Name: 成長因子 β シグナルを変換することによって誘導される血管内皮間葉移行の分子解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 学ぶ血管内皮間葉移行（EndMT）の誘導法。TGF-β2処理によりMS-1マウス血管内皮細胞でEndMTを誘導し、形態変化と分子マーカー変化を解析します。この手法は血管生物学と疾患におけるEndMTのメカニズム解明に有用です。

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原稿の準備の提案、Zea ボロックと宮園浩平に感謝します。上原記念財団研究員で立替払やかサポートされてし、留学の立替払修早石記念奨学金としています。この作品は武田科学財団 (社) からの助成金によって支えられました。

1. EndMT の誘導
<ol><li>MS 1 細胞標準培養条件を維持し、密度を避けます。MS 1 セルのソースは、材料表の説明です。MS 1 細胞 10% 牛胎児血清 (FCS)、50 U/mL ペニシリン、50 μ g/mL ストレプトマイシンと最小必須培地-α (MEM-α) を使用します。</li>
	<li>10 cm 上を洗う MS 1 セル リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 皿し、プレートに 1.0 mL のトリプシンを追加します。37 ° C で 5 分間インキュベートします。</li>
	<li>9 mL の培地を使用してセルをデタッチします。15 mL チューブに細胞懸濁液を収集します。</li>
	<li>室温で 5 分間 300-400 x gで細胞懸濁液を遠心します。</li>
	<li>慎重に上澄みを除去し、予め温めておいた培地で細胞ペレットを中断します。</li>
	<li>トリパン ブルー溶液と標準検定またはセルの自動カウンターを使用して実行可能なセルを数える。</li>
	<li>長い言葉の文化の cm2あたり 10 の3セル × 0.5 でコーティングされていない標準培養皿上にプレート MS 1 セルです。たとえば、プレート 5.0 x 103セル/6 ウェルのプレートも文化.FCS の同じ濃度を含む同じ培地を使用します。MS 1 セル、TGF-β は FCS の使用と長期的文化 (少なくとも 48-72 時間) で EndMT を誘発します。</li>
	<li>24 h 後 TGF-β 2 (最終濃度 1 ng/mL) と内皮細胞を刺激します。</li>
	<li>(5% CO2、37 ° C) の加湿インキュベーターで培養細胞。形態学的変化に着目したときセルを毎日監視します。</li>
	<li>長期的文化の TGF-β 治療の 48 時間後 TGF β 2 を含む新鮮な予め温めておいた文化メディアとメディアを交換してください。</li>
	<li>下流の分析に進みます。通常、アクチン再編成を観察、治療の 24 時間後、TGF-β による治療の 48-72 時間後血管内皮マーカーのダウンレギュレーションと間葉系のマーカーの発現が観察されます。</li>
</ol>2. 免疫細胞化学的解析
<ol><li>MS 1 細胞標準培養条件を維持します。</li>
	<li>プレート MS 1 セル 4 にもよく (1.7 cm2) ごとの 10 の3セル × 1.0 で文化室スライドをセルします。スライドは、ゼラチンで塗装。ウェルあたり文化メディアの使用 0.5-1.0 mL。</li>
	<li>24 h 後 TGF-β 2 (最終濃度 1 ng/mL) と内皮細胞を刺激します。EndMT の岩の関与を解析するときは、TGF-β 治療に岩阻害剤の Y-27632 (10 μ M) 1 h 前を追加します。TGF-β シグナル伝達阻害の効果を評価する際は、TGF-β 受容体キナーゼ阻害剤が使用できます。</li>
	<li>(5% CO2、37 ° C) の加湿インキュベーターで培養細胞。アクチン再編成は、TGF-β 治療の 24 時間後 MS 1 細胞で観察されます。その他の変更は、治療の 48-72 時間後に明らかになります。72 h 文化、TGF-β 投与の 48 時間後 TGF-β を含む新鮮なメディアでメディアを交換してください。</li>
	<li>
F-アクチン染色
	<ol>
<li>TGF-β 治療の 24 時間後に、メディアを取り出し、1 × PBS、室温で 20 分間で 4% パラホルムアルデヒドとセルを修正 1 × PBS のセルをすすいでください。</li>
		<li>0.2% トリトン X-100 室温で 5 分間、インキュベートします。</li>
		<li>3 回 1 × PBS のセルをすすいでください。</li>
		<li>タマゴテングタケ有機希釈からファロイジン tetramethylrhodamine B イソチオ シアン酸と孵化に室温で 1 時間ブロッキング バッファー。</li>
		<li>3 回 1 × PBS のセルをすすいでください。</li>
		<li>室温で 5 分間シアニン核酸結合色素を持つ核を染色します。</li>
		<li>リンス スライドやマウント coverslips スライド メディアのマウントを使用してスライドの下向き。</li>
