Name: マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学ぶマウス膵臓前駆細胞からスキャフォールドフリーでインスリンを発現する三次元パンクレアトイドの作製法。間葉組織を含む複雑な環境での内分泌細胞形成を理解するための発生生物学モデルです。

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プロトコルおよび原稿に関する有用な議論ありがとう省 Jolanta Chmielowiec。また、ベンジャミン ・ Arenkiel は共焦点顕微鏡へのアクセスに感謝我々。この作品は NIH (P30 - M.B. への DK079638) と T32HL092332-13 M.A.S. と M.B. と (M.B.) にマクネア医療財団、BCM 知的、発達障害研究センターの共焦点のコアによって支えられた (ユニスから NIH U54 HD083092ケネディ ・ シュライバー国立研究所母子保健と人間開発)。

このメソッドに記載されているすべての動物実験は、機関動物ケアおよび使用委員会のベイラー医科大学によって承認されました。
1. マウス胚日 10.5 膵前駆細胞の調製
注: このプロトコル必要はありません手順 2 まで無菌条件の下で続くことにしかし、それは解剖ツールを殺菌し、使用する前に 70% エタノールをスプレーするが最適。
<ol><li>郭清をセットアップする、氷のバケツを埋めるし、氷のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) のコンテナーを配置します。2 つの細い鉗子と解剖はさみの 70% エタノールで拭きます郭清範囲付近に設定、少なくとも 3 つホウケイ酸毛管容器チューブ口ピペット、ライターと 1,000 μ L ピペット チップをフィルタ リングします。<ol>
<li>滅菌水と氷の上 12 ウェル プレートの 2 番目の井戸の場所で希釈 1.25 mg/mL 冷たい当期の少なくとも 1 mL を準備します。最初、3 番目、および 4 番目の PBS を入れて 12 の井戸はウェル プレートします。氷の上チューブ 1.5 mL のトリプシンの 0.05% の場所 1 mL。あらかじめ 37 oc 以上に揺れインキュベーターを温める</li>
	</ol>
</li>
	<li>E10.5 IACUC ガイドラインに従ってタイミング妊娠マウスを安楽死させます。腹部をハサミ、鉗子を使ってマウスの性器で V 字切開を行う前に、地域をきれいにし横隔膜まで継続 70% エタノールをスプレーします。 注: このプロトコルで膣にプラグの外観は、0.5 日を示します。2 g 以上の体重増加は 5 - 6 週齢のマウスを使用して成功した含浸の二次的な対策として機能します。<ol>
<li>慎重に反対側に繰り返す前に陰部にこの切開し、上方マウスからの臓器を引っ張って、子宮の最上部の横部分で切開することで子宮を切除します。10 cm 冷 PBS でシャーレに入れること。 注: それはしかし e10.5 の pancreatoids とは異なりこれらオルガノイド特徴付けされていませんし、従ってすべての 3 主要な膵臓系譜への分化誘導能力が保持されない分離した e11.5 細胞からオルガノイドを得ることが可能です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>光解剖顕微鏡の下でペトリ皿を配置し、慎重にそれぞれの胚の間 2 つの鉗子を配置し、卵黄嚢から組織を剥離子宮の組織を開きます。把持鉗子と 10 cm シャーレ、新鮮な場所で軽く卵黄嚢胚を転送冷 PBS。氷の上にペトリ皿を配置します。 注: 胚、強制的な削除は、臍帯、胎児の組織をリッピングと構造の整合性を損なうことを引っ張ることができる卵黄嚢内で維持できれば heedfully を削除することが重要です。</li>
	<li>10 cm シャーレの蓋に複数 PBS 滴を配置します。これらの液滴を使用すると、初期胚胚体外組織が視認性を確保するために削除されると、解剖時に胚を転送します。PBS ドロップに胚を転送、鉗子を使用して残りの胚のまま氷上 (図 1A) PBS で卵黄嚢からそっと取り外します。胚を軽くティッシュ (図 1B) を損傷しないように、胚をスクープする鉗子を使用して新しい PBS ドロップに移動する前に頭を削除します。 注: 組織は、液体の不透明度に応じてここでは、説明よりも新鮮な PBS の液滴により頻繁に転送する必要があります。<ol>
