Name: 遺伝子発現解析のためのマウスの目から非常に純粋な小柱網のキャプチャ マイクロダイゼクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: 学ぶレーザー捕捉マイクロダイゼクション法を用いたマウス眼からの小柱網分離と高品質RNA抽出による遺伝子発現解析。この技術は眼疾患の分子メカニズム解明に貢献します。

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TM は積極的に中の恒常性の維持に重要な役割を果たしているし、機能障害は高血圧性緑内障1,2,19の主な原因となる要因として広く受け入れられています。GWAS 解析によって識別されるいくつかの遺伝子の一塩基多型の数は、増加の緑内障の危険と TM; で AH 流出施設に抵抗の増加にリンクされています。しかし、この病気を生じさせる詳細な分子メカニズムは、まだ完全には理解21,22,23,24,25ではありません。遺伝的マウスモデルでは、緑内障の分子機構を研究するための強力なツールを提供できます。ただし、マウス TM 組織の小さなサイズ...

緑内障は、視神経ニューロパチーと最終的に永続的な失明1,2につながる網膜症によって特徴づけられる疾患群です。2020 以上で全世界 7000 万人が病3,4,5,6、7のいくつかのフォームに生活すると推定されます。主な開放隅角緑内障 (POAG)、最も一般的なタイプの緑内障では、房 (AH) 流出増加眼圧 (IOP)8,9,10につながるの減少によって特徴付けられる 11,12,13,143,15,16,17,18。左の未処理、慢性的な高眼圧は、網膜と視神経乳頭径の色覚異常1,2,19を原因とする進行性で不可逆的な損傷に します。毛様体による AH の生産の率の減少またはそれの流出1,8,9,を高めることによって眼圧を低減に着目した緑内障の進行を遅らせるためのすべての現在の方法10,11,12,13,14. 小柱網 (TM) は、積極的に主要な AH 流出経路の調節に重要な役割を果たしているし、その関数の不適切な高血圧性緑内障1,2,19の原因因子であります。ただし、TM 機能不全と AH 排水を調節する方法に関連する分子メカニズムはまだ完全には理解されていないと緑内障研究1,2,19、の主要な焦点は、現在20しますいくつかのゲノムワイド関連研究 (GWAS) 持っている遺伝子の数がリンクしている緑内障と TM で AH 流出施設に抵抗の増加、病気につながるではない正確な分子メカニズムまだ完全に理解21 。,22,23,24,25。
動物モデルを大幅に拡充 (3,15,16,26,27,28、見直し広く緑内障進行の私達の現在の知識 29,30,31,32,33)。TM34,35,36を研究するいくつかの先駆的な方法が開発されているし、これらのメソッドは、正常と病気の組織の私たちの現在の理解を進めるため広く使用されています。広く探索されていない 1 つの領域は、遺伝子組み換えマウス TM 障害の分子機構を研究するモデルの使用です。遺伝子ノックインとミオシリン (Myoc)37,38とCyp1b139などの関連付けられている TM 遺伝子のノックアウト マウスの研究は、TM の分子機構を研究するための主要なツールをされています。関数。当然のことながら、マウス TM の小さなサイズは、この組織の研究を開始するために克服しなければならない深刻なハードルを表します。マウス モデルは、LCM の技術の進歩は、TM を含む最小かつ最も繊細な組織の研究に力を与えるに必要なツールを提供しながら、遺伝学と疾患の分子機構を研究するための強力なツールを表します。
このレポートでは、後続の RNA の隔離と下流の発現解析の増幅とともにマウスの目から高濃縮 TM の LCM を堅牢で再現性のある方法を紹介します。マウスで正常に同様のメソッドを使用されて目組織40,41,42,43,44の他の種類を分離するが、その他に報告した方法論を適用できます。RNA、マイクロ Rna、DNA およびタンパク質を研究する目の離散的組織。重要なは、この手法により、緑内障の眼疾患3,15,16,17 TM 障害発症の分子機構を理解するための遺伝子組み換えマウスの使用 ,18,26,31,45,46。LCM によってマウスの目の TM を分離する機能をさらにいくつかの眼疾患の分子メカニズムに洞察力を得ることに有用な手法となります。