		<li>共焦点顕微鏡で観察します。ファロイジンの蛍光性の検出の 543 nm レーザーと 560-615 nm の発光フィルターを使用します。633 nm レーザーと 650 を超える排出フィルターを使用して、染色性が核の nm。TGF-β による治療、時に厚いストレスファイバー形成過程を観察するでしょう。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
VE カドヘリンと α SMA 染色
	<ol>
<li>TGF-β 治療の 72 時間後メディアを削除、50% メタノールとアセトン 50% セルを修正 (0.5-1.0 mL/ウェル) 5 分。</li>
		<li>すすぎ 3 回 1 × PBS のセル (0.5-1.0 mL の井戸あたり)。</li>
		<li>製造元の推奨濃度によると暗闇の中で 4 ° C で一晩ブロック バッファーで一次抗体とインキュベートします。VE カドヘリン モノクローナル抗体 (BV13、1: 100 希釈)、Cy3 共役 α SMA モノクローナル抗体 (1A4、希釈 1: 200)20を使用します。</li>
		<li>3 回 1 × PBS のセルをすすいでください。</li>
		<li>製造元の推奨濃度によると暗闇の中で室温で 1 時間ブロッキング バッファーで VE カドヘリン抗体緑色素結合の二次抗体と細胞を孵化させなさい。</li>
		<li>3 回 1 × PBS のセルをすすいでください。</li>
		<li>室温で 5 分間シアニン核酸結合色素を持つ核を染色します。</li>
		<li>リンス スライドやマウント coverslips スライド メディアのマウントを使用してスライドの下向き。</li>
		<li>共焦点顕微鏡で観察します。543 nm レーザーと 560-615 nm の発光フィルターを α SMA (Cy3) の検出のために使用します。488 nm レーザーと 505-550 nm の発光フィルターを使用して、VE カドヘリンの発見のため。通常は、TGF-β 治療による治療、時に VE カドヘリン信号が小さくなり、α SMA 信号の増加が観察されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 三次元コラーゲン ゲル収縮アッセイ
<ol><li>コラーゲン ゲル収縮アッセイ前 72 h の TGF-β なしで MS 1 細胞の培養を実行します。</li>
	<li>型を準備私コラーゲンゲル氷の上。ミックス冷たいコラーゲン溶液、濃縮 10 倍 MEM 媒体、0.05 N 水酸化ナトリウム、2.2% NaHCO3、および 200 mM HEPES pH 7.4 8:1 を含むコラーゲン希釈バッファー: 1 比。</li>
	<li>ミックスのコントロールや TGF β 治療の血管内皮細胞懸濁液 (1.0 x 106セル/200 μ L) の 200 mL とコラーゲン ゲル溶液の 800 μ l。TGF-β の扱われたサンプルは TGF-β 2 を追加 (1 ng/mL) 細胞懸濁液を。</li>
	<li>12 も培養プレートの各ウェルに 1.0 mL の混合物を追加し、37 ° C で 30-60 分のためのインキュベーターで固化することができます。</li>
	<li>糊では、MEM α 10 %fcs、50 U/mL ペニシリン、50 μ g/mL ストレプトマイシンを含むゲルをフロートに 1.0 mL をオーバーレイします。TGF-β の扱われたサンプルは TGF-β 2 を追加 (1 ng/mL) メディアに。 注: TGF-β の扱われたサンプル追加 TGF-β ゲルと培地の両方に。</li>
	<li>48 h の 37 ° C でフローティングのゲルを孵化させなさい。</li>
	<li>スキャナーを使用してプレートの底からゲルの画像をスキャンします。また、ゲル、ゲル上の固定距離でデジタル カメラを使用しての画像を記録します。</li>
	<li>ImageJ を用いた画素数に基づくゲル表面領域を定量化します。フリーハンド選択範囲または選択ツールを使用してゲルを選択またはゲルを使用して選択"画像 |調整 |色のしきい値」ツールをクリックし、ゲルを使用して領域を決定する"分析 |メジャー"コマンドです。</li>
</ol>4. miRNA 活動によってロックされた核酸を用いた miRNA 阻害剤の阻害
<ol><li>MS 1 細胞標準培養条件を維持します。</li>
	<li>ロックされた核酸 (LNA) miRNA 阻害剤、合成マイクロ Rna 二重鎖または製造元の指示に従ってリポフェクション試薬を用いる Sirna (20 または 50 nM) を transfect します。詳細および LNA miRNA 阻害剤、合成 miRNA デュープレックスと Sirna のソースは、以前レポート26,27に記載されました。MS 1 セルの製造元の指示に基づく標準的な導入手順は LNA miRNA 阻害剤、合成マイクロ Rna 二重鎖や Sirna の導入のために働きます。</li>
	<li>16-48 時間後に、TGF-β 2 (最終濃度 1 ng/mL) と内皮細胞を刺激します。</li>
	<li>RNA 発現解析 (定量的 RT-PCR と RNA シーケンス (seq RNA) 解析)、免疫組織化学的解析、レポーターアッセイなど各種の下流の分析に進みます。下流の分析は、以前レポート20,26,27に記載されています。</li>
</ol>

