Name: GPC3 ターゲット バイスペシフィック抗体、GPC3 S Fab 強力な細胞毒性を持つ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 学ぶバイスペシフィック抗体GPC3-S-Fabの大腸菌生産法と精製プロトコル。GPC3陽性肝がん細胞に対する強力な細胞傷害活性を評価する方法を解説。がん免疫療法研究に応用可能です。

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この作品は、R & D 計画の広東省 (中国) (2016A050503028) によって財政的に支えられました。

人間の血のコレクションを含むプロシージャをすべては、太陽 Yat Sen 大学倫理委員会で承認されました。
1. GPC3 S 工場デザイン戦略
<ol><li>アンチ GPC3 (ヒト GC3313) を抗 CD16 VHH14 (図 1) の工場にリンクして GPC3 S 工場を設計します。</li>
	<li>合成し、以前に報告された12として pET26b と pET21a のベクトルに VH CH1-CD16 VHH と VL CL のクローンします。</li>
</ol>2. 変換と文化
<ol><li>追加 100 100 VH-CH1-CD16 (図 1 a) を含む pET26b の ng 主務 BL21 の 100 μ L に VL CL (図 1 a) を含む pET21a の ng (DE3) 細胞。よく混ぜると氷 45 90 s、転送、42 ° C の水浴中 30 分加温の上を孵化し、氷上 3-5 分の間孵化させなさい。</li>
	<li>BL21 を含むチューブにホストゲノム スープ (LB) 媒体の 500 μ L を追加 (DE3) 細胞し、37 ° c、45-60 分 150 rpm BL21 の広がる 100 μ L をインキュベーションして (DE3) セル LB 寒天培地プレート含む 50 μ G/ml のカナマイシン、アンピシリンの 100 μ g/mL、12-16 h の 37 ° C で、孵化させなさいと。<ol>
<li>ホストゲノム スープ (LB) メディアの準備: 1 %wt/巻トリプトン、0.5 %wt/巻酵母エキス、1 %wt/巻塩化ナトリウム。</li>
	</ol>
</li>
	<li>一晩 50 μ G/mlカナマイシンの 100 μ g/mL 37 ° c、220 rpm は、アンピシリン、文化を含むスーパー スープ (SB) 培地 5 mL に単一コロニーから細胞を接種します。その後、SB 培 50 μ G/ml のカナマイシン、アンピシリンと 37 ° C、4 h 220 rpm で文化の 100 μ g/mL の 100 mL に文化の 1 mL を接種します。その後、SB 培 50 μ G/ml のカナマイシン、アンピシリンと 37 ° C, 220 rpm で文化の 100 μ g/mL の 1 L に 10 mL の文化を転送します。<ol>
<li>スーパー スープ メディアの準備: 3.2 %wt/巻トリプトン、2 %wt/巻酵母エキス、0.5 %wt/巻塩化ナトリウム。</li>
	</ol>
</li>
	<li>外径600に達する 0.6 - 0.8 は 0.2 mM の最終的な集中にイソプロピル-b-D-チオ-ガラクトピラノシド (IPTG) を追加します。16 ° c、ペリプラズム式の 36-48 時間 180 rpm 文化。</li>
</ol>3. GPC3 S Fab ペリプラズム浄化
<ol><li>ペリプラズム画分調製<ol>
<li>4,000 x g、30 分のための 4 ° C で遠心分離によって細胞を収集、媒体を破棄し、セルの重量を量る。</li>
		<li>冷たいショ糖液 (pH 7.5 トリス-HCl の 20 mM; 25% (重量/巻) ショ糖と 1 mM EDTA の) 細胞の 1 グラムあたり 4 mL を徹底的に細胞を再懸濁し、15 分間氷の上を孵化させなさい。</li>
		<li>遠心分離機 (テーブル トップ遠心分離機、固定角ロータ) 8,500 x g で 4 ° C 20 分清 (ショ糖の割合) を削除、保存氷の上。</li>
		<li>冷たい 5 mM MgCl2 PMSF (グラム セルあたり 4 mL) の 1 mM のミックスでペレットを再懸濁します。グラムあたり、リゾチーム株式 (15 mg/mL) 40 μ L を追加し、氷上で 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>4 ° C、20 分清 (ペリプラズム画分) の転送 8,500 × g (テーブル トップ遠心、固定角ロータ) で遠心し、氷の上保存します。</li>
		<li>氷の上の 50 mL の円錐管に 30 分は上澄みを除去、保存 30,000 × g、4 ° C で遠心し、糖画分およびペリプラズム画分を組み合わせます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ni NTA の親和性の浄化<ol>
<li>均質な懸濁液を達成するため、Ni NTA 寒天新鮮な 15 mL の円錐管に 1 mL を削除および 10 列ボリューム (CV) 平衡バッファーを追加する徹底的に混合することによって Ni NTA agarose の 1 mL を再懸濁します (pH 7.5; トリス塩酸 25 mM 1 M NaCl の) 平衡に。</li>
		<li>5 分 400 x g で遠心し、上清を慎重に削除します。その後、糖画分およびペリプラズム画分を含む 50 mL のチューブに Ni NTA アガロースを追加します。2 h の 4 ° C でロック。</li>
		<li>400 x g で混合物を遠心分離機、4 ° C、5 分は、非連結の一部として別の新鮮な冷たいチューブに上清を慎重に取り外します。重力列に Ni NTA アガロースを転送します。</li>
		<li>10 を追加バッファーを洗浄の CV (pH 7.5; トリス塩酸 25 mM 1 M 塩化ナトリウム; 20 mM、30 mM か 40 mM のイミダゾール) 列、および収集、洗濯分数として想定し, 浸出液に。 注: これらのソリューションは、イミダゾールの濃度の増加の順序で追加する必要があります。</li>
		<li>3 追加溶出の CV バッファー列を (pH 7.5; 300 mM NaCl のトリス塩酸 25 mM; 100 mM、200 mM、300 mM や 400 mM のイミダゾール) と溶出画分 1、2、3、および 4 として、想定し, 浸出液を収集します。 注: これらのソリューションは、イミダゾールの濃度の増加の順序で追加する必要があります。</li>