<table><tbody><tr><td>ACTA2 ddPCR プライマー (dMmuCPE5117282)</td><td>BioRad</td><td>10031252</td><td>FAM</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2946-90004</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>BioRad QX200 Droplet Digital PCR System</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small Paint Brush</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>帯電ガラス顕微鏡スライド</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>4951PLUS-001</td><td></td></tr><tr><td>クレシルバイオレット アセテート</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>湾曲ハサミ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エオシンY染料</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>71204</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td></td><td></td><td>湾曲および鋸歯状チップ (推奨チップサイズ:0.5 x 0.4 mm)</td></tr><tr><td>HemaCen</td><td>American MasterTech</td><td>STHEM30</td><td></td></tr><tr><td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465)</td><td>BioRad</td><td>10031255</td><td>VEX</td></tr><tr><td>Leica CM1850 Cryostat</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS filter unit</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td>0.22 & micro;m</td></tr><tr><td>MMI CellCut UV切断モデル</td><td>分子機械 &産業</td><td></td><td>LCMインストゥルメント</td></tr><tr><td>MMI CellTools ソフトウェア</td><td>分子機械 &産業</td><td>50202</td><td>LCM ソフトウェア</td></tr><tr><td>レーザー捕捉マイクロディスセクション用サンプルチューブ</td><td>ASEE 製品</td><td>ST-LMD-M-500</td><td>アイソレーション キャップ チューブ/ドイツの Microdissection GmBH によって製造され、ASEE 製品によって配布されました</td></tr><tr><td>レーザー キャプチャ マイクロ解剖用サンプル チューブ (代替)</td><td>分子機械 &Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>modified Harris Hematoxylin</td><td>Thermo scientific</td><td>7211</td><td>FAM</td></tr><tr><td>MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712)</td><td>BioRad</td><td>10031252</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Memebrane Slides, RNase Free</td><td>ASEE Products</td><td>FS-LMD-M-50r</td><td>ポリエチレンテレフタレート (PET) 膜/ドイツの Microdissection GmBH によって製造され、ASEE Products</td></tr><tr><td>Memebrane Slides, RNase Free (Alternative)</td><td>Molecular Machines &インダストリーズ</td><td>50102</td><td></td></tr><tr><td>ラピッドフィックス</td><td>サーモサイエンティフィック サイエンティフィック</td><td>6764212</td><td>H&E染色</td></tr><tr><td>RLTバッファー</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>LCMサンプルに使用される溶解バフファー</td></tr><tr><td>RNAseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>RNase除染ソリューション</td></tr><tr><td>Protect RNA RNAse阻害剤</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7397</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Microキット</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>RNA分離キット</td></tr><tr><td>SMART-Seq v4 超低入力RNAキット</td><td>タカラクロンテック</td><td></td><td>LCMサンプル用の634888低インプットRNAからcDNAへのキット</td></tr><tr><td>SuperMix(dUTPなし)</td><td>BioRad</td><td>1863023</td><td>デジタルPCRマスターミックス</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold(25mm x 20mm x5mm)</td><td>Sakura</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCTコンパウンド</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker UV架橋剤</td><td>Stratagene</td><td>400075</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Macron</td><td>8668</td><td></td></tr></tbody></table>

