Name: A11 肯定的なアミロイド β オリゴマーの合成と評価を使用してドットのしみが付く分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 学ぶ Aβオリゴマーの合成とドットブロット解析による評価法。シンプルで再現性の高いこの神経薬理学的プロトコルは、アルツハイマー病研究における治療薬候補の探索に不可欠です。

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この作品は、国家自然科学基金、中国の (U1503223、81673407、21475131)、浙江省の非営利技術 (2016 C 37110)、寧波国際科学技術に関する応用研究プロジェクトからの補助金によって支えられました。協力プロジェクト (2014 D 10019)、生命科学と健康 (2015 C 110026)、寧波科学技術プロジェクト共通の富 (2017 C 50042) オフイオチューカンあご・ ケネス ・李海洋バイオ医薬品開発基金李 Dak 合計イップ ・寧波市革新チーム・寧波大学 k. c. ウォン マグナ基金。

1. ソリューションの準備
注: は、試薬ソースの材料表を参照してください。
<ol><li>5% ウシ血清アルブミン (BSA) ソリューションを準備するには、二重蒸留水 100 mL に BSA の 5 g を追加します。ボルテックスによってそれらを完全にミックスします。1 ヶ月の 4 ° C でソリューションを保存します。</li>
	<li>5 %bsa 溶液 10 mL に抗体原液の 10 μ L の追加によって反オリゴマー抗体 A11 溶液 (1:1, 000) を準備します。ボルテックスによってそれらを完全にミックスします。1 ヶ月の 4 ° C でソリューションを保存します。</li>
	<li>抗 a β 抗体 6E10 溶液 (1:1, 000) を準備するには、5 %bsa 溶液 10 mL に抗体原液の 10 μ L を追加します。ボルテックスでは、完全にそれらをミックスします。1 ヶ月の 4 ° C でソリューションを保存します。</li>
	<li>アンチ維オリゴマー抗体 OC 溶液 (1:1, 000) を準備するには、5 %bsa 溶液 10 mL に抗体原液の 10 μ L を追加します。ボルテックスでは、完全にそれらをミックスします。1 ヶ月の 4 ° C でソリューションを保存します。</li>
	<li>二重蒸留水 1,000 mL に 24 g のトリス基地と NaCl の 88 g を追加することによって、含有トリス緩衝生理食塩水 (TBS) 原液を準備します。7.4 に pH を調整します。3 ヵ月 4 ° C でソリューションを保存します。</li>
	<li>準備トリス緩衝生理食塩水とトゥイーン 20 (TBST) ソリューション Tween 20 1 mL を 100 mL の TBS に追加することによって在庫ソリューションと 900 mL ダブル蒸留水。</li>
	<li>わさびの 10 μ L 追加ペルオキシダーゼ (HRP) ヤギ抗うさぎ IgG (H + L) TBST 溶液 10 mL に二次抗体溶液を準備します。ボルテックスによってそれらを完全にミックスします。1 ヶ月の 4 ° C でソリューションを保存します。</li>
	<li>ジメチルスルホキシド (DMSO) 10 mM クルクミン在庫ソリューションを形成するための 1 つの mL でクルクミンの 3.68 g を溶解します。</li>
	<li>2 mL の 1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール (HFIP) 2.5 Mg/ml と a β の単量体ソリューションを形成するのに合成 a β1-42の 5 mg を溶解します。室温 (25 ° C) で 20 分、100 μ 因数の配置し、-20 ° C で 6 ヶ月保存します。 注: この手順をできるだけ速く実行する必要があります。ピペット チップは、正確なピペッティングを確実に切断する必要があります。</li>
	<li>1:1 の容積比で ECL 流体 A と B を混ぜて電気化学発光 (ECL) 液を準備します。このソリューションは、使用直前準備する必要があります。</li>
</ol>2. サンプル準備
注: は、ブロッティング解析ドットの前に 2 日間サンプル準備を実行します。
<ol><li>A β1-42モノマー溶液のチューブに二重蒸留水の 900 μ L を追加します。a β1-42の濃度は 0.25 mg/mL になります。20 分間室温で混合物を配置します。</li>
	<li>その量は約 850 μ L まで高純度の窒素ガスでソリューションを蒸発させます。A β1-42溶液の濃度は、0.29 mg/mL になります。 注: ソリューションを随時で動揺して、HFIP が完全に蒸発することを確認する必要があります。通常、蒸発の 30 分後に残液量は約 850 μ L です。</li>
	<li>二重蒸留水でクルクミン作業ソリューション (0.2 2 μ M) にクルクミン原液を希釈します。A β1-42のソリューションとクルクミン作業ソリューション 1:1 の容積比で混ぜます。クルクミンの最終濃度は、0.1 と 1 μ M になります。 注: 必要な場合任意の割合で a β1-42のソリューションの潜在的なオリゴマー阻害剤に混在できます。</li>
	<li>磁気攪拌機でソリューションを継続的に振る (材料の表を参照してください)。<ol>
<li>磁気攪拌機にプラスティック ボックスを修正します。場所 2 磁気は 2 ボックスのコーナーでバーをかき混ぜるし、ボックスの中央にサンプル チューブを置きます。</li>
		<li>48 時間室温 (25 ° C) でボックスを振る。 注: 磁気攪拌機の速度は約 60 rpm です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 ° C で 15 分間チューブを遠心し、18,000 x g. 収集上清。</li>
</ol>3. ドットのしみが付く分析
注: すべての孵化は水平シェーカーで行われます。
<ol><li>硝酸セルロースの膜は、1 cm 幅の短冊状にカットします。 注: 硝酸セルロースの膜の幅は、実験のニーズに応じて調整できます。</li>
	<li>2 ストリップ (ストリップ 1 と 2) 各ポイント間隔 0.5 cm に 2 μ L のサンプルを均等に配置します。</li>
	<li>バンドに液滴が乾くまで、5 分間室温でストリップを配置します。</li>
	<li>室温で 30 分間 5 %bsa 溶液によるストリップを孵化させなさい。</li>
	<li>室温で 5 分間 TBST ソリューションとストリップをすすいでください。</li>
	<li>TBST ソリューションを吸い出しなさい。室温で 1 時間インキュベート ストリップ 1 反オリゴマー抗体 A11 ソリューションとストリップ抗 a β 抗体 6E10 ソリューションと 2。</li>
	<li>3 回部屋の温度で 5 分間ずつ TBST ソリューションとストリップをすすいでください。</li>
	<li>TBST ソリューションを吸い出しなさい。室温で 40 分間二次抗体溶液でストリップを孵化させなさい。</li>
	<li>3 回部屋の温度で 5 分間ずつ TBST ソリューションとストリップをすすいでください。</li>
	<li>ストリップの表面に混合の ECL 流体を均等に適用されます。イメージング システム自動発光でストリップを公開 (材料の表を参照してください)。 注: 通常、300 μ L の ECL 流体膜 1 つのための十分です。膜は、露光中に湿った保たれなければなりません。露出時間は、イメージング システムによって自動的に計算されます。</li>
	<li>半定量的な結果を取得する ImageJ (健康の国民の協会) または別の画像処理ソフトウェアを使用してグレースケール分析を行います。</li>
</ol>