		<li>透析 2 l PBS (137 mM nacl、KCl、2.7 mM、Na2HPO4KH2PO4、pH 7.4 の 2 mM の 10 mM) の溶出画分 12% GPC3 S 工場の存在を確認 2 のための 4 ° C で透析チューブ (12.4 kDa) を使用して SDS ページし、次にCoomassie 青い染色。</li>
	</ol>
</li>
	<li>IgG CH1 の親和性の浄化<ol>
<li>IgG CH1 の親和性の樹脂の 1 mL を 50 mL の円錐管に転送し、まず PBS とビーズを洗ってください。3.2.6 のステップ後透析液 GPC3 S Fab を追加します。2 h の 4 ° C でロック。</li>
		<li>400 x g で 5 分間遠心、4 ° C慎重に別の新鮮な冷たいチューブに上清を除去し、樹脂を重力列に転送します。</li>
		<li>10 追加洗濯の CV バッファー列を (PBS) と洗浄分数として溶出を収集します。</li>
		<li>1 M トリス pH 9.0 (各溶出画分の mL あたり 0.1 mL) を追加することによって、コレクション チューブを準備します。3 CV 溶出バッファー (pH 2.7 グリシン塩酸 0.1 M) で溶出し、溶出の端数を収集3 回繰り返します。</li>
		<li>透析 2 l 2 のための 4 ° C で透析チューブ (12.4 kDa) を使用して PBS の溶出画分を 2 回繰り返します。</li>
		<li>Ultramicrospectrophotometer によるタンパク質濃度を測定 (分子吸光係数: 91105。 1 A280 = 0.69 mg/L)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. SDS-PAGE および西部のしみが付く分析
<ol><li>5 x SDS 読み込みバッファーにサンプルの 10 μ L を取るし、よく混ぜます。5 分間 100 ° C で蛋白質の混合物を沸かしなさい。<ol>
<li>5 x SDS 読み込みバッファーを準備: トリス-HCl、pH 6.8, 10 %wt/巻 SDS の 250 mM、0.5 %wt/巻ブロモフェノールの青、5% 巻/巻 β-メルカプトエタノール、巻/集グリセリン 50%。</li>
	</ol>
</li>
	<li>前述の26,27,28として読み込みゲル (5%) と分離ゲル (12%) の SDS-PAGE ゲルを準備します。</li>
	<li>ゆで蛋白質の混合物とタンパク質マーカーの 10 μ L を読み込み、SDS のページを実行します。</li>
	<li>Coomassie 鮮やかな青色の溶液に 20 分間揺れでゲルを染色し、染め色を行います。</li>
	<li>PVDF 膜に転送した後、西部のしみの tbst (20 mM トリス-HCl の nacl 0.1% 巻/巻トゥイーン 20 150 mM) 膜をブロック + 5 %wt/巻の揺れながら室温で 1 h のスキムミルクします。</li>
	<li>一次抗体を持つ膜を孵化させなさい (反彼または反フラグ) TBST + 5% スキムミルク 1 h の 1:2,000 を希釈します。</li>
	<li>Tbst、室温で 5 分間洗浄し、3 回繰り返します。</li>
	<li>TBST + 5 %1 h のスキムミルクで希釈した二次抗体 (HRP リンク抗マウス Fc 抗体) 1:2,000 で膜を孵化させなさい。</li>
	<li>Tbst、室温で 5 分間洗浄し、3 回繰り返します。</li>
	<li>映画 1 本あたりの HPR 基板の 1 mL を追加し、開発と画像を撮影。</li>
</ol>5. ゲルろ過分析
<ol><li>次の列を使用する: 列量 24 mL。PBS pH 7.4; の平衡バッファー温帯; ルームで 0.5 mL/min の流速200 μ L のサンプル量。</li>
	<li>次のタンパク質の量と濃度を使用して: 1.2 mg/mL GPC3 S 工場の 500 μ L。30 分 20,000 × g で遠心分離し、ロードに 200 μ L を取る。</li>
	<li>タンパク質マーカーの量と濃度は、1 つの管にシトクロム C の 100 μ L (2 mg/mL、12.4 kDa)、脱水 (3 mg/mL, 29 kDa) の 140 μ L、アルブミン (10 mg/mL、66 kDa) の 140 μ L、200 μ L アルコール脱水素酵素 (5 mg/mL, 150 kDa) を取る。30 分 20,000 × g で遠心分離し、ロードに 200 μ L を取る。</li>
	<li>各実行する前に、少なくとも 2 で洗って 0.5 mL/min の流速で蒸留水の CV。</li>
	<li>少なくとも 2 列を平衡平衡バッファー (PBS、pH 7.4) 0.5 mL/min の流量での CV。</li>
	<li>サンプルをロードする 0.5 mL/min でサンプルを自動的に挿入します。</li>
	<li>0.5 mL/min で平衡バッファーで溶出し、280 と 215 nm で検出します。</li>
</ol>6. 流れのフローサイトメトリー解析
<ol><li>文化、HepG2 (GPC3 陽性)、Hep3B (GPC3 陽性)、Huh7 (GPC3 陽性) および切除例が少ない-97 H (GPC3 負) 細胞 10% 牛胎児血清 (FBS)、(100 μ g/mL)、ペニシリン、ストレプトマイシン (50 μ g/mL) 37 ° c に DMEM 培地を含む 100 mm × 20 mm のプラスチック製の食器5% CO2。</li>
	<li>文化町 (GPC3 負) 細胞と町/gpc3 由来細胞の 10 %fbs、ペニシリン (100 μ g/mL)、37 ° c、5% CO2ストレプトマイシン (50 μ G/ml) と RPMI 1640 媒体を含んでいる 100 mm × 20 mm のプラスチック製の食器で実物大の人間 gpc3 由来 cDNA (GPC3 陽性)。</li>
	<li>25 cm2フラスコ 10 %fbs、ペニシリン (100 μ g/mL)、37 ° c、5% CO2ストレプトマイシン (50 μ G/ml) と RPMI 1640 媒体を含んでいる実物大の人間の CD16 cDNA (CD16 陽性) をかくまっている NK92/CD16 を文化します。</li>
	<li>セルは 70-90% 合流、培地を除去、2 ml の PBS のセルを洗浄します。0.25% トリプシンの 1 mL を追加し、37 ° C で 2-3 分 (またはセルを開始表面からデタッチするまで) で孵化させなさい。トリプシンを中和し、再上下に軽くピペッティングにより細胞を停止する完全な成長培地 1 mL を追加します。</li>