遺伝子発現解析のためのマウスの目から非常に純粋な小柱網のキャプチャ マイクロダイゼクション

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) は単一細胞の遺伝子発現解析、組織切片の細胞集団を濃縮します。LCM は、細胞分化と開発と緑内障を含むさまざまな病気の進行の基礎となる分子メカニズムの研究のための素晴らしいツールです。緑内障は、進行性視神経症の家族で構成されは、不可逆的失明の最も一般的な原因です。構造変化と小柱網 (TM) 内の損傷は、緑内障の開発のための主要な危険因子である増加の眼内圧 (眼圧) で起因できます。ただし、関与する正確な分子メカニズムはまだよくわかっていません。遺伝子発現解析を実行する能力は、さらにこれらの細胞と眼圧と緑内障の開発の規則に於いての役割の機能に洞察力を得ることに重要になります。これを達成するため、高度を隔離するための再現可能な方法と濃縮マウスの目と下流の遺伝子発現解析法の凍結切片から TM で、Rt-qpcr と RNA シーケンスが必要なよう。記載方法は、下流のデジタル PCR およびマイクロ アレイの分析のためマウスの目から非常に純粋な TM を分離するため開発されています。さらに、この手法は、他の高濃縮眼細胞とマウスの目から隔離することは困難されている細胞区画の隔離のために容易に適応することができます。LCM および RNA 解析の組み合わせは、緑内障の基礎となる細胞のイベントのより包括的な理解に貢献できます。

LCM は、TM から RNA を収集し、4 の別のマウスから毛様体が遺伝子発現を分析し、全体の目、強膜、虹彩、網膜、角膜、3 つの独立したマウスから隔離されたレンズでその式を比較できるために分離されました。TM は遺伝子発現、 MYOC48 , ACTA249を分離 TM サンプルが TM で濃縮した確かに高いことを確認するためのすべての収集された組織に行った。LCM のサンプルからの cDNA の非常に低い量のためより少ない材料50再現可能デジタル PCR だった使用実証されました。MYOCとACTA2式HSP90a1ハウスキーピング遺伝子を使用して、正規化されたし、各組織が全体の目と比較しました。これらの結果表現することを示すMYOC (図 7 a) と<em...

ここでは、下流の RNA 解析のための小柱網 (TM) を隔離するため再現性のあるレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) のためのプロトコルについて述べる.TM での遺伝子発現の変化を分析する能力は、TM 関連の眼疾患の分子メカニズムを理解することに役立つでしょう。

