成長因子 β シグナルを変換することによって誘導される血管内皮間葉移行の分子解析
2018年8月3日
体外誘導 EndMT に関与する細胞のシグナル伝達経路を調査するために有用である内皮間葉転換 (EndMT) のためのプロトコルを説明します。この実験モデルでは、EndMT は MS 1 血管内皮細胞における TGF-β によって誘導されます。
この方法は、がんを含むさまざまな病的状態における内皮可塑性のメカニズムなど、血管およびがん生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、TGF-in MS-1内皮細胞による治療により、in vitro EndMTの堅牢な誘導が達成されることです。まず、MS-1細胞を標準的な培養条件で増殖させ、培養物がコンフルエントにならないようにします。
次に、10 cmの皿で、MS-1細胞を1xリン酸緩衝生理食塩水で洗浄します。次に、1 mLのトリプシンをプレートに加え、プレートを摂氏37度で5分間インキュベートします。次に、トリプシン処理した細胞に9 mLの培養培地を加えて剥離します。
次に、トリプシン処理した細胞懸濁液を15mLチューブに集めます。細胞懸濁液を300〜400 x Gで室温で5分間遠心分離します。次に、自動セルカウンターを使用して、生細胞の数をカウントします。
次に、MS-1細胞をコーティングされていない標準培養プレートにプレート化し、長期培養します。24時間後、TGF-2の最終濃度をTGF-21ミリリットルあたり1ngの最終濃度で内皮細胞を刺激します。次に、培養プレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素とインキュベートします。
48時間の処理後、培地をTGF-2を含む新鮮な予熱培地と交換します 下流の分析のために、ゼラチンで事前にコーティングされた8ウェル培養チャンバースライドにMS-1細胞をプレートします。24時間後、10 MのROCK阻害剤を細胞培養物に加えます。1時間後、TGF-2の最終濃度をTGF-21ミリリットルあたり1ngの最終濃度で内皮細胞を刺激します。
次に、細胞を摂氏37度でインキュベートします。72時間の培養の場合は、48時間後に古い培地を新しいTGF-2含有培地と交換します。TGF治療の丸1日後、培地を取り出します。.
次に、細胞を4%パラホルムアルデヒドとリン酸緩衝生理食塩水で室温で20分間固定します。固定期間が終了したら、リン酸緩衝生理食塩水で細胞をすすぎます。次に、細胞を0.2%Triton X-100と室温で5分間インキュベートします。
5分後、再度1xリン酸緩衝生理食塩水で細胞を3回すすぎます。3回の洗浄後、希釈した蛍光ファロトキシン含有ブロッキングバッファーと細胞を室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、1xリン酸緩衝生理食塩水で細胞を3回洗浄します。
次に、シアニン核酸結合色素を使用して細胞核を室温で5分間染色します。5分後、スライドをすすぎ、スライド埋込みメディアを使用してスライドにカバースリップを取り付けます。共焦点顕微鏡で細胞を観察します。
この細胞は、TGF-2処理時に太いストレス線維の再編成を示します。これは、内皮細胞におけるEndMTの誘導におけるTGF-2の効力を示しています。TGF-2処理の72時間後、培地を廃棄し、細胞を0.5〜1mlの50%冷メタノールと50%アセトンで5分間固定します。
次に、1xリン酸緩衝生理食塩水で細胞を3回すすぎます。3回の洗浄が完了したら、細胞を一次抗体とブロッキングバッファーで4°Cの暗所で一晩インキュベートします。翌日、再度、1xリン酸緩衝生理食塩水で細胞を3回洗浄します。
次に、ブロッキングバッファー中のVE-カドヘリンに対する緑色色素標識二次抗体と細胞を暗所で1時間インキュベートします。再度、1xリン酸緩衝生理食塩水で細胞を3回洗浄します。次に、シアニン核酸結合色素を使用して細胞核を室温で5分間染色します。
5分後、スライドをすすぎ、スライド埋込媒体を使用してスライドにカバースリップを取り付けます。その後、共焦点顕微鏡で細胞を観察します。この細胞は、TGF-2を48時間から72時間処理すると、VEカドヘリンの発現が減少し、平滑筋アクチンの発現が増加しました。
コラーゲンゲル収縮アッセイの前に、TGF-2の存在下と非存在下でMS-1細胞を72時間培養します。次に、氷上で1型コラーゲンジェルを準備します。次に、800 lのコラーゲンゲル溶液を、200 mLのコントロールまたはTGF-2処理内皮細胞と混合します。