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<li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal-endothelial+transition+contributes+to+cardiac+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization.</a> Nature. 514 (7524), 585-590 (2014).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+balance+of+aberrant+Rasal1+promoter+methylation+and+hydroxymethylation+regulates+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Research%22%5BJournal%5D)">Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis.</a> Cardiovasc Research. 105 (3), 279-291 (2015).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Endothelial+Cells+with+Distinct+Patterns+of+TGFbeta-Driven+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Cancer Research. 75 (7), 1244-1254 (2015).</li>
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それは 24 時間活性化 Ras および TGF-β 治療による MS 1 セルで EndMT である TGF-β 単独でこの短い期間21EndMT を誘導するために失敗したことが報告されています。一貫して、TGF-β 大幅に誘導 EndMT 長い治療 (48-72 h) 後 MS 1 セル20を見ました。ひと臍帯など様々 な血管内皮細胞における TGF-β (2-6 日) との長期治療静脈内皮細胞 (株) ひと皮膚微小血管内皮細胞 (HCMEC)、冠動脈内皮細胞 (後、EndMT は、何度も観察されています。HCEC)、マウス肺血管内皮細胞 (MLEC)、ラット脳血管内皮細胞 (BEC)、ウシ大動脈血管内皮細胞 (BAEC)、不死化ウシ網膜微小血管内皮細胞 (iBREC)、およびヒツジ大動脈弁血管内皮細胞8, 18,29,<sup c...