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

このレーザーマイクロダイセクション手順の全体的な目標は、レーザーキャプチャ顕微鏡を使用してマウスの目から高度に濃縮された海綿網を分離するための堅牢で再現性の高い方法を開発することです。この方法は、誤って制御されると眼疾患につながる可能性のある重要な遺伝子やシグナル伝達経路は何かなど、眼科領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、マウスの眼の線維柱帯から高品質のRNAを遺伝子発現解析のために再現性よく単離できることです。一般的に、この方法に不慣れな人は、レーザーマイクロダイセクションがプロトコル全体を通じてさまざまなトラブルシューティング手順を含む強力な技術であるため、苦労するでしょう。この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、レーザーマイクロダイセクションに最適な組織収集から開始します。RNase除染液をブラシ、鉗子、カップリングジャー、および取り付けチャックにスプレーします。十分に拭いた後、装置をヌクレアーゼフリーの水ですすぎ、乾燥させます。クロスコンタミネーションを避けるために、クライオスタットを100%エタノールで拭き取ります。取り付けチャックに少量のOCTを絞り、ティッシュブロックを型から取り外し、ブロックを取り付けチャックに慎重に置きます。取り付けチャックの組織ブロックが固まったら、クライオスタットの試料ホルダーに挿入します。次に、クライオスタットを調整して8ミクロンの切片を切断し、O.C.T.ブロックを慎重に切片にして組織サンプルに到達させます。組織を観察したら、切片化を停止します。きれいなカミソリの刃を使用してすべての側面で凍結ブロックを切り取り、ティッシュの周囲に3〜4ミリメートルのOCTを残して、ペイントブラシでの取り扱いを可能にします。目を通してセクション化し、迅速に作業します。3段ごとにスライドにワンステップのH&E染色を60秒間浸すことで染色します。セクションを水道水ですすぎ、風乾します。清算剤で切片を清算した後、カバースリップでチャージされたスライドガラスに切片を取り付け、顕微鏡で確認します。TMが染色された切片に明らかになるまで、切片化を続けます。TMが現れ始めたら、2つの切片を切断し、それらを帯電したスライドガラスに取り付けて日常的なH&E染色を行い、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによる切断用のマップを形成します。最初のH&Eマップスライドの後、クライオスタットで厚さ8ミクロンの6つの連続切片を切断して整列させ、同時にPETメンブレンスライドに取り付けます。手袋をはめた親指をメンブレンの裏側に沿って短くスライドさせて、ティッシュを接着します。取り付け後、すぐにPETメンブレンスライドをドライアイスのスライドボックスに入れます。目の切片化に進みます。それぞれ6つの切片を持つPETメンブレンスライドを2枚ごとに、帯電したガラススライドに2つの切片を採取し、H&E染色用の別のマップスライドを作成します。TMが見えなくなるまで、厚さ8ミクロンの直列切片を約100個連続して切片化します。TMの欠如を確認するには、帯電したスライドガラス上の1つの切片をすばやく染色します。テキストプロトコルに記載されているようにH&Eマップスライド染色を行った後、顕微鏡を使用してH&Eスライドを視覚的にレビューします。TMがはっきりと見え、切断しやすいマップスライドを特定します。これらのマップスライドの間にPETメンブレンスライドをLCMに使用します。マイナス80°Cの冷凍庫から凍結したティッシュ切片が入ったスライドボックスを取り出し、ドライアイスの上に置きます。スライドを 1 枚ずつ処理します。スライドを直ちにRNase阻害剤を含む75%エタノールの冷たい場所に30秒間入れて、切片を固定します。スライドをヌクレアーゼフリーの水に10〜15秒間静かに浸し、組織切片に干渉することなくO.C.T.を溶解します。300マイクロリットルの1.5%クレシルバイオレットアセテート溶液を切片に直接慎重にピペットで移し、室温で45秒間インキュベートします。次に、切片を75%エタノール浴に30秒間入れて、切片を1回洗浄します。200マイクロリットルのEosin Y溶液を切片にピペットで移し、3〜5秒間インキュベートします。続いてスライドを75%エタノール、95%エタノール、最後に100%エタノール浴にそれぞれ30秒間入れて、組織を脱水します。スライドの端をティッシュワイプで拭き取り、余分な液体を取り除きます。スライドをボンネットの下で5分間完全に空気乾燥させます。乾いたら、すぐにLCMを行います。最後の清算ステップにキシレンを使用することは避けてください。キシレン処理は、組織切片がメンブレンスライドに不適切に取り付けられる原因となります。キシレンはまた、LCMによる組織捕捉の効率を低下させます。染色された組織面を下に向けてPETメンブレンスライドを、顕微鏡ステージにロードされた新しいスライドガラスの真上に置きます。メンブレンとスライドガラスが顕微鏡ステージ上でしっかりとペアになっていることを確認してください。LCM を開始するには、まずスライドの制限を設定します。対物レンズパネルで最小の4倍倍率を選択し、顕微鏡のXYステージを動かして、金属とメンブレンが交わる左上隅がライブビデオフィードに表示されるまで、メンブレンスライドの作業領域を定義します。この時点で、Limit 1ボタンを押すと、ロードマップに赤い長方形が表示されます。次に、XYステージを反対側の角に移動し、制限2ボタンを押します。スキャンボタンを押すと、設定された制限値の間の膜と組織のロードマップ画像が作成されます。