<ol><li>Lauren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+prion+protein+as+a+therapeutic+target+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).</li>
<li>De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/biophysj/comments/S0006-3495(16)33411-7">Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70.</a> Biophysical Journal. 112 (3), 444(2017).</li>
<li>Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Alzheimer%27s+beta-amyloid+peptides+with+cholesterol%3A+mechanistic+insights+into+amyloid+pore+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation.</a> Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).</li>
<li>Xiang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucoxanthin+inhibits+beta-amyloid+assembly+and+attenuates+beta-amyloid+oligomer-induced+cognitive+impairments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+beta-amyloid-induced+synaptic+and+memory+impairments+via+altering+beta-amyloid+assembly+by+bis%28heptyl%29-cognitin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin.</a> Scientific Reports. 5, 10256(2015).</li>
<li>Yam, G. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+amyloid+aggregate+forming+ability+of+TGFBI+mutants+that+cause+corneal+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).</li>
<li>Tomaselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alpha-to-beta+conformational+transition+of+Alzheimer%27s+A+beta-%281-42%29+peptide+in+aqueous+media+is+reversible%3A+A+step+by+step+conformational+analysis+suggests+the+location+of+beta+conformation+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding.</a> ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).</li>
<li>Shigemitsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+evidence+for+the+dimer+formation+of+beta+amyloid+peptide+1-42+in+1%2C1%2C1%2C3%2C3%2C3-hexafluoro-2-propanol%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.</a> Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).</li>
<li>Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoroalcohols-induced+modulation+and+amyloid+formation+in+conalbumin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).</li>
<li>Fang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hydroxycyclopenicillone%2C+a+new+beta-amyloid+fibrillization+inhibitor+from+a+sponge-derived+fungus+trichoderma+sp+HPQJ-34%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34.</a> Marine Drugs. 15 (8), 260(2017).</li>
<li>Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinacoside+ameliorates+the+memory+impairment+and+cholinergic+deficit+induced+by+amyloid+beta+peptides+via+the+inhibition+of+amyloid+deposition+and+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology.</a> Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).</li>
</ol>

