A11 肯定的なアミロイド β オリゴマーの合成と評価を使用してドットのしみが付く分析
2018年5月22日
このプロトコルでは、体外で合成ペプチド a β オリゴマーを準備しドット解析をしみが付くことによって a β オリゴマーの相対量を評価する方法について説明します。
この方法は、神経薬理学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、シンプルで信頼性が高く、再現性のあるベータアミロイドオリゴマーの形成が可能であることです。ベータオリゴマーの調製手順は習得が難しいため、この方法のデモンストレーションが重要であることを示しています。
まず、チューブに900マイクロリットルの二重蒸留水を追加して、A-ベータモノマー溶液の濃度を0.25ミリグラム/ミリリットルに調整します。次いで、モノマー溶液を高純度窒素ガスで蒸発させ続け、体積が約850マイクロリットルに達し、濃度が約0.29ミリグラム/ミリリットルに達するまで。HR5Pの存在は、A-βオリゴマーの形成に影響を与えます。
したがって、可能な限り蒸発させることは、この手順の重要なステップです。次に、二重蒸留水を使用してクルクミン原液を希釈し、0.2マイクロモルと2マイクロモルの作業溶液を調製します。1対1の比率を維持し、A-β溶液をクルクミンと混合して、クルクミンの最終濃度を0.1と1マイクロモルにします。
次に、溶液を磁気攪拌機の上に置きます。プラスチック製の仕切りボックスを磁気攪拌機に取り付けます。ボックスの2つの角に2つのマグネチックスターバーを配置し、サンプルが入ったチューブをボックスの中央に置きます。
ボックスを室温で毎分60回転で48時間振とうし続け、次にチューブをGの18, 000倍で摂氏4度で15分間遠心分離します。遠心分離後、上清を回収します。ドットブロッティング分析では、ニトロセルロースメンブレンを1cm幅のストリップに切断し、次に2マイクロリットルのサンプルをストリップ1と2に均等に配置し、各ポイント間隔を0.5cmにします。
メンブレン上でサンプルを噴射するときは、均一に広げ、異なるサンプルが互いにリンクしないように異なる液滴を制御する必要があります。次に、液滴が乾くまで、ストリップを室温で5分間インキュベートします。5分後、ストリップを5%ウシ血清アルブミンと室温で30分間インキュベー
トします。インキュベーションが終了したら、ストリップをTBSTバッファーで5分間洗浄します。洗浄後にバッファーを吸引し、ストリップ1を抗オリゴマー抗体A11と、ストリップ2を抗A-β抗体6E10溶液と1時間インキュベートします。1時間後、ストリップをTBSTで5分間、3回ずつ洗浄し、バッファーを吸引し、ストリップを二次抗体溶液と40分間インキュベー
トします。二次抗体インキュベーション後、再度TBSTで5分間、各3回洗浄します。次に、湿ったストリップの表面に約300マイクロリットルの混合ECL流体を加え、自動化学発光イメージングシステムでストリップを露光します。TEM研究では、HFIP溶解したA-βモノマー溶液には目に見える凝集体が存在しないことが示されていますが、48時間のインキュベーション後、同じモノマーがオリゴマーを形成します。これは主に直径10〜80ナノメートルの球状凝集体です。
A-βモノマーおよびオリゴマーリッチサンプルをドットブロット分析にかけると、A-βオリゴマーリッチサンプル中にA11陽性のA-βオリゴマーが存在することが示されています。興味深いことに、A-β 6E10陽性のA-βペプチドは、A-βモノマーとオリゴマーに富むサンプルの両方に存在します。次に、特異的抗体陽性のA-βモノマーとオリゴマーに富むサンプルをコントロールの割合として発現するための半定量分析も行われます。
A11陽性のA-βペプチドは、モノマーと比較して、A-βオリゴマーが豊富なサンプルで有意に高くなっています。それどころか、A-β 6E10陽性のA-βペプチドは、モノマーとオリゴマーが豊富なサンプルの両方に存在します。実際、A-βオリゴマーは、クルクミンおよびA-βオリゴマー阻害剤とも共インキュベートされます。
クルクミンは、クルクミン共インキュベートしたA-βオリゴマーサンプル中のA11染色を減少させ、A11陽性A-βオリゴマーの相対量を大幅に減少させます。ただし、クルクミンの濃度が変化しても、A11陽性サンプルと比較した場合、6E10陽性モノマーおよびオリゴマーリッチサンプルのA-βペプチドの数には影響しません。一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば数時間で実行できます。
その開発後、この技術は、研究者がアルツハイマー病などの神経変性疾患の薬剤候補を探求する道を開きました。このビデオを見れば、A-βオリゴマーの調製方法とその量の評価方法について十分に理解できるはずです。
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概要
本プロトコルでは、合成ペプチドを用いてin vitroでAβオリゴマーを調製する方法と、ドットブロット分析を用いてその相対量を評価する方法について解説します。この手法は簡便で信頼性が高く、再現性があるため、神経薬理学的研究において不可欠なものです。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 神経薬理学
- 生化学
背景