内皮間葉転換 (EndMT) は、差別化された血管内皮細胞は様々 な線維芽細胞のような間葉系細胞1分子変化を受けるプロセスです。EndMT は、当初ハート2,3の開発中に内皮細胞変換として記述されていた。心開発の初期段階、心臓の管は内部の心内膜と外側の心筋で構成されます。これらの 2 つの層は、心臓のゼリーと呼ばれる細胞外のマトリックスの層で区切られます。血管内皮細胞のマーカーを取得するには、胚の心内膜細胞間葉系細胞にトランジット、基になる心臓ゼリーに侵入して房室弁の中隔の基盤を提供する心臓のクッションの形成を促進半月弁。さらに、EndMT は、冠血管、腹部大動脈および肺動脈4,5,6を含む他の胚の血管システムのペリサイトおよび血管平滑筋細胞の源に示唆されています。さらに、EndMT、発芽7生理的血管新生に関与しています。
証拠の蓄積は、EndMT が複数の心血管疾患と他の疾患1,8にも関与していることを示唆しています。EndMT 関連付けられている条件は、血管石灰化、動脈硬化症、肺動脈高血圧症、海綿静脈奇形、臓器線維症、静脈グラフトを改造、同種移植片機能不全腎移植、癌8、します。 9,10、11,12,13,14,15,16,17, 18. 最近の報告書は、いくつかの分子 EndMT マーカーが腎臓移植17で移植腎機能障害の診断と予後予測のためのツールをすることができます説明します。EndMT 関連細胞シグナル伝達経路の変調は心筋線維化を含むいくつかの病気の条件を改善するために示されているし、8,15をモデル動物に静脈グラフトの改造します。したがって、メカニズムを理解すること基になる EndMT は、EndMT をターゲット診断と治療戦略を開発することが重要です。
EndMT は、細胞間の接合、渡り鳥の可能性の増加、VE カドヘリンなど血管内皮特異遺伝子のダウンレギュレーションと α-平滑筋アクチン (α SMA) を含む間葉系遺伝子の発現の損失によって特徴付けられます。さらに、EndMT と上皮間葉移行 (EMT)、間葉系細胞、上皮細胞に変換する同様のプロセス開発に貢献するかもしれない様々 なの細胞外マトリックス成分の変更された生産に関連付けられています。組織の線維化の8,19。
最近では、EndMT のいくつかの生体外の研究は、EndMT15,20の分子機構の詳細を解明しました。形質転換成長因子 (TGF) を含む様々 なシグナル伝達経路による EndMT-β、wnt シグナル、ワンランク上の1と。中でも、TGF-β は EMT と EndMT の両方の誘導に重要な役割を果たしています。EndMT、短い露光では、不十分な21と思われる中様々 な血管内皮細胞の EndMT で TGF β の結果への露出を延長しました。ここで EndMT の誘導、どのマイル スヴェン 1 (MS-1) マウス膵微小血管内皮細胞を体外でEndMT TGF-β20への長期暴露の後受ける簡単なプロトコルについて述べる。EndMT、形態学的変化、血管内皮マーカーのダウンレギュレーション、間葉系のマーカー、炎症性遺伝子、細胞骨格のアップレギュレーションの認刻極印の特徴を検討するこのモデルでは、複数のダウン ストリーム解析を実行できます。再編成とコラーゲンゲル収縮。
マイクロ Rna (Mirna) は ~ 22 nt 様々 な mRNA ターゲット22,23の転写後遺伝子抑制の直接規制 Rna。シード シーケンスを介したターゲット認識による Mirna は標的遺伝子の数百人を抑制し、細胞の分化・増殖・運動など多様な細胞機能を調節します。これはまた、EMT と EndMT の規制の場合といくつかの miRNAs は EMT と EndMT24,25の調節因子として報告されています。このレビューで提示した EndMT モデルは、簡単に EndMT の Mirna の役割をテストする miRNA 調節プロシージャと組み合わせることができます。現在レビューは MS 1 細胞における TGF β 誘導 EndMT を調査するための実験プロシージャを要約しも他の血管内皮細胞における TGF-β の EndMT 誘導条件の比較が含まれています。

<table><tbody><tr><td>MS-1細胞</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-2279</td><td></td></tr><tr><td>MEM-alpha</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32571036</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta2</td><td>R&D</td><td>302-B2-002</td><td></td></tr><tr><td>4ウェルLab-Tek IIチャンバースライド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>154526</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Blocking One</td><td>nacalai tesque</td><td>03953-95</td><td></td></tr><tr><td>ファロイジン-テトラメチルローダミン B イソチオシアネート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-3 ヨウ化物</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>VE カドヘリンモノクローナル抗体 (BV13)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-1441-82</td><td></td></tr><tr><td>α-SMACy3モノクローナル抗体 (1A4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウスIgG (H+L)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>174934</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン溶液</td><td>新田ゼラチン Inc.</td><td>Cellmatrix I-P</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン希釈バッファー</td><td>ニッタゼラチン(株)</td><td>Cellmatrix I-P</td><td></td></tr><tr><td>LNA miRNA阻害剤</td><td>EXIQON&nbsp;</td><td>miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA)</td><td></td></tr><tr><td>synthetic miRNA duplex</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>miScript miRNA Mimic</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778030</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td></td></tr></tbody></table>