<li>新しい PBS ドロップ鉗子 (図 1B) を使用して前肢芽を削除します。肢芽があった開口部に鉗子を配置し、ゆっくり前方のみほとんどの外部組織を引き裂く (図 1B)。胚を回転させ、肢芽で停止、後部方向に繰り返します。この時点で、消化管は目に見える (図 1B) をする必要があります。</li>
		<li>消化管の後部の地域は、わずかな曲がり (図 1 f) を持っています。消化管と体壁の脊髄領域の冒頭でこの曲の背後に鉗子を挿入します。消化管、心臓領域が (図 1B E) を接続する最も前方の領域に到達するまでゆっくりと上向きに働くをデタッチします。 (省略可能) は、原始の心と肝芽を削除連続腸内管だけを残して、消化管の腹側の地域から。このプロトコルが実行される最初の数回それは心臓と肝臓消化管および背側膵原基の形態まで腹側ランドマークが多いまましやすくなる可能性があります (図 1CとDはおなじみ).</li>
		<li>消化管を新鮮な PBS の液滴に転送します。</li>
		<li>鉗子を取るし、突出の芽と腸の下にティッシュを軽くピンチ (図 1D F) を外側の組織を少し持ち上げます。 注: 背側膵原基は胃と腸 (図 1C G) の間に位置します。下膵芽ラウンド、節くれだった構造 (図 1G) ようになります。</li>
		<li>芽が腸と上向きの芽 (図 1G) を緩めにピンチに接続する鉗子を配置します。新しい PBS バブルで氷冷 PBS で 12 ウェル プレートの最初のウェルに芽を転送する前に 1 つの時間を洗浄します。すべて芽胚から収集され、12 ウェル プレートの最初の井戸の配置までを繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>光解離顕微鏡 12 よく皿を配置します。正常に後分割比率を計算するために解剖膵芽の数をカウントします。<ol>
<li>場所フィルター 1,000 μ L ピペット チップ キャピラリー チューブと口のピペットに添付。炎はキャピラリー チューブを滅菌して使いやすさのためチューブにベンドを作成します。キャピラリーを使用すると、2 分の 2 番目も含んでいる冷たい当期ソリューションにきれいな PBS (図 1G) で 3 番目の井戸の中に転送する前に芽を転送します。 注: 当期から芽を PBS に転送する中に、は、キャピラリー チューブの先端にティッシュを触れないでください。組織は、チューブの先端をはまり、ピペットの上下またはゆるむまでクリーンソリューション PBS で横に振る。</li>
		<li>芽の上下、ピペットし、きれいな PBS の 4 番目の井戸に転送。最後に、0.05% と 1.5 mL チューブに芽キャピラリー デバイス転送を使用してトリプシン。予め温めておいた 37 oC シェーカーにチューブを置き、4 分間 1,500 rpm で振る。</li>
		<li>約 10 の渦 s すぐを置く遠心分離機で 200 で 5 分間スピン チューブ g. 削除遠心細胞 (図 1G) を邪魔しないよう慎重にソリューションのすべてが約 50 μ L。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Pancreatoids を形成する解離前駆細胞の培養
注: 次は滅菌滅菌の標準の手順を使用して、標準のティッシュ文化フードの雰囲気の中で実行する必要があります。
<ol><li>すべての芽を収集、遠心のセルを 400 μ L 器官形成メディア16,17 (表 1) を追加します。パルス渦 3 回とプレート 100 μ L/ウェルの低接着 96 ウェル プレート、1:4 の比率 (図 1G) で芽を分割します。</li>
	<li>視覚化する解離細胞 (図 1H) を自由に浮遊、顕微鏡下でチェックしてください。中速でロッカーに 5% CO2と 37 oC のインキュベーターで培養皿を配置します。</li>
	<li>Pancreatoids の進行状況を毎日監視します。新鮮なメディアすべての 3 日間、慎重にピペッティング井戸の pancreatoid を残しながら削除するフード、顕微鏡の制御の下の 100 μ L に置き換えます。また、メディアの新鮮な 100 μ L に追加できます新しいもと pancreatoid を使用して転送ホウケイ酸のキャピラリー チューブ口のピペットに添付されている 1000 μ L ピペット チップをフィルタ リングします。</li>
</ol>3. 蛍光イメージングのための Pancreatoids の処理