- Aβオリゴマーは神経変性疾患に関与している。
- これらの形成を理解することは、治療法の開発において極めて重要である。
- これらのオリゴマーを調製するための現行の手法は複雑な場合がある。
- 本プロトコルは、研究者がこのプロセスを簡略化できるようにすることを目的としている。
研究の目的
- Aβオリゴマーを調製するための信頼性の高い手法を提供すること。
- オリゴマー濃度の評価を容易にすること。
- 神経薬理学的実験における再現性を向上させること。
使用した手法
- A-betaモノマー濃度を0.25 mg/mLに調整する。
- 高純度窒素ガスを用いて溶液を蒸発させる。
- オリゴマー形成に対するHR5Pの効果をモニタリングする。
- 評価のためにドットブロット分析を利用する。
主な結果
- 本手法により、Aβオリゴマーを正常に作製できる。
- ドットブロット分析により、オリゴマー量を効果的に定量できる。
- HR5Pの存在が、オリゴマー形成に著しく影響を与える。
- 本プロトコルは高い信頼性と再現性を示す。
結論
- このプロトコールは、Aβオリゴマーの調製を簡便にします。
- 神経薬理学的研究において有用なツールを提供します。
- 今後の研究において、この信頼性の高い手法を活用することが可能です。
よくある質問
業界における重要性
A11陽性のβ-アミロイドオリゴマーの信頼性の高い調製と定量は、アルツハイマー病研究における初期段階の神経変性標的のバリデーションおよび阻害剤スクリーニングにおいて極めて重要です。本プロトコルにより、毒性オリゴマー種の再現性のある生成と半定量的な評価が可能となり、治療仮説の検証における予測精度の向上が期待できます。この手法は、神経薬理学的研究開発におけるメカニズムのリスク低減およびポートフォリオの優先順位付けにおける重要な転換点に直接的に対応するものです。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- アルツハイマー病の病理におけるメカニズム的な駆動因子としてのβ-amyloidオリゴマー形成の解析を可能にします。
- A11抗体の特異性を用いて、神経毒性種の機能的検証をサポートします。
- オリゴマー抑制を標的とした治療仮説のリスク低減を促進します。
- 候補抑制剤の比較分析のための再現可能なワークフローを提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 下流の阻害剤スクリーニングキャンペーンに向けた、バリデーション済みのオリゴマー豊富サンプルを調製します。
- 標準化されたアッセイ読み取りのための、半定量的なドットブロット出力を提供します。
- 化合物評価のための、A11陽性オリゴマーの再現性のある検出を可能にします。
- 神経変性疾患スクリーニングパイプラインにおけるスケーラビリティとプラットフォームの再利用をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- in vitroにおけるオリゴマー特性解析を、疾患に関連する神経毒性種と整合させます。
- 探索段階のバリデーションから前臨床の阻害剤評価までの連続性を提供します。
- メカニズム的なエビデンスに基づき、リスクを調整した候補分子の推進を可能にします。
- オリゴマーを標的とした介入のためのトランスレーショナルバイオマーカー開発を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このプロトコルは、初期探索とリード化合物同定のインターフェースを統合し、神経変性疾患ポートフォリオにおける堅牢な仮説検証およびアッセイ開発を可能にします。
- 探索生物学：β-アミロイドオリゴマーの毒性と阻害剤の効果に関するメカニズムの検証をサポートします。
- スクリーニング：化合物スクリーニングのワークフロー向けに、標準化された半定量的なドットブロットの結果を提供します。
- 分析：A11陽性および6E10陽性の種を比較定量でき、データに基づいた意思決定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：in vitroでのオリゴマー評価を、疾患に関連する神経毒性モデルへと結びつけます。
- 組織的な再利用：進行中の神経変性疾患研究プロジェクトにおいて、再現可能で拡張性のあるプロトコルを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： アルツハイマー病における標的バリデーションおよびメカニズムのデリスキングに対する予測信頼性を向上させます。
- 運用的価値： 標準化され、再現性および拡張性のあるオリゴマー調製と定量を実現します。
- 戦略的価値： 強固な阻害剤スクリーニングを可能にすることで、Go/No-go判断および資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響： 神経変性疾患治療候補物質のリスク調整後の優先順位付けを支援します。
実施上の検討事項
- ペプチドの取り扱いおよび免疫検出技術に関する専門知識が必要です。
- ドットブロット装置および化学発光イメージングシステムへのアクセスが必要です。
- 再現性のあるサンプル調製および解析のためには、チーム間での標準化が求められます。
- 様々な阻害剤候補およびオリゴマーペプチド系に適応可能です。
- 抗体の特異性および半定量分析の限界に依存します。