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このプロトコルでは a β1-42のオリゴマーを含む試料を準備する分析をしみが付くことのドットで A11 正 a β1-42のオリゴマーの量を分析する方法を報告しています。A β1-42オリゴマーの豊富なサンプルの準備のための私たちの方法はかなりシンプルで、信頼性と再現性のある、まだ気づかれるべきいくつかのポイントがあります。まず、HFIP、合成 a β1-42ペプチドを溶解するために使用されます。集計の a β1-42ペプチドを HFIP ソリューション中のモノマーに分解することができます。しかし、HFIP は揮発しやすい、HFIP の粘度が非常に低い。したがって、HFIP に a β1-42ペプチドを溶解する必要があります、HFIP ソリューションは検体操作中に HFIP の潜在的な損失を減らすためにできるだけ早くする必要があります。また、ピペット チップをこの手順で正確な分注を確実に遮断。第二に、純度の高い窒素ガスを使用して、ソリューションから HFIP を蒸発します。この中に、a β1-4...

アルツハイマー病 (AD) は、高齢者の世界的な1に影響を与える最も重要な神経変性疾患の一つです。Β アミロイド (a β) の異常凝集が広告の主要な病理要因かもしれないことが広く受け入れられます。A β の凝集体は、老人斑、AD 患者の脳の生物学的マーカーの 1 つの主要なコンポーネントです。さらに、特に、オリゴマーを含めて、a β の集計は、AD の進行性神経細胞死の原因かもしれない強力な毒性を作成します。したがって、a β オリゴマー形成の抑制、神経変性を妨げる可能性し、a β オリゴマー阻害剤は、疾患修飾として開発される可能性 AD の治療。多くの研究は、オリゴマー体外を形成、人工の a β オリゴマーの構造と形態を探検し、調査を使用して生体外モデル2,3 a β オリゴマーの阻害剤を合成 a β ペプチドを使用しています。,4します。 しかし、a β オリゴマー形成プロトコル別の in vitroの異なる研究グループ間で比類のない結果が生じる別の形態学的特性を持つオリゴマーに 。したがって、a β オリゴマーの形成の標準的なプロトコルが急務します。
今までは、a β オリゴマーが直接検出することがない多くの方法を報告されています。透過電子顕微鏡 (TEM)、非変性ゲル電気泳動法、酵素免疫測定法 (ELISA) と分析にしみが付く点は、量および/または a β オリゴマー体外5,の形態を検討する使用ことができます。6。 形態と a β オリゴマー構造を TEM で観察するたとえば、します。相対的な量、a β の集計の分子サイズは、非変性ゲル電気泳動法によって測定できます。Elisa 法は、血清、血漿、脳組織からの抽出物で a β オリゴマーを決定する使用できます。最後に、ドット解析技術で検出すると、しみが付くことを分析して、タンパク質の同定に使えるオリゴマーおよび a β に固有の抗体の助けを借りて、異なるサンプル a β オリゴマーの相対濃度を評価します。また、試金を吸い取りドット ゲル電気泳動およびゲルのあぶらとりのプロシージャは必要ないため大幅な時間節約を提供しています。したがって、この試金は通常、画面 a β オリゴマー阻害剤を使用します。このプロトコルの全体的な目標は、ブロッティング解析、ドット、画面 a β オリゴマー a β1-42のオリゴマーの量を分析するため、a β1-42オリゴマーの豊富なサンプルを準備する比較的単純な信頼性と再現性のあるメソッドを記述するのには半定量的実験結果を用いた阻害剤。