成長因子 β シグナルを変換することによって誘導される血管内皮間葉移行の分子解析

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

内皮細胞の表現型可塑性は、心血管系システム開発、心血管疾患や臓器線維症に関連付けられている様々 な条件に基づいています。これらの条件では、差別化された血管内皮細胞は、間葉系のような表現型を取得します。この内皮間葉転換 (EndMT) と呼ばれており血管内皮マーカーのダウンレギュレーション、間葉系のマーカー、および形態学的変化のアップレギュレーションが特徴です。形質転換成長因子 (TGF) を含むいくつかのシグナル伝達経路による EndMT-β、wnt シグナル、およびノッチ、原腸陥入、組織の線維化の分子メカニズム上皮間葉転換 (EMT) 重要のそれらに類似による規制とがんの転移。EndMT のメカニズムの理解は、ターゲット EndMT 診断および治療上のアプローチを開発することが重要です。EndMTの in vitroの堅牢な誘導は、一般的な遺伝子発現シグネチャを特徴付ける、druggable の分子メカニズムを特定する、EndMT の画面に便利です。ここでは、EndMT の誘導のための in vitro法について述べる。MS 1 マウス膵微小血管内皮細胞 TGF-β への長期暴露の後 EndMT を受けるし、複数の炎症性ケモカイン、サイトカインの誘導だけでなく、間葉系のマーカーと形態変化のアップレギュレーションを表示します。マイクロ Rna (miRNA) 変調の解析のためのメソッドが含まれています。これらのメソッドは、EndMT と EndMT する Mirna の貢献を根底にあるメカニズムを調査するためのプラットフォームを提供します。

TGF β は様々 な血管内皮細胞の EndMT の強力な誘導です。MS 1 細胞における TGF-β の 24 時間投与、F-アクチン染色アクチン ストレス線維 (図 1 a)20の再編成を示しています。ROCK 阻害剤の Y-27632 の前処理は、アクチン再編成20の誘導を阻害します。MS 1 血管内皮細胞は、古典的な石畳のような形態から TGF-β 治療 (図 1 b) に間葉系紡錘状の形態に変更します。TGF β 処理細胞は、細胞間の接触を失います。48-72 時間 TGF-β の投与、免疫細胞化学的解析は VE カドヘリンの発現の低下と α SMA (図 1) の発現の増加を示しています。TGF-β は、大幅に治療 (数字 1と1E</st...

体外誘導 EndMT に関与する細胞のシグナル伝達経路を調査するために有用である内皮間葉転換 (EndMT) のためのプロトコルを説明します。この実験モデルでは、EndMT は MS 1 血管内皮細胞における TGF-β によって誘導されます。