<ol><li>蛍光画像の pancreatoids を処理するには、最初 4% パラホルムアルデヒド/PBS、pH7.4 (PFA) ソリューションを準備します。4 %pfa は 96 の井戸のウェル プレートの 50 μ L を配置します。<ol>
<li>4% 新鮮な井戸の中に可能な限りとしてほとんどのメディアを取って培地から pancreatoids を転送ホウケイ酸キャピラリー チューブと口ピペットを用いた 1,000 μ L フィルター ピペット チップ、PFA。15 分間室温でロッカーに設定します。</li>
		<li>4% から pancreatoids を転送の新鮮な PBS 100 μ L をウェルに PFA が新鮮な PBS 洗浄 3 の合計 5 ~ 10 分繰り返し室温でロックします。 注: プロトコルは、pancreatoids の 1 週間 4 oC で 100 μ L の PBS に格納されているとここでは、休止できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wholemount イメージング (抗体は、セクション 3.3 で適切な代替アプローチが推奨します。 3.4 顕微鏡。)、PBS から 0.1% 非イオン性洗剤 (pbst;) 1x PBS で 50 μ l の 5% ロバ血清にブロック転送。4 oC で一晩岩または室温で 4 時間。<ol>
<li>Pancreatoids を 1 に 5% ロバ血清の 50 μ L で希釈した一次抗体を含む新しい井戸に転送 x PBST。(36 h ですが少なくとも 12 h) 4 oC で 24 時間、最適なロック。 注: Chga (1: 100)、DBA (1: 400)、Vim (1: 400) および Pdx1 に対する材料の表に記載されて抗体 (1: 100); 染め色に適していますその他の抗体は、最適化を必要があります。</li>
		<li>よく洗浄し、室温で 30 分間ロック新鮮な PBST の 100 μ L を含む pancreatoids に転送します。3 新鮮な pbst; 洗浄の合計のためには、この手順を繰り返します。</li>
		<li>Pancreatoids を 1 に 5% ロバ血清の 50 μ L で希釈した二次抗体を含む新しい井戸に転送 x PBST。光から保護して、プレート、4 oC、24 h (36 h ですが少なくとも 12 h) 最適のロッキングの場所します。 注:テーブルの材料および DAPI 核の対比染色に記載されているすべての二次抗体は染め色に適しています。</li>
		<li>PBST と常温 1 で 3 つの洗浄の合計の 30 分の繰り返しのロック × 1 の 100 μ L を含む新しい井戸に pancreatoids を転送 x PBST。3 番目と最後の洗浄に追加 300 nM DAPI。</li>
		<li>最後に、100 μ L の PBS 清潔 4 o染色直後後イメージングから来る最高の結果が、共焦点顕微鏡によるイメージングの前に週までの光から保護 C でストアに配置します。イメージ投射の間 pancreatoids の動きを防ぐが、完全に乾くことを防ぐため、PBS の 20 μ L 液滴に各 pancreatoid を配置します。Pancreatoids がまだ残っていない場合、は、PBS の量を減らします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>凍結切片の PBS から一晩で 4 oc. 30% ショ糖液の pancreatoids を転送する.<ol>
<li>解剖顕微鏡の下にバブルの埋め込みメディアを追加します。顕微鏡制御の下で鉗子を使用して、優しく押すことによって埋め込みメディアを通じて何回か残留ショ糖を埋め込みメディアを凍結組織ブロックを転送する前に削除する pancreatoids を浸します。</li>
		<li>8 μ m でクライオスタットにドライアイス凍結までに組織ブロック、セクションを配置します。 注: セクション格納できます-80 oC または immunostained ですぐに。</li>
		<li>-80 oC 乾燥するまで約 5 分間室温で解凍してからのセクションを許可します。組織周辺ブロック 1 で希釈した 5% ロバ血清を用いた疎水性 pap ペンを使用して疎水性の障壁を描画室温で 30 分間 x PBST。</li>
		<li>メディアを取り出し、1 x pbst; 4 oc. で一晩で希釈 5% ロバ血清で希釈した一次抗体をすぐに交換</li>