<table><tbody><tr><td>A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)</td><td>Abcam</td><td>GR91739-58</td><td></td></tr><tr><td>6E10 (β-Amyloid Rabbit Ab)</td><td>セル&nbsp;シグナル技術</td><td>2454S</td><td></td></tr><tr><td>OC (抗アミロイド線維OC抗体)</td><td>ミリポア</td><td>AB2286</td><td></td></tr><tr><td>西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)マーカーヤギ抗ウサギIgG(H + L)&nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>A0208</td><td></td></tr><tr><td>A&beta;1-42</td><td>GL Biochem</td><td>52487</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3,3-ヘキサフィウオロ-2-プロパノール</td><td>アラジン</td><td>I1523078</td><td></td></tr><tr><td>クルクミン</td><td>Σ</td><td>C1386</td><td></td></tr><tr><td>アルブミン ウシ V</td><td>Solarbio</td><td>A8020</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sangon Biotech</td><td>D920BA0003</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>SCR</td><td>30166428</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Solarbio</td><td>G8200</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;ジメチルスルホキシド</td><td>Solarbio</td><td>D8370</td><td></td></tr><tr><td>5&times;非変性ゲル PAGE タンパク質マーカー</td><td>Beyotime</td><td>P0016</td><td></td></tr><tr><td>Genshare CFAS anyKD PAGE</td><td>Genshare</td><td>JC-PE022</td><td></td></tr><tr><td>純ニトロセルロースブロッティング膜</td><td>Pall Corporation</td><td>T50189</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>SCR</td><td>10014118</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>超低範囲&nbsp;タンパク質</td><td>マーカーSolarbio</td><td>PR1300</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーメンブレン</td><td>Immobilon-PSQ</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>BeyoECL</td><td>スターBeyotime</td><td>P0018A</td><td></td></tr><tr><td>Commassie Blue 高速染色液</td><td>Beyotime</td><td>P0017</td><td></td></tr><tr><td>すべて - 自動化学発光イメージングシステム</td><td>タノン</td><td>タノン5200</td><td></td></tr><tr><td>画像J</td><td>National衛生</td><td></td><td></td>研究所</tr><tr><td>画像処理ソフト</td><td>Adobe</td><td>Photoshop CS6</td><td></td></tr><tr><td>磁気攪拌機</td><td>上海湖熙</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a11 肯定的なアミロイド β オリゴマーの合成と評価を使用してドットのしみが付く分析

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

Β アミロイド (a β) は集計に自己組み立てるに本質的な傾向と疎水性ペプチドです。各種骨材の中で a β オリゴマーはアルツハイマー病 (AD) の進行中の主要な神経毒として広く受け入れられている、AD の発症に重要なイベントであると見なされます。したがって、a β オリゴマー阻害剤が神経変性を防ぐため、疾患修飾として開発される可能性を秘めている AD の治療。しかし、a β オリゴマーの異なる形成プロトコルは、異なる特性を持つオリゴマーに可能性があります。さらに、効果的に画面 a β1-42オリゴマー阻害する多くの方法がないです。A11 抗体は逆平行 β シート構造を持つ有毒な a β1-42のオリゴマーのサブセットと反応できます。このプロトコルでは、合成 a β1-42ペプチド体外から A11 正 a β1-42オリゴマーの豊富なサンプルを準備し、ドットのしみが付くことによってサンプルの A11 正 a β1-42のオリゴマーの相対量を評価する方法について述べるA11 と a β1-42を用いた解析-特定 6E10 抗体。このプロトコルを使用して、A11 正 a β1-42のオリゴマーの阻害剤は、半定量的な実験結果から上映されることができます。

A β1-42の単量体が準備の後 a β1-42オリゴマーを形成できるかどうかを調べるには、TEM 分析を使用しました。HFIP 溶解 a β1-42モノマー サンプル (図 1A) で表示される集計は認められなかった。また、周りの直径を持つ主に球状骨材 10 80 nm で観察された a β1-42サンプルの振動、48 時間後 a β1-42の準備 (図 1B) 後オリゴマーを形成することを示唆しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57592/57592fig1.j...

このプロトコルでは、体外で合成ペプチド a β オリゴマーを準備しドット解析をしみが付くことによって a β オリゴマーの相対量を評価する方法について説明します。