	<li>ノイバウアー検定を使用してセル数をカウントし、トリパン ブルーによる細胞生存率を検出します。</li>
	<li>3 x 106セルの各セルの行を収集します。1 mL の PBS + 0.2 %bsa 再度セルを中断するを追加します。200 × g で遠心分離、4 ° C、5 分 2 回の繰り返し。</li>
	<li>セルを再停止する PBS + 0.2 %bsa の 0.3 mL を追加し、100 μ L (約 100 万) を各 5 mL ポリスチレン丸底チューブに転送します。 注: 氷で、チューブにここからすべての手順を実行する必要があります保たれる寒さを確認してください。細胞表面抗原に抗体をバインドすると、複雑な内面化する開始されます。寒さそれを維持し、プロセスが著しく遅くなります。</li>
	<li>すべてのチューブに一次抗体 (GPC3 S Fab やヒト IgG1、最終濃度 5 μ G/ml) の 10 μ L を追加し、氷上で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>1 mL の PBS を追加 + 0.2 %bsa を 5 分の 4 ° C、200 × g で遠心洗浄を 3 回繰り返します。</li>
	<li>100 μ L の PBS + 0.2 %bsa で再停止し、二次抗体 (抗ひと IgG(H+L) 488、最終濃度 10 μ g/mL) の 0.5 μ L を追加し、注 1 における氷の上を孵化させなさい: このステップから光からセルがください。</li>
	<li>1 mL の PBS を追加 + 0.2 %bsa を 5 分の 4 ° C、200 × g で遠心洗浄を 3 回繰り返します。</li>
	<li>標準プロトコル29によるとフローサイト メーターによる細胞を分析します。488 nm レーザー励起用のセルを取得します。</li>
</ol>7. 細胞毒性の試金
<ol><li>腫瘍細胞を準備します。<ol>
<li>町、切除例が少ない-97 H、Huh7 Hep3B 文化 HepG2 細胞 6.1 6.5 の手順で説明するよう。</li>
		<li>0.5 × 105/mL に細胞を希釈し、100 μ L 細胞 (ウェルあたり 5,000 細胞) 96 ウェルのプレート上にプレートします。セルを添付するように 6 ~ 8 h の文化.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ひと末梢血単核球 (PBMCs) を準備します。<ol>
<li>50 mL の円錐管に PBS の等しいボリュームと新鮮な準備ができて血液を希釈します。たとえば、10 mL を 10 mL の PBS で血液を希釈します。</li>
		<li>新鮮な 50 mL の円錐管にリンパ球分離培地 15 mL を入れます。ゆっくりとチューブ側に沿ってリンパ球分離媒体に希釈血液を転送します。 注意: はチューブを垂直に注意します。リンパ球分離媒体の表面を壊さない。</li>
		<li>オフ ブレーキ部屋の温度で 35 分の 400 × g で遠心分離機します。</li>
		<li>ゆっくりと上部のプラズマ層を削除し、プラズマ リンパ球分離媒体界面 PBMCs を含む白血球層を取る。</li>
		<li>PBS + 2% の二重ボリュームの PBMCs を希釈 FBS。5 分間 400 × g で遠心分離機します。</li>
		<li>PBS + 2% で 2 回細胞を洗う FBS。手順 6.5 で説明したセル数字をカウントして 400 × g で 5 分間遠心します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>NK 細胞を準備します。<ol>
<li>5 x 107セル/mL の PBS + 2 %fbs、場所での濃度の PBMCs 懸濁液の準備に 5 mL ポリスチレン丸底チューブで。</li>
		<li>50 μ L/mL の細胞にヒト NK 細胞濃縮カクテルを追加します。よく混合し 10 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>彼らは一様にピペッティングによって中断されるように NK 細胞濃縮キットとよく混ぜるから、磁性粒子を上下に 5 回以上も精力的に再懸濁します。細胞懸濁液を 100 μ L/mL で再懸濁の磁性粒子を転送します。よく混ぜ、5 分間室温で孵化させなさい。</li>
		<li>PBS + 2% を追加することにより 2.5 mL の容量まで細胞懸濁液をもたらす政府短期証券。優しく上下に 2 - 3 回をピペッティングによりチューブに細胞をミックスします。磁石に (キャップ) なし管を配置します。落ち着く 2.5 分間室温磁気ビーズをしましょう。</li>
		<li>磁石を削除します。1 つの連続的な動きで新しい管に濃縮細胞懸濁液を注いで、チューブを反転します。</li>
		<li>6.5 の手順で説明されているように細胞数をカウントします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞傷害性の反応を設定します。<ol>
<li>5 × 105セル/mL に対応する培養培地を使用して NK 細胞を希釈します。96 ウェル プレートにメッキ腫瘍細胞に NK 細胞懸濁液 100 μ L を追加します。</li>
		<li>30 μ g/mL、3 倍希釈、9 ポイント (3 つレプリケートします) の最終的な集中に最高用量と異なる濃度で GPC3 S 工場の 10 μ L を追加します。</li>
		<li>37 ° c、5% CO2 72 時間インキュベートします。</li>
		<li>培養 72 時間後、培地を取り除き、CCK8 試薬を各ウェルの 96 ウェル プレートでの 10 μ L を含む DMEM 培地を 100 μ l 添加し、37 ° c. で孵化し</li>
		<li>プレートが 450 nm で 1、2、3、および 4 h CCK8 試薬を追加した後。</li>
		<li>データを分析します。(OD450 GPC3 S Fab + エフェクター + 腫瘍- OD450媒体) として生存率を計算する/(OD450腫瘍- OD450媒体) × 100%、(OD450 GPC3 S Fab + 腫瘍- OD450中)/(OD450腫瘍-OD450媒体) × 100%。エフェクター細胞は、NK 細胞です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