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

この方法は、がんを含むさまざまな病的状態における内皮可塑性のメカニズムなど、血管およびがん生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、TGF-in MS-1内皮細胞による治療により、in vitro EndMTの堅牢な誘導が達成されることです。まず、MS-1細胞を標準的な培養条件で増殖させ、培養物がコンフルエントにならないようにします。次に、10 cmの皿で、MS-1細胞を1xリン酸緩衝生理食塩水で洗浄します。次に、1 mLのトリプシンをプレートに加え、プレートを摂氏37度で5分間インキュベートします。次に、トリプシン処理した細胞に9 mLの培養培地を加えて剥離します。次に、トリプシン処理した細胞懸濁液を15mLチューブに集めます。細胞懸濁液を300〜400 x Gで室温で5分間遠心分離します。次に、自動セルカウンターを使用して、生細胞の数をカウントします。次に、MS-1細胞をコーティングされていない標準培養プレートにプレート化し、長期培養します。24時間後、TGF-2の最終濃度をTGF-21ミリリットルあたり1ngの最終濃度で内皮細胞を刺激します。次に、培養プレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素とインキュベートします。48時間の処理後、培地をTGF-2を含む新鮮な予熱培地と交換します 下流の分析のために、ゼラチンで事前にコーティングされた8ウェル培養チャンバースライドにMS-1細胞をプレートします。24時間後、10 MのROCK阻害剤を細胞培養物に加えます。1時間後、TGF-2の最終濃度をTGF-21ミリリットルあたり1ngの最終濃度で内皮細胞を刺激します。次に、細胞を摂氏37度でインキュベートします。72時間の培養の場合は、48時間後に古い培地を新しいTGF-2含有培地と交換します。TGF治療の丸1日後、培地を取り出します。.次に、細胞を4%パラホルムアルデヒドとリン酸緩衝生理食塩水で室温で20分間固定します。固定期間が終了したら、リン酸緩衝生理食塩水で細胞をすすぎます。次に、細胞を0.2%Triton X-100と室温で5分間インキュベートします。5分後、再度1xリン酸緩衝生理食塩水で細胞を3回すすぎます。3回の洗浄後、希釈した蛍光ファロトキシン含有ブロッキングバッファーと細胞を室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、1xリン酸緩衝生理食塩水で細胞を3回洗浄します。次に、シアニン核酸結合色素を使用して細胞核を室温で5分間染色します。5分後、スライドをすすぎ、スライド埋込みメディアを使用してスライドにカバースリップを取り付けます。共焦点顕微鏡で細胞を観察します。この細胞は、TGF-2処理時に太いストレス線維の再編成を示します。これは、内皮細胞におけるEndMTの誘導におけるTGF-2の効力を示しています。TGF-2処理の72時間後、培地を廃棄し、細胞を0.5〜1mlの50%冷メタノールと50%アセトンで5分間固定します。次に、1xリン酸緩衝生理食塩水で細胞を3回すすぎます。3回の洗浄が完了したら、細胞を一次抗体とブロッキングバッファーで4°Cの暗所で一晩インキュベートします。翌日、再度、1xリン酸緩衝生理食塩水で細胞を3回洗浄します。次に、ブロッキングバッファー中のVE-カドヘリンに対する緑色色素標識二次抗体と細胞を暗所で1時間インキュベートします。再度、1xリン酸緩衝生理食塩水で細胞を3回洗浄します。次に、シアニン核酸結合色素を使用して細胞核を室温で5分間染色します。5分後、スライドをすすぎ、スライド埋込媒体を使用してスライドにカバースリップを取り付けます。その後、共焦点顕微鏡で細胞を観察します。この細胞は、TGF-2を48時間から72時間処理すると、VEカドヘリンの発現が減少し、平滑筋アクチンの発現が増加しました。コラーゲンゲル収縮アッセイの前に、TGF-2の存在下と非存在下でMS-1細胞を72時間培養します。次に、氷上で1型コラーゲンジェルを準備します。次に、800 lのコラーゲンゲル溶液を、200 mLのコントロールまたはTGF-2処理内皮細胞と混合します。次に、この混合物を12ウェル培養プレートの各ウェルに1 mL加えます。ゲルを摂氏37度で30〜60分間固化させます。ゲルを固化した後、10%のウシ胎児血清、50単位/ミリリットルのペニシリン、およびストレプトマイシン1ミリリットルあたり50gを含む1mLのMEMアルファを加えて、ゲルを浮かせます。次に、ウェルの壁からゲルをはがし、浮遊ゲルを摂氏37度で48時間インキュベートします。インキュベーションの48時間後、スキャナーを使用してプレートの底からゲルの画像をスキャンします。明確な形態学的変化が見られ、TGF-2治療に72時間さらされることにより、細胞が丸石から間葉系の紡錘形構造に変わります。興味深いことに、TGFベータ2を48〜72時間処理すると、MS-1細胞における平滑筋アクチンのmRNAおよびタンパク質発現レベルの両方の増加が見られる。ゲル収縮アッセイでは、TGF-2処理時にコラーゲン1型ゲルが有意に収縮することも示されています。興味深いことに、TGF-2が欠乏すると、平滑筋のアクチンが基底レベルまで減少し、細胞は丸石の形態を再開し、EndMTが動的なプロセスであることを示しています。実際、MS-1細胞を用いたLNAマイクロRNA阻害剤によりマイクロRNA31を阻害すると、間葉系マーカーの誘導が減弱する。しかし、この阻害剤は、フィブロネクチン1、PAI−1、およびSmad 7などのTGF標的遺伝子の誘導に影響を与えません。この手順を遺伝子発現、ノックダウン、マイクロアレイ調節などの方法として実行することで、EndMTの特定の遺伝子やマイクロRNA機能などの追加の質問に答えることができます。

molecular-analysis-endothelial-mesenchymal-transition-induced

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

簡単な方法は、種々の細胞型における間葉移行（EMT）上皮の誘導のために記載されている。免疫細胞化学によるEMT状態にある細胞の分析のための方法が含まれる。...