		<li>主なソリューションを削除し、3 回 1 組織を洗って 10 分の x PBST。5% ロバ血清 1 の希釈で希釈した二次抗体溶液を追加後、室温で 1 時間 x PBST とスライドを光から保護します。</li>
		<li>セカンダリのソリューションを削除し、1 でスライドを 3 回洗浄 10 分の x PBST。最終的な洗浄に追加 300 nM DAPI。</li>
		<li>メディアを削除し、メディアをマウント、coverslip を追加します。ストアは、イメージする準備ができるまで 4 oC の光からスライドします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 転写解析のための Pancreatoids からの RNA の隔離
<ol><li>Pancreatoids 酸ためチオシアン酸-フェノール-クロロホルム溶液 1.5 mL チューブの 500 μ L に不稔と場所のフィルター 1,000 μ L ピペット チップと口のピペットに添付ホウケイ酸のキャピラリーを使用してを収集します。-80 oC で保存または RNA の隔離に進んでください。</li>
	<li>RNA の隔離の必要に応じて、氷のサンプルを解凍し、100 μ L のクロロホルムを追加します。4 oc 以上に遠心分離機があらかじめ冷たい渦もと 4 oC で 15 分間の場所<ol>
<li>遠心分離機・ スピン 4 oc 以上で 12,000 g で 20 分間のチューブを置き</li>
		<li>層の分離を邪魔しないようにチューブを慎重に取り外します。200 μ L ピペットを使用して、透明な水溶液を収集し、白質層とピンクの DNA 層からバッファーに少量を残して新しい 1.5 mL チューブに配置。このプロセスで何かをピペットの先端に触れないで、1.5 mL チューブの壁に触れないでください。</li>
		<li>水層と渦を含む新しい管への 100% イソプロピル アルコール液 500 μ L を追加します。20 分、氷の上に長い間または一晩で-20 oC. 最大降水量まま室温で放置します。</li>
		<li>4 oC RNA をペレットにで 15 分間 12,000 g で遠心分離機します。ペレットを乱すことがなく、イソプロパノールを削除します。 注: pancreatoids は小さな、ペレットは表示できない可能性が高いです。</li>
		<li>風邪、75% エタノールを追加し、数回チューブを反転します。遠心分離機で配置し、エタノールと 9,000 の x g で 2 分間スピン 4 oc. 削除で 10 分の 9,000 の x g でスピンします。</li>
		<li>200 μ L ピペットを使用して、ペレットが存在する地域に連絡せずチューブに任意の残りのエタノールを削除します。残留エタノールの蒸発を確保するため室温で 5-10 分間チューブのキャップを開いたまま。</li>
		<li>きれいな、ヌクレアーゼ フリー水の 20 μ L のボルテックスでペレットを再懸濁します。 オプション: 熱 RNA 65 oC 3 分のため、すぐには、氷に戻る。RNA は-80 oC で保存または逆のトランスクリプションと qPCR のすぐに使用できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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細胞培養モデルの進行は、適切にモデル開発、臨床的に関連する細胞の種類、試験薬の有効性、または患者にも移植を生成に不可欠です。ただし、我々 は器官形成と生理のメカニズムの理解には程遠い、挑戦は皿に開発を人工的にさた体内。こうして体外細胞が効率的に生成された、完全に機能しない、時間の長い期間のために維持されるまたは匹敵する細胞を体内からその他の異常を港にできません。多くの異なったセルタイプ対話開発および生理学に影響を与える複雑な形態形成の変化が発生するためです。体外の利便性を組み合わせることで開発の続行方法の理解を得る体内の開発の複雑さを維持しながらシステム生物医学の研究のための貴重なツールを与えます。
オルガノイドの開発は有望な道の開発の複雑さをモデル化です。このプロトコルのネイティブ間充織を保持し、pancreatoids はグルコース応答を示さないにもかかわらず確実内分泌細胞を生成する pancreatoids と呼ばれる、膵臓オルガノイドの作り方の概要を説明します。このツールは、生体内で見...