本研究で提案する bsAbs の書式を新規作成するための戦略 GPC3-S-ファブをターゲットに GPC3 陽性腫瘍細胞 NK 細胞を募集することができます。S 工場はすてきな自然に基づいて抗 CD16 VHH11,12を追加することによって形式。BsAbs 含む Fc 領域と比べると、GPC3 S Fab 簡単に大規模な細菌のペリプラズムで製造することができます。
プロトコルで説明されている発現と精製方法を使用すると、機能的な可溶性 GPC3-S-ファブ大量に得た。ペリプラズム発現を促進する、信号シーケンス pelB大腸菌17ペリプラズムに分泌を直接に N 末端に追加されました。細胞質とは対照的細胞と外側の膜の間ペリプラズム空間におけるより酸化環境タンパク質フォールディングとアセンブリのいくつかの重要な蛋白質が装備され従って訂正フォールディングを促進して16</s...

モノクローナル抗体はがん治療1今広く使用されています。抗体の柔軟性のため様々 な抗体基づかせていたフォーマットを積極的に検討しています。BsAbs は、モノクローナル抗体と比較して、2 つの異なるターゲット同時にかつ効率的にトリガーをターゲットし、腫瘍細胞2を殺す免疫エフェクター細胞の募集を認識し、それらを有効にする 2 つの異なる抗原結合モジュールがあります。
現在の組換え bsAb 形式は一般的に 2 つのクラスを割り当てることができます: Fc 含む bsAbs と Fc 領域なし bsAbs。主に哺乳類細胞で生成される Fc 含む形式と比較して、bsAbs なし Fc 領域より小さいサイズの利点がある微生物式システムでより容易に作り出される、腫瘍組織をより効率的に浸透することができます3。
Fc 領域なし bsAbs 一般的単一鎖可変断片 (scFvs) や Fab3などの個々 のバインディング部分をリンクすることによって形成されています。安定ドメインなし bsAbs scFv フラグメントに基づいて、多くの場合は熱安定性、低溶解度、または集計4、5の増加の可能性が侵害します。対照的に、工場ベース bsAbs はネイティブの Fab 部位4,6CH1 と CL の heterodimerization によるより安定しています。
重鎖だけ抗体 (VHHs、単一ドメイン抗体とも呼ばれます) から可変ドメインは、自然の重鎖抗体7のアクティブな抗原結合フラグメントです。VHHs 細菌の表現9に従来の Igg8、低免疫原性、高収率の特異性、親和性が高い特性があります。VHHs Fv 断片と比較して、高い熱安定性10があります。VHHs Fab 部分と比べると、CH1 と CL の不足のための小さいサイズがあります。したがって、S ・ Fab、単一ドメイン抗体、VHH、Fab をリンクすることによって得られる bsAb 形式を設計、その抗腫瘍効果11,12を勉強します。
本研究では抗 CD16a VHH14 hGC3313のファブをリンクすることにより GPC3 S 工場の建設が記述されていた。GPC3 S 工場は、エシェリヒア属大腸菌 (E. 大腸菌)のペリプラズム式で効率よく製作できます。GPC3 S 工場の機能調査は、GPC3 S Fab が肝臓癌療法のための有望な戦略であることを提案しました。したがって、簡単な生産と精製より安定した bsAbs 以前の研究に適用可能な参照を持つ代替技術上 GPC3 S 工場の利点があります。
哺乳類発現系と prokaryotic 表現システムは、BsAbs のさまざまな形式を表現するために使用されています。哺乳動物発現システム、大腸菌とは異なり-ベースのタンパク質発現系高収量、低コスト ・省力化、遺伝子操作と高変換効率15の容易さなど多くの利点があります。BsAbsエシェリヒア属大腸菌で、式の 2 つの基本的な戦略があります: 細胞質と細胞質と細胞膜の外側15ペリプラズムに式で表現します。細胞質の還元環境と比較して、ペリプラズムより酸化のフォールディングを促進する環境と共発現タンパク質16の。正しい折りたたみ bsAbs の溶解性、安定性、機能の生成に重要な役割を果たしています。したがって、信号シーケンス pelB はエシェリヒア属大腸菌の17のペリプラズムに分泌を直接に S 工場の N 末端に追加されました。確保するために、折りたたみ、溶解性、熱安定性、構造安定性、複雑さと抗体のサイズを減らすことは正しい頻繁16が採用。S ・ Fab 形式は 1 つの Fab と 1 つ VHH、小型、シンプルな構造により可能性のある細菌のシステムで非常によく表現されるから成っています。
GPC3 は、GPC3 S Fab バイスペシフィック抗体形式で選ばれました。グリピカン 3 (GPC3) 一種 (GPI)18を介して細胞表面に固定されているヘパリン硫酸 (HS) プロテオグリカン家族のメンバーであります。Gpc3 由来は肝臓癌19,20,21,22の大部分を占める肝細胞癌 (HCC) の場合の 70% の発現です。Gpc3 由来がほとんど表されるので正常組織には、gpc3 由来は肝細胞癌に対する潜在的なターゲットとして提案されています。GPC3 に対して複数のマウスのモノクローナル抗体を生産されています。GC33 のみ展示限定の抗腫瘍活性22, し、それは患者の臨床効果を示すことに失敗しました。本研究では GPC3 S 工場は14gpc3 由来腫瘍の細胞を殺す NK 細胞を募集できるように示されました。
NK 細胞を募集、抗 CD16 VHH を使用しました。CD16a は、低親和性 IgG 受容体、ナチュラル キラー (NK) 細胞、マクロファージ、単球、T 細胞のいくつかのサブタイプに主に表現されます。NK 細胞23細胞抗体依存性細胞傷害 (ADCC) にかかわる。ヒト NK 細胞は、CD56 の 2 種類に分類できます - CD16 + と CD56 + CD16-。CD56 + CD16− NK 細胞、CD56 と対照をなして-CD16 + NK 細胞はパーフォリンおよびグランザイム B の高いレベルを解放でき、したがって24強い細胞毒性を提示します。CD16a を表現するクッパー細胞 (KCs) は、肝マクロファージです。クッパー細胞は、肝臓癌25の抑制に重要な役割を果たします。したがって、ターゲット CD16a bsAbs より魅力的な肝臓がんに対する T 細胞より有望な戦略があります。