A11 肯定的なアミロイド β オリゴマーの合成と評価を使用してドットのしみが付く分析

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

この方法は、神経薬理学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、シンプルで信頼性が高く、再現性のあるベータアミロイドオリゴマーの形成が可能であることです。ベータオリゴマーの調製手順は習得が難しいため、この方法のデモンストレーションが重要であることを示しています。まず、チューブに900マイクロリットルの二重蒸留水を追加して、A-ベータモノマー溶液の濃度を0.25ミリグラム/ミリリットルに調整します。次いで、モノマー溶液を高純度窒素ガスで蒸発させ続け、体積が約850マイクロリットルに達し、濃度が約0.29ミリグラム/ミリリットルに達するまで。HR5Pの存在は、A-βオリゴマーの形成に影響を与えます。したがって、可能な限り蒸発させることは、この手順の重要なステップです。次に、二重蒸留水を使用してクルクミン原液を希釈し、0.2マイクロモルと2マイクロモルの作業溶液を調製します。1対1の比率を維持し、A-β溶液をクルクミンと混合して、クルクミンの最終濃度を0.1と1マイクロモルにします。次に、溶液を磁気攪拌機の上に置きます。プラスチック製の仕切りボックスを磁気攪拌機に取り付けます。ボックスの2つの角に2つのマグネチックスターバーを配置し、サンプルが入ったチューブをボックスの中央に置きます。ボックスを室温で毎分60回転で48時間振とうし続け、次にチューブをGの18, 000倍で摂氏4度で15分間遠心分離します。遠心分離後、上清を回収します。ドットブロッティング分析では、ニトロセルロースメンブレンを1cm幅のストリップに切断し、次に2マイクロリットルのサンプルをストリップ1と2に均等に配置し、各ポイント間隔を0.5cmにします。メンブレン上でサンプルを噴射するときは、均一に広げ、異なるサンプルが互いにリンクしないように異なる液滴を制御する必要があります。次に、液滴が乾くまで、ストリップを室温で5分間インキュベートします。5分後、ストリップを5%ウシ血清アルブミンと室温で30分間インキュベートします。インキュベーションが終了したら、ストリップをTBSTバッファーで5分間洗浄します。洗浄後にバッファーを吸引し、ストリップ1を抗オリゴマー抗体A11と、ストリップ2を抗A-β抗体6E10溶液と1時間インキュベートします。1時間後、ストリップをTBSTで5分間、3回ずつ洗浄し、バッファーを吸引し、ストリップを二次抗体溶液と40分間インキュベートします。二次抗体インキュベーション後、再度TBSTで5分間、各3回洗浄します。次に、湿ったストリップの表面に約300マイクロリットルの混合ECL流体を加え、自動化学発光イメージングシステムでストリップを露光します。TEM研究では、HFIP溶解したA-βモノマー溶液には目に見える凝集体が存在しないことが示されていますが、48時間のインキュベーション後、同じモノマーがオリゴマーを形成します。これは主に直径10〜80ナノメートルの球状凝集体です。A-βモノマーおよびオリゴマーリッチサンプルをドットブロット分析にかけると、A-βオリゴマーリッチサンプル中にA11陽性のA-βオリゴマーが存在することが示されています。興味深いことに、A-β 6E10陽性のA-βペプチドは、A-βモノマーとオリゴマーに富むサンプルの両方に存在します。次に、特異的抗体陽性のA-βモノマーとオリゴマーに富むサンプルをコントロールの割合として発現するための半定量分析も行われます。A11陽性のA-βペプチドは、モノマーと比較して、A-βオリゴマーが豊富なサンプルで有意に高くなっています。それどころか、A-β 6E10陽性のA-βペプチドは、モノマーとオリゴマーが豊富なサンプルの両方に存在します。実際、A-βオリゴマーは、クルクミンおよびA-βオリゴマー阻害剤とも共インキュベートされます。クルクミンは、クルクミン共インキュベートしたA-βオリゴマーサンプル中のA11染色を減少させ、A11陽性A-βオリゴマーの相対量を大幅に減少させます。ただし、クルクミンの濃度が変化しても、A11陽性サンプルと比較した場合、6E10陽性モノマーおよびオリゴマーリッチサンプルのA-βペプチドの数には影響しません。一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば数時間で実行できます。その開発後、この技術は、研究者がアルツハイマー病などの神経変性疾患の薬剤候補を探求する道を開きました。このビデオを見れば、A-βオリゴマーの調製方法とその量の評価方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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自動化された微生物叢システムを用いた中国ハムスター卵巣細胞からのモノクローナル抗体の精製と分析

質量分析ベースのプロテオミクス分析によるこの生化学的精製方法は、アミロイド線維コアの堅牢な特性評価を容易にし、アルツハイマー病を予防するための標的の同定を加速させる可能性がある。...

脳からのアミロイド線維コアの生化学的浄化とプロテオミクス特性評価

ここでは、ドットブロットを用いて全体のm⁶Aレベルを半定量的に評価するプロトコルを提示します。全RNAは抽出され、変性され、ナイロン膜に斑点を検出し、抗m⁶A抗体でプローブされ、化学発光によって可視化されます。ImageJグレースケール解析で定量化された信号強度は相対的なメチル化存在比を反映し、研究のための再現性のあるワークフローを提供します。...

グローバルN6-メチルアデノシンRNA修飾レベル検出のためのドットブロットアッセイ

学ぶ Aβオリゴマーの合成とドットブロット解析による評価法。シンプルで再現性の高いこの神経薬理学的プロトコルは、アルツハイマー病研究における治療薬候補の探索に不可欠です。

A11 肯定的なアミロイド β オリゴマーの合成と評価を使用してドットのしみが付く分析

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