次に、この混合物を12ウェル培養プレートの各ウェルに1 mL加えます。ゲルを摂氏37度で30〜60分間固化させます。ゲルを固化した後、10%のウシ胎児血清、50単位/ミリリットルのペニシリン、およびストレプトマイシン1ミリリットルあたり50gを含む1mLのMEMアルファを加えて、ゲルを浮かせます。
次に、ウェルの壁からゲルをはがし、浮遊ゲルを摂氏37度で48時間インキュベートします。インキュベーションの48時間後、スキャナーを使用してプレートの底からゲルの画像をスキャンします。明確な形態学的変化が見られ、TGF-2治療に72時間さらされることにより、細胞が丸石から間葉系の紡錘形構造に変わります。
興味深いことに、TGFベータ2を48〜72時間処理すると、MS-1細胞における平滑筋アクチンのmRNAおよびタンパク質発現レベルの両方の増加が見られる。ゲル収縮アッセイでは、TGF-2処理時にコラーゲン1型ゲルが有意に収縮することも示されています。興味深いことに、TGF-2が欠乏すると、平滑筋のアクチンが基底レベルまで減少し、細胞は丸石の形態を再開し、EndMTが動的なプロセスであることを示しています。
実際、MS-1細胞を用いたLNAマイクロRNA阻害剤によりマイクロRNA31を阻害すると、間葉系マーカーの誘導が減弱する。しかし、この阻害剤は、フィブロネクチン1、PAI−1、およびSmad 7などのTGF標的遺伝子の誘導に影響を与えません。この手順を遺伝子発現、ノックダウン、マイクロアレイ調節などの方法として実行することで、EndMTの特定の遺伝子やマイクロRNA機能などの追加の質問に答えることができます。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本記事では、TGF-β2を用いてMS-1マウス膵臓微小血管内皮細胞に内皮間葉転換（EndMT）を誘導するための、堅牢なin vitro手法を提示します。本プロトコルにより、マイクロRNAの変動を含む、EndMTに伴う形態学的および分子的な変化の詳細な解析が可能となり、EndMTの基礎となるメカニズムや、血管生物学および疾患におけるその役割を調査するための有用なプラットフォームを提供します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 血管生物学
- 細胞可塑性
- 分子生物学
背景
- EndMTとは、内皮細胞が間葉系様表現型を獲得するプロセスのことです。
- これは心血管系の発達、疾患、および臓器線維化に関与しています。
- EndMTでは、内皮マーカーのダウンレギュレーションと間葉系マーカーのアップレギュレーションが起こります。
- TGF-β、Wnt、Notchなどのシグナル伝達経路がEndMTを制御しており、そのメカニズムはEMTと類似しています。
研究目的
- 血管内皮細胞においてEndMTを誘導するための信頼性の高いin vitroプロトコルを確立すること。
- EndMT過程における遺伝子およびタンパク質の発現変化を特性解析すること。
- EndMTにおけるmicroRNAの役割を研究するためのプラットフォームを提供すること。
使用した手法
- 標準条件下でのMS-1内皮細胞の培養。
- EndMTを誘導するためのTGF-β2による処理。
- VE-cadherinおよび平滑筋アクチンなどのマーカーを用いた免疫蛍光染色。
- 機能的変化を評価するためのコラーゲンゲル収縮アッセイ。
- LNA阻害剤を用いたmicroRNAの調節。
主な結果
- TGF-β2処理により、細胞形態が石畳状から紡錘形へと変化する。
- 間葉系マーカー（例：smooth muscle actin）の発現上昇および内皮系マーカー（例：VE-cadherin）の発現低下が認められる。
- EndMTの誘導に伴い、コラーゲンゲルの収縮が増加する。
- TGF-β2を除去すると、EndMTは可逆的に戻る。
- microRNA-31の阻害は、TGF-β標的遺伝子に影響を与えることなく、間葉系マーカーの誘導を減弱させる。
結論
- 記述されたプロトコルにより、in vitroにおけるEndMTの強固で再現性のある誘導が可能になります。
- このシステムは、EndMTにおける分子メカニズムや遺伝子/microRNAの機能を解析するのに適しています。