<table><tbody><tr><td>振とうインキュベーター</td><td>サーモフィッシャー</td><td>MAXQ 4000</td><td></td></tr><tr><td>振とうインキュベーター</td><td>Zhicheng</td><td>ZWYR-D2402</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離</td>機 <td>Cence</td><td>GL-10MD</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>Avanti j-26S XPI</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>紫外線分光光度計</td><td>サーモフィッシャー</td><td>Nanodrop</td><td></td></tr><tr><td>分析用ポリアクリルアミドゲル電気泳動装置</td><td>Mini-PROTEAN&reg;テトラ</td>・<td>バイオ・ラッド</td><td></td></tr><tr><td>トランスブロット装置</td><td>Criterion</td><td>Bio-rad</td><td></td></tr><tr><td>イメージングシステム</td><td>Bio-rad</td><td>chemidoc tm XRS+</td><td></td></tr><tr><td>Fast Protein 液体クロマトグラム</td><td>GE Healthcare AKTA</td><td>avant</td><td></td></tr><tr><td>GF column</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>FC500</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5702R</td><td></td></tr><tr><td>エンビジョンプレートリーダー</td><td>TECAN</td><td>Infinite F50</td><td></td></tr><tr><td>アンチHisタグ</td><td>eBioscience</td><td>14-6657-82</td><td></td></tr><tr><td>アンチフラッグタグ</td><td>Σ</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>アンチヒューマン(H&L)-488</td><td>A11013</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス IgG HRP リンク抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA-Agarose</td><td>Tribioscience</td><td>TBS9202-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG-CH1 アフィニティー樹脂</td><td>サーモフィッシャー</td><td>194320005</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>NK cell enrichment kit</td><td>Stemcell</td><td>19055</td><td></td></tr><tr><td>マグネット</td><td>ステムセル</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>CCK8 キット</td><td>同人堂</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ギブコ</td><td>C11995500CP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>ギブコ</td><td>C11875500CP</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>シグマ</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>ギブコ</td><td>15050-057</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>標準マーカー</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MWGF200</td><td>ゲルろ過</td></tr><tr><td>イソプロピル-b-D-チオ-ガラクトピラノシド (IPTG)</td><td>VWR 化学薬品</td><td>VWRC0487-100G</td><td></td></tr><tr><td>透析チューブ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0655-100FT</td><td></td></tr><tr><td>クナナマイシン</td><td>VWR</td><td>VWRC0408-100G</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>VWR</td><td>VWRC0339-100G</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>サーモフィッシャー</td><td>LP0021B</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>サンゴンバイオテクノロジー A100241</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリズマベース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T6791-1KG</td><td></td></tr><tr><td>シ</td><td>グマアルドリッチ</td><td>V900106</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>アラジン</td><td>A110752-500g</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>アラジン</td><td>P112134-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>V900020</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>サンゴン バイオテクノロジー</td><td>A505255-0250</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム、一塩基性無水物 (KH2PO4)</td> <td>VWR</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム、二塩基性、無水 (Na2HPO4)</td> <td>VWR</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>VWR</td><td>60-24-2</td><td></td></tr><tr><td>フェニルメチルスルホニルフッ化物 (PMSF)</td> <td>VWR</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>Sigma アルドリッチ</td><td>L6876-25G</td><td></td></tr><tr><td>クーマシー ブリリアントブルー R250</td><td>VWR</td><td>VWRC0472-50G</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>サンゴンバイオテック</td><td>A500922-25G</td><td></td></tr><tr><td>牛血清アルブミン (BSA)</td><td>VWR</td><td>VWRC0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Σ Aldrich</td><td>V900122</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 20mm プラスチック皿</td><td>コーニング</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 フラスコ</td><td>コーニング</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル 細胞培養クラスター</td><td>コーニング</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>サンゴン バイオテック</td><td>A610498-0005</td><td></td></tr><tr><td>CHO</td><td>中国科学院のタイプカルチャーコレクション</td><td>GNHa 3</td><td></td></tr><tr><td>MHCC-97H</td><td>中国科学院のタイプカルチャーコレクション</td><td>SCSP-528</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>中国科学院のタイプカルチャーコレクション</td><td>TCHu 72</td><td></td></tr><tr><td>Huh7</td><td>中国科学院のタイプカルチャーコレクション</td><td>TCHu182</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B</td><td>中国科学院のタイプカルチャーコレクション</td><td>TCHu106</td><td></td></tr><tr><td>NK92</td><td>ATCC</td><td>CRL2408</td><td></td></tr></tbody></table>