正常な発達の生理機構の輪郭を描くは、疾患の病因を理解し、最終的に治療法を育成に重要です。養殖と幹細胞の差別化により、開発を迅速かつ高スループット分析、細胞の運命を制御するメカニズムに関する知識の既存のボディによって制限されます、人工的に開発を繰り返す、比較的均質な二次元の状態1,2。だけでなく、ニッチおよび環境の異なる細胞型と外因性の影響によって影響を受ける生体の開発は器官形成を導くためパラクリン シグナルと組織的支援を提供して、これらの細胞の機能にも依存、ガイダンス3,4、5の周辺。これらの外部の手がかりの重要性、差別化プロトコルの制限およびマウス モデル生体内での骨の折れる性質を考えると、新しいシステムが実験的基本的な発達過程および生理学を調査するため必要です。
3次元、複雑なオルガノイドを生成するプロトコルの出現も病態. 、薬効、生理器官形成研究に便利と合同システムを提供します。6腸胃7などさまざまなシステムが器官形成の私達の理解を拡大しているためマウス オルガノイドの確立、体内よりも少ない制限で発達の複雑性を研究するためのツールを提供します。生体外モデル。形成とひと多能性の出現により幹細胞、ひと腸8、網膜9, 腎10,11, マウス organoid のこれらの進歩のためと脳12オルガノイドを生産されているとこレパートリーは、開発のメカニズムに関する既存の知識によってのみ制限されます。
特定の関心は膵オルガノイドの世代として病気の無数の膵外分泌不全13、膵炎14、腺房細胞の腺房細胞、ダクトを含む種類の異なる膵細胞を悩ませていると糖尿病15のベータ細胞。これらの異なる細胞型の開発に関する知識を得る彼らの病理を理解することに役立つ可能性が、パーソナライズされた薬剤のスクリーニングまたは移植のためのプラットフォームとして使用できます、また。Greggioらが生体の形態形成を要約し、すべての主要な膵上皮細胞から成る組織、立体的で複雑な構造を開発するマウスの膵オルガノイドを作成する手法を開発する以前は、16,17 を種類します。これは膵の分野で主要な前進、体外特にとして作る細胞はベータ細胞の生物学的調査を有効にできます。ただし、内分泌細胞の不足は、ニッチが対話できるし、指導手掛かり17を提供する組織に、オルガノイドを移植しない限り、このプロトコルで結成。間充織が大きく内分泌はく離と分化3,4を含む後の段階に器官形成の初期段階から開発の上皮を包み込む、ニッチの最も大きい部分を構成します。 18。発展途上膵臓と間充織相互作用はまだ器官形成を研究する外因性シグナリングと体内細胞複雑さを維持することの重要性の別の例です。
ここでは、解離の e10.5 マウス膵前駆細胞からの pancreatoids と呼ばれる三次元の膵オルガノイドを生成する方法について述べる。これらの pancreatoids ネイティブ間充織を保持、自己をフローティング状態で組み立てるし、堅牢な内分泌のベータ細胞19数など、主要な膵細胞型をすべて生成します。この方法は、以前のプロトコルは、堅牢な内分泌分化を欠いているように内分泌の開発の分析に最適です。ただし、膵オルガノイドのプロトコルを使用して Greggioらは膵上皮分岐の形態形成解析に適してのとおり分岐と限定 pancreatoids。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>キャリブレーション済みマイクロキャピラリーピペット用アスピレーターチューブアセンブリ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>BarnStead NanoPure ヌクレアーゼフリー水</td><td>サーモフィッシャー</td><td>D119</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸キャピラリーチューブ</td><td>サッター器具</td><td>GB1007515</td><td>O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm 長さ</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>撥細胞剤 96ウェルマイクロプレート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td>U底</td></tr><tr><td>遠心分離機 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233306</td><td></td></tr><tr><td>Chromogranin-A antibody</td><td>Abcam</td><td>ab15160</td><td></td></tr><tr><td>コンパクトモジュール式実体顕微鏡 M60</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess 自動セルカウンター</td><td>Invitrogen</td><td>C10310</td><td></td></tr><tr><td>カウントスセルカウンタースライド</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70</td><td>ThermoFisher</td><td>957000L</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-ジアミジン-2'-フェニルインドール-二塩酸塩)</td><td>ロシュ</td><td>10 236 276 001</td><td>粉末</td></tr><tr><td>DBA 抗体</td><td>ベクター ラボ</td><td>RL-1032</td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ II, 粉末</td><td>ギブコ 17105041</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>ギブコ</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>ドナーゼ I</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11251-10</td><td>0.05 x 0.02 mm;チタン;生物学のヒント</td></tr><tr><td>EGF(上皮成長因子)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、200 Proof</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri Cycle CO2 Incubators</td><td>ThermoFisher</td><td>370</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>OB10001</td><td></td></tr><tr><td>豚腸粘膜からのヘパリンナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>INSM1抗体</td><td>Santa Cruz BioTechnology</td><td>sc-271408</td><td>ポリクローナルマウスIgG</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>フィッシャー</td><td>a4164</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia Isoflurane, USP</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>インスリン抗体</td><td>Dako</td><td>A056401</td><td>ポリクローナルモルモット</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Universal</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4618</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>KaryoMax</td><td>10575090</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清補充</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SPE 