間葉転換を誘導し、上皮の分析

選択的スプライシング制御は、さまざまな生理学的および病理学的プロセスにおける必須の細胞プログラムである上皮間葉転換(EMT)に寄与することが示されています。ここでは、EMT中の選択的スプライシングの検出に誘導性EMTモデルを利用する方法について説明します。...

上皮間葉転移の間の選択的スプライシングの検出

ここでは、上皮間葉転換を経験した間葉系細胞の収縮機能を評価するためのゲル収縮アッセイの開発と応用について説明します。...

開発<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイは、間葉細胞受けた上皮間葉移行の収縮機能を評価します

この原稿は、制御された環境で内皮細胞のチューブ形成を使用して、特定の化合物または状態が血管新生に及ぼす影響を定量化するチューブ形成アッセイについて説明しています。...

戦略的な内皮細胞管形成アッセイ：細胞外マトリックスおよび成長因子の比較は、細胞外マトリックスを削減しました

ここでは、マイクロRNA-200ファミリーメンバーとgrainyhead様2（GRHL2）の合成異所性発現に基づく肉腫細胞における間葉上皮移行（MET）を誘導する細胞培養方法を提示します。この方法は、癌の悪性度や治療上の表現型可塑性の生物学的影響をよりよく理解するために適しています。...

肉腫細胞における間葉上皮移行の誘導

シリコーンゴム(PDMS)で製造された高スループットトラクション力アッセイを提示する。この新しいアッセイは、様々な生物学的および生物医学的プロセスおよび疾患における細胞収縮性の物理的変化を研究するのに適している。上皮間葉転移中の収縮性のTGF-β依存性の増加を測定することにより、この方法の有用性を実証する。...

PDMSを用いた高スループットトラクション力顕微鏡検査は、上皮間膜遷移に対する成長因子-βの線量依存的効果を明らかにする

miRNA の治療には、癌の進行を調節する重要な可能性があります。ここに示す解析的アプローチ、組合せ miRNA...

組合せ miRNA 細胞周期の調節、血管新生治療の解析

このシグナル経路に関与するタンパク質および遺伝子発現を研究することにより、TGF-βシグナル伝達およびTGF...

乳がんおよび正常細胞におけるTGF-βシグナル伝達とTGF β誘発性上皮間葉間質転移の研究

細胞形態変化を観察し、免疫蛍光染色を用いたEndMT関連マーカー変化の発現を調べることにより、内皮細胞におけるTGF-β2誘導EndMTを調べる方法について述べる。CRISPR/Cas9遺伝子編集は、TGF-β2誘導EndMTにおけるその役割を調査するためにカタツムリをコードする遺伝子を枯渇させるために記述され、使用された。...

TGF β媒介性間葉転移(EndMT)およびCRISPR/Cas9遺伝子編集を用いたEndMTエフェクターの機能評価

ここでは、病理的および生理的な流体せん断ストレス条件に曝露した内皮細胞における近接ライゲーションアッセイ(PLA)を用いて、複数のSMAD複合体を同時に可視化・解析するプロトコルを確立する。...

近接ライゲーションアッセイを用いた異流体せん断応力条件下でのTGFβ/BMP/SMADシグナル伝達の可視化と定量化

本プロトコルは、栄養膜細胞などの細胞が細胞外基底膜マトリックスの層上に毛細血管様構造に組織化する古典的な in vitro...

分化マーカー発現解析のための血管新生チューブ形成アッセイからの栄養膜細胞回収

学ぶ血管内皮間葉移行（EndMT）の誘導法。TGF-β2処理によりMS-1マウス血管内皮細胞でEndMTを誘導し、形態変化と分子マーカー変化を解析します。この手法は血管生物学と疾患におけるEndMTのメカニズム解明に有用です。

成長因子 β シグナルを変換することによって誘導される血管内皮間葉移行の分子解析

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