RNaseから機器を除染する、空気への曝露を最小限に抑える、組織を冷たく保つなどの予防策を講じる必要があります。

この方法は、眼圧の上昇が海綿網特異的遺伝子発現に及ぼす影響についての洞察を提供するだけでなく、眼圧の上昇によって引き起こされる網膜の遺伝子発現の変化を評価するなど、他のシステムにも適用できます。この手順に続いて、RNA-Seqやマイクロアレイなどの他の方法を実行して、眼圧が上昇したマウスの小柱網でどのようなシグナル伝達経路が変化するかなどの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、研究者がマウスモデルの海綿網の遺伝子発現変化をより効果的に研究する道を開きました。