ロードマップ内のいずれかの目のセクションのTMの近くをダブルクリックします。TMは、虹彩角膜角の頂点近くに配置できます。TMが特定されたら、倍率を10倍に上げ、手動でTMに焦点を合わせます。20Xと40Xの対物レンズで繰り返します。TMが40X対物レンズにピントが合っているときは、空白の領域に移動し、フリーハンドの描画ツールを選択して、組織の空白領域に長い線を引きます。カット速度が34%、フォーカスが58%、パワーが70%になるようにレーザーパラメータを設定し、カットボタンを押します。速度、フォーカス、パワーのパラメータをレーザーで微調整し、明確で細かい切断線が観察されます。正確な切断のためには、切断動作が引かれた線に沿っていることを確認してください。次に、アイソレーションチューブの蓋をキャップホルダーにセットし、チューブを開きます。キャップホルダーをキャップリフトに取り付け、チューブが反転していることを確認します。また、粘着キャップの材料がキャップの先端を超えて突き出ていることを確認して、目的の組織が適切に捕捉されるようにします。小柱メッシュワークがピックアップされ、アイソレーションキャップに取り付けられていることを視覚的に確認することが重要です。ソフトウェアパネルで手動解剖モードを選択します。慎重にview TMがアイソレーションチューブの真下にあること。ホワイトバランスを設定し、明るさを調整して、最適な画質を取得します。カットを開始するには、手動でピントを調整し、フリーハンドツールを使用して線を引きます。コレクションキャップがまだメンブレンに触れていない状態で、上の位置に留まっていることを確認してください。TMが強膜と出会う場所の近くに部分的な円を描き、Cutを押します。最初のカットが完了したら、キャップを下の位置に配置してフォーカスを再調整し、オープンスペースまたはフリースペースに2本の線を引いて2つの部分的な円を接続し、TMの周りの円を完成させます。次に、Cutを押して、切片からティッシュを採取します。TMがマイクロダイセクションキャップによってピックアップされたことを確認します。キャップを上の位置に戻し、残りのセクションで繰り返します。キャップの位置を少し調整して、分離されたすべてのサンプルがキャップに収まり、重ならないようにします。次のPETメンブレンは、新しいアイソレーションチューブを挿入し、このセクションを繰り返します。マイクロダイセクションTM組織の溶解を行うには、10マイクロリットルの溶解バッファーをコレクションチューブの蓋に慎重にピペットで固定し、溶解バッファーがマイクロダイセントTMを完全に覆うようにします。粘着キャップを静かに閉め、採取チューブを逆さまにして室温で10分間インキュベートします。インキュベーション後、800 gで2分間遠心分離し、ライセートをドライアイスの上に置きます。ライセートは、後で精製および分析するためにマイナス80°Cで保存してください。RNAの急速な分解は、ダウンストリームのRNA分析に影響を与える可能性があります。RNAの品質は、マイクロ流体ベースのプラットフォームを使用して測定および定量する必要があります。ここでは、海綿網から精製した高品質なトータルRNAの遺伝子発現解析の代表的な結果を示します。レーザーマイクロダイセクション後の眼組織からの残りの全RNAのデジタルゲルは、その後の下流のRNA分析に必要な高いRNA完全性数を示しています。組織から良質なRNAが抽出されると、マイクロアレイ、RNA-Seq、qPCRなどのダウンストリーム解析を行うことができます。ここでは、定量的デジタルPCR分析を使用して、LCMで収集されたRNAから海綿網膜関連遺伝子、ミオシリン、およびACTA2の発現を解析しました。マイクロアレイ解析から得られたデータから生成されたヒートマップから、この手法を使用して、野生型マウスやIOP表現型が上昇したノックアウトマウスの海綿網の遺伝子発現変化を理解できることが示されています。このテクニックを習得すると、適切に行えば、生物学的動物1匹につきわずか1日で行うことができます。レーザーマイクロダイセクションステップは、目的の細胞の視覚化が困難であり、これらのユニークなサンプルの標準がないため、学習が難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションが不可欠です。熟練したオペレーターに頼ることが重要です。この手順を試みる際には、少量の組織中のRNAが急速に分解される可能性があることを覚えておくことが重要です。RNaseから機器を除染する、空気への曝露を最小限に抑える、組織を冷たく保つなどの予防策を講じる必要があります。この方法は、眼圧の上昇が海綿網特異的遺伝子発現に及ぼす影響についての洞察を提供するだけでなく、眼圧の上昇によって引き起こされる網膜の遺伝子発現の変化を評価するなど、他のシステムにも適用できます。この手順に続いて、RNA-Seqやマイクロアレイなどの他の方法を実行して、眼圧が上昇したマウスの小柱網でどのようなシグナル伝達経路が変化するかなどの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、研究者がマウスモデルの海綿網の遺伝子発現変化をより効果的に研究する道を開きました。

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Research

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Biology

生物学

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遺伝子発現解析のためのマウスの目から非常に純粋な小柱網のキャプチャマイクロダイゼクション

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