- 本手法は、EndMTのモジュレーターおよび潜在的な治療標的をスクリーニングするための基盤を提供します。
よくある質問
産業界における重要性
TGF-βシグナリングを介した内皮間葉転換（EndMT）の堅牢なin vitro誘導および分子解析により、バイオファーマチームは血管可塑性と線維化の根底にあるメカニズムを調査することが可能になります。このプラットフォームは、初期段階のターゲット検証、メカニズムのデリスキング、および心血管疾患や線維性疾患のパイプラインに関連するモジュレーターの同定を支援します。本アプローチは、トランスレーショナルリサーチおよびポートフォリオの選別における意思決定に予測的な信頼性を提供します。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 血管内皮細胞におけるTGF-β駆動の表現型可塑性の解析を可能にする。
- EndMTに関与する候補遺伝子およびmicroRNAの機能的検証をサポートする。
- 疾患に関連する転換へのパスウェイの寄与を明らかにすることで、メカニズム的なリスク低減を促進する。
- ターゲットへの結合およびパスウェイ変調を評価するための定量的な枠組みを提供する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- EndMTモジュレーターをスクリーニングするための再現性のあるin vitroシステムを構築します。
- マーカー発現および形態学的アッセイを通じて、標準化されたリードアウトを提供します。
- 化合物が遺伝子、タンパク質、および機能的出力に及ぼす影響の定量的評価を可能にします。
- ハイコンテンツスクリーニングに向けたアッセイのスケールアップおよびプラットフォームの再利用をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- in vitroでの知見を、心血管および線維化モデルにおける疾患関連メカニズムと整合させます。
- EndMTモジュレーターの探索から前臨床検証までの連続性を可能にします。
- EndMT経路を標的とする候補物質の、リスク調整済みの進展を支援します。
- 分子および機能的なエンドポイントを通じて、トランスレーショナルなバイオマーカーの知見を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、創薬から前臨床段階に至る一連の流れに組み込まれ、仮説検証、ターゲットバリデーション、およびEndMTに影響を与えるモジュレーターの初期スクリーニングを支援します。
- 探索生物学：TGF-β誘導性の転換におけるパスウェイの解明および生物学的リスクの低減を促進します。
- スクリーニング：化合物評価およびアッセイ開発のための、再現性のある定量的なアウトプットを提供します。
- 解析：比較解析のための、遺伝子、タンパク質、および機能的変化の測定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：in vitroでのメカニズム的な知見を、EndMTが関与する前臨床疾患モデルへと橋渡しします。
- 企業内での再利用：多様なメカニズム研究やスクリーニング研究に利用可能な、標準化された再利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 標的バリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用の価値： チーム横断的な導入が可能な、標準化され、拡張性があり、再現性の高いワークフローを提供する。
- 戦略的価値： Go/No-go決定に情報を供し、初期段階のプログラムのリスクを低減することで資本効率を向上させる。
- ポートフォリオへの影響： EndMT関連経路を標的とする候補物質のリスク調整後の優先順位付けおよび推進を支援する。
実施上の検討事項
- 血管内皮細胞の培養および分子解析技術に関する専門知識が必要です。
- 共焦点顕微鏡、定量PCR、および免疫蛍光染色のインフラへのアクセスが必要です。
- 再現性を確保するため、アッセイ条件と測定結果のチーム間での標準化が求められます。
- 異なる血管内皮細胞種や疾患モデルに合わせて、調整が必要な場合があります。
- 制限事項として、in vitroという環境であること、およびin vivoでのEndMTダイナミクスと異なる可能性があることが挙げられます。