gpc3 ターゲット バイスペシフィック抗体、gpc3 s fab 強力な細胞毒性を持つ

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

このプロトコルでは、建設、バイスペシフィック抗体 (bsAb) GPC3 S 工場の機能性研究をについて説明します。bsAbs は彼らの 2 つの異なる腕を介して 2 つの異なるエピトープを認識できます。bsAbs を積極的に直接腫瘍細胞を殺すために免疫細胞を募集する能力について研究されています。現在、bsAbs の大半は Fc 含む bsAbs または Fc 領域なし小さい bsAb デリバティブとして組換え蛋白の形で生産されています。本研究では GPC3-S-ファブ、抗体フラグメント (Fab) に基づいてバイスペシフィック抗体は抗 gpc3 由来抗体 GC33 抗 CD16 単一ドメイン抗体の Fab をリンクによって設計されました。GPC3 S 工場は、大腸菌で発現し、2 つの親和性クロマトグラフィーで精製できます。精製 GPC3 S 工場は具体的にバインドし、肝臓癌治療における GPC3 S 工場の潜在的なアプリケーションを示唆しているナチュラル キラー細胞を募集して GPC3 陽性肝癌細胞を殺します。

GPC3 S 工場浄化
GPC3 S 工場から精製した大腸菌2 段階アフィニ ティー精製で最初 Ni-国税庁-アガロース、IgG CH1 の親和性の浄化が続くと.2 段階の親和性の浄化後 GPC3 S 工場は 1:1 (図 2 a) に近い 2 つのチェーンとの同質性を精製しました。VH CH1 CD16 VHH と VL CL ポリペプチドの存在は、別個の C 末端タグで識別できる反彼 VL CL 約 25 kDa と反フラグ VH-CH1-VHH 約 38 kDa (図 2 b)。2 段階の親和性の浄化後 ~1.2 mg タンパク質は SB 文化の 1 L から入手できます。さらに精製 GPC3 S Fab を特徴付ける、ゲルろ過を行った。標準的なマーカー (<strong cl...