高分解能スペクトル共焦点</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442615</td><td></td></tr><tr><td>マウス C-ペプチド ELISA</td><td>ALPCO</td><td>80-CPTMS-E01</td><td></td></tr><tr><td>マウス 超高感度インスリン ELISA</td><td>ALPCO</td><td>80-INSMSU-E01</td><td></td></tr><tr><td>MX35 ミクロトームブレード</td><td>サーモフィッシャー</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ノーマルロバ血清</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pdx1 抗体</td><td>DSHB</td><td>F6A11</td><td>モノクローナルマウス MIgG1</td></tr><tr><td>Peel-A-Way 使い捨て埋め込み金型</td><td>VWR</td><td>15160-157</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液</td><td>Corning</td><td>MT30002CI</td><td></td></tr><tr><td>PMA (Phorbol 12-Myristate 13-アセテート)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質LoBindマイクロ遠心チューブエ</td><td>ッペンドルフ</td><td>22431081</td><td>1.5mL容量</td></tr><tr><td>組換えヒトFGF-10タンパク質</td><td>R&D Systems</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトFGF-酸性</td><td>Peprotech</td><td>100-17A</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトR-Spondin Iタンパク質</td><td>R&D Systems</td><td>4546-RS</td><td></td></tr><tr><td>BenchRocker 2D</td><td>Benchmark</td><td>BR2000</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖 500g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 顕微鏡スライド</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>05-412-401</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek O.C.T. コンパウンド</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 試薬</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604039</td><td>(1x), no Phenol Red</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Invitrogen</td><td>15250061</td><td>細胞計数スライド用</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td><td>コーニング</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.25%)</td> <td>ギブコ</td><td>25200072</td><td>フェノールレッド</td></tr><tr><td>超低アタッチメント 24ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>超低アタッチメント スフェロイドプレート 96ウェル</td><td>コーニング</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>ビメンチン抗体</td><td>EMD ミリポア</td><td>AB5733</td><td>ポリクローナルチキン IgY</td></tr><tr><td>ボルテックス ジーニー</td><td>BioExpres</td><td>S-7350-1</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632二塩酸塩</td><td>R&D Systems</td><td>1254</td><td>別名 ROCK 阻害剤</td></tr><tr><td>ツァイス 710 共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウス膵臓前駆細胞の in vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する pancreatoids の生成

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

膵臓は、血液グルコースの恒常性と消化を調節する一緒に働く多くの異なったセルタイプから成る複雑な器官です。これらの細胞型には酵素分泌腺房細胞、腸、およびホルモン産生の内分泌細胞に酵素の輸送を担う葉状管システムが含まれます。
内分泌のベータ細胞は、血糖値を下げるインシュリンを作り出すボディの唯一のセル タイプです。糖尿病、損失または β-細胞の障害によって特徴づけられる病気大流行に達しています。したがって、スクリーニング目的のため使用して、薬物および細胞ベースの治療を派生できます β 細胞の開発を調査するためのプロトコルを確立することが不可欠です。マウス開発の実験的調査が不可欠ですが、生体内での研究は手間と時間がかかるです。培養細胞のスクリーニング; もっと便利なプラットフォームを提供します。しかし、彼らは細胞の多様性、建築の組織、および発見した細胞間相互作用を維持することは体内。したがって、膵の形態形成と生理学を調査するための新しいツールの開発が不可欠です。
細胞を整理して複雑な生理学的に有能な大人の臓器に分化膵上皮細胞器官形成の発症から間充織と密接に関連開発します。膵間充織は、多くのよく理解されていません、まだこうして体外培養中に要約することは困難内分泌の開発のための重要な信号を提供します。ここでは、pancreatoids と呼ばれる、間充織を保持文化複雑なマウスの立体化、細胞オルガノイドするプロトコルについて述べる.E10.5 マウス膵芽は解剖、解離、足場のない環境で養殖。浮遊細胞これらは自己開発の pancreatoid と堅牢な内分泌ベータ細胞、腺房と管細胞と一緒に開発数を包み込む間充織と組み合わせてください。このシステムは、器官形成中、や薬物、小さい分子、または遺伝学的スクリーニングの細胞運命決定、構造、形態形成、細胞間の相互作用を研究するために使用できます。

子宮角から e10.5 のマウス胚を細かくは、さらに郭清 (図 1A) の PBS で無傷の胚を得られるはず。消化管は、胚 (図 1B)、腸および胃 (図 1C F) の接続点で背側膵原基の洞察力を許可するから効率的に削除できます。E10.5 膵芽以前特徴付けされています。前駆細胞はPdx1、Sox9、Ptf1a、およびHes120,21,22,23を表現しなければなりません。組織の処理手順に従って、解離の...

分離したフローティング e10.5 膵前駆細胞と関