紹介でバイスペシフィック抗体 GPC3 S Fab プロトコル大腸菌。精製 GPC3 S Fab GPC3 陽性肝癌細胞に対して強力な細胞毒性があります。

GPC3 ターゲット バイスペシフィック抗体、GPC3 S Fab 強力な細胞毒性を持つ

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

この方法は、細菌で二重特異性抗体を産生する方法や精製された抗体の機能を決定する方法など、二重特異性抗体分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、GPC3-S-Fabを大腸菌から簡単に製造および精製できることです。ペリプラズム画分を調製するには、まず細胞懸濁液を4,000gで摂氏4度で30分間遠心分離します。次に、培地を排出し、細胞の重量を量ります。遠心分離後、細胞ペレットを細胞1グラムあたり4ミリリットルの氷冷ショ糖溶液に溶解します。細胞懸濁液を氷上で15分間インキュベートします。15分後、細胞懸濁液を8,500gで摂氏4度で20分間遠心分離する。次に、ショ糖画分を含む上清をピペットで取り出し、氷上に保存します。細胞ペレットを5ミリモル塩化マグネシウムと1ミリモルPMSFの氷冷混合物に再懸濁します。次に、リソソームストックのミリリットルあたり15ミリグラムの40マイクロリットルを細胞懸濁液に加えます。リソソームストックを添加した後、細胞懸濁液を氷上に30分間放置します。インキュベーション期間が終了したら、ショ糖とペリプラズム画分を組み合わせます。次に、ショ糖 - ペリプラスプラス画分を30, 000gで摂氏4度で30分間遠心分離する。遠心分離が終了したら、上清を氷上の50ミリリットルの円錐形チューブに移します。次に、1ミリリットルのニッケルNTAアガロースを上清と混合して再懸濁し、均質な懸濁液を得て、次に1ミリリットルのニッケルNTAアガロースを新しい15ミリリットルの円錐管に含みます。アガロースに、平衡化バッファーの10カラム容量を加えます。次に、アガロースを400 gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を慎重に取り除き、ニッケル-NTAアガロースをショ糖-ペリプラスプラス画分に加えます。次に、ショ糖-ペリプラズムフラクション含有チューブを摂氏4度で2時間揺さぶる。再び、混合物を遠心分離します。次に、上清を新しい氷冷チューブに慎重に取り除きます。上清を移した後、重力カラムにニッケルNTAアガロースを加えます。次に、3カラム容量の溶出バッファーをカラムに加えます。次に、溶出液をそれぞれ溶出画分1、2、3、4として回収します。96ウェルプレートの各ウェルで100マイクロリットルの5, 000個の細胞を希釈し、播種します。プレートを摂氏37度で6〜8時間インキュベートして取り付けます。PBMCを調製するには、まず、調製したばかりの血液を等量のリン酸緩衝生理食塩水で50ミリリットルの円錐形チューブで希釈します。15ミリリットルのリンパ球分離培地を新鮮な50ミリリットルの円錐管にピペットで入れます。次に、希釈した血液をチューブの壁に沿ってリンパ球分離培地に慎重に移します。ブレーキをオフにした状態で、細胞を400 gで室温で35分間遠心分離します。遠心分離後、上部のプラズマ層を慎重に引き出します。次に、PBMCを含む白血球層をピペットで移し、得られたPBMCを2倍の量のリン酸緩衝生理食塩水で希釈し、2%ウシ胎児血清で希釈します。次に、PBMC懸濁液を遠心分離します。細胞ペレットを2%ウシ胎児血清を含むリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、再度遠心分離します。遠心分離後、細胞数を数えます。ナチュラルキラー細胞を調製するには、PBMCをリン酸緩衝生理食塩水で2%ウシ胎児生理食塩水で再構成します。次に、混合物をポリスチレン丸底チューブに移します。ナチュラルキラー細胞濃縮カクテル1ミリリットルあたり50マイクロリットルをPBMC混合物に加える。内容物を混ぜ合わせ、チューブを10分間放置します。次に、濃縮カクテルに存在する磁性粒子を複数回ピペッティングして再懸濁し、混合し、粒子が均一に懸濁されるようにします。次に、磁性粒子1ミリリットルあたり100マイクロリットルを細胞懸濁液に加えます。細胞懸濁液磁性粒子を混合し、室温で5分間インキュベートします。5分後、2.5ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水と2%ウシ胎児血清を細胞懸濁液に加えます。2〜3回静かにピペットで動かして、チューブ内の細胞を混合します。チューブを磁石に置き、磁気ビーズを室温で2.5分間落ち着かせます。次に、1回の操作でチューブを反転させ、濃縮された細胞懸濁液を新しいチューブに注ぎます。もう一度、セルの数を数えます。カウントが終了したら、ナチュラルキラー細胞を培地で希釈します。次に、100マイクロリットルの細胞懸濁液を、96ウェルプレートに播種した腫瘍細胞に加えます。細胞毒性アッセイをセットアップするには、10マイクロリットルの異なる濃度のGPC3-S-Fab抗体を96ウェルプレートに加えます。次に、プレートを摂氏37度で72時間インキュベートします。指定されたインキュベーション時間後、培地を吸引します。次に、10マイクロリットルのCCK試薬を含む100マイクロリットルのDMEM培地を96ウェルプレートの各ウェルに加えます。再び、プレートを摂氏37度でインキュベートします。インキュベーション後、CCK8試薬の添加後4時間後まで、連続して1時間ごとに450ナノメートルでプレートを読み取ります。GPC3-S-Fab抗体は、2段階のアフィニティー精製を用いて精製します。ここで、2つのパネルは、抗体がそれぞれnickel-NTAアガロースおよびIgG-CH1アフィニティー精製カラムを使用して精製されることを示しています。次に、GPC3-S-Fab抗体の結合親和性をGPC3陽性および陰性のがん細胞株を用いて評価します。GPC3-S-Fabは、Hep3B、Huh7、Hep2G、CHO/GPC3など、すべてのGPC3陽性細胞に結合します。興味深いことに、MHCC-97HやCHOなどのGPC3陰性細胞を使用した場合、結合はまったくまたは最小限にしか観察されません。GPC3-S-Fabの細胞毒性は、新鮮なナチュラルキラー細胞とインキュベートした腫瘍細胞の存在下でも研究されています。抗体GPC3-S-Fabは、ナチュラルキラー細胞の存在下で、HepG2、Hep3B、およびHuh7の7つの細胞に対して強い細胞毒性を発現します。しかし、MHCC-97H細胞上にナチュラルキラー細胞が存在しないと、そのような細胞毒性は観察されません。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば6時間で完了します。この手順を試みるときは、ステップを氷の上に保つことを忘れないでください。この手順に続いて、生体内の腫瘍効果のように、追加の質問に答えるために、異種移植片モデリングなどの他の方法を実行できます。その開発後、この技術は、二重特異性抗体の分野の研究者がin vitroで抗腫瘍効果を探求する道を開きました。このビデオを見れば、腫瘍細胞を標的とする機能的な二重特異性抗体の作製方法、特にNK細胞の単離について十分に理解できるはずです。

a-gpc3-targeting-bispecific-antibody-gpc3-s-fab-with-potent

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

特定の細胞を他の細胞を傷つけずに除去することは、特に確立された組織において非常に困難ですが、組織工学の分野では細胞除去法が緊急に必要とされています。ここでは、近赤外光免疫療法(NIR-PIT)を用いて、混合3D細胞培養から特定の細胞を除去する方法を紹介します。...

近赤外Photoimmunotherapy法を用いた混合3D文化からの選択的な細胞除去

液体および固形腫瘍細胞を標的とするキメラ抗原受容体T細胞の効力を評価する定量的なインビトロ細胞質アッセイシステムを説明する。このプロトコルは、他の免疫エフェクター細胞、ならびに組み合わせ治療を評価するために拡張することができる。...

固体および造形癌細胞を標的とするキメラ抗原受容体T細胞のリアルタイム効力アッセイ

本研究では、サリドマイド類似体の標的であるE3ユビキチン・リゲス・セレブロン(CRBN)のユビキチン化および分解を誘導する新規アプローチとして、ポマリドマイドベースの二機能ホモ-PROTACの合成と特徴付けについて述べている。...

ポマリドマイドベースのホモ・プロタクによるE3ユビキチン・リゲス・セレブロンの化学的不活性化

抗原ペプチドおよびFc-III模倣体(DCAF)の二重機能コンジュゲートの開発は、有害な抗体の排除のために新規である。ここでは、デングウイルス感染時に抗体依存性増強効果を排除するために4G2抗体を選択的にブロックできるDCAF1分子の合成に関する詳細なプロトコルについて説明する。...

抗原ペプチドとFc-III模倣体(DCAF)の二重機能コンジュゲートによる標的抗体遮断

ここでは、マウス腫瘍異種移植片モデルにおける抗体のin...

標的抗原特異的治療抗体の腫瘍と組織分布の分析

ここでは、抗腫瘍効果とT細胞関与二重特異性抗体のメカニズムを評価する研究において、腫瘍への二重特異性抗体誘導性T細胞輸送の in vivo 追跡を容易にするために、ルシフェラーゼでヒトT細胞を形質導入する方法について説明します。...

ルシフェラーゼ形質導入ヒトT細胞を用いた二重特異性抗体誘導性T細胞輸送の追跡(英語)

このプロトコルは、治療用抗HER-2抗体の存在下でナチュラルキラー細胞媒介性乳がん細胞死滅を調節する化合物を同定するための自動化された画像ベースのハイスループット技術を提示します。...

抗体依存性細胞傷害修飾化合物の同定のためのハイコンテントスクリーニングアッセイ(英語)

本稿では、抗腫瘍抗体の重要ながん細胞死滅機構であるADCC機構を調節する化合物を同定する方法について紹介する。NK細胞の細胞毒性効果は、トラスツズマブの存在下で乳がん細胞スフェロイドで測定されます。画像解析により、スフェロイドの生細胞と死細胞、および標的細胞が同定されます。...

腫瘍スフェロイドモデルにおける抗体依存性細胞傷害性の定量化:創薬への応用

ここでは、ヒトiPS細胞由来のキメラ抗原受容体(CAR)を発現するナチュラルキラー細胞を分化・増殖させ、様々な悪性腫瘍に対する死傷性を向上させる方法を紹介します。このプロトコールは、ナチュラルキラー(NK)に最適化されたiPS細胞由来CAR-NK細胞の分化と増殖、およびさまざまな腫瘍細胞株に対する抗腫瘍活性の測定を示しています。...

ヒト人工多能性幹細胞由来キメラ抗原受容体発現ナチュラルキラー細胞の進歩

ここでは、1つのT細胞とがん標的細胞を内包したダブルエマルジョン液滴を作製し、細胞死を1細胞レベルで調べる方法について述べる。この方法により、大規模なT細胞集団内の細胞傷害性分子と標的細胞のアポトーシスの両方を二重に定量できます。...

キメラ抗原受容体T細胞を単一細胞レベルで評価するための液滴ベースの細胞毒性アッセイ

学ぶバイスペシフィック抗体GPC3-S-Fabの大腸菌生産法と精製プロトコル。GPC3陽性肝がん細胞に対する強力な細胞傷害活性を評価する方法を解説。がん免疫療法研究に応用可能です。

GPC3 ターゲットバイスペシフィック抗体、GPC3 S Fab 強力な細胞毒性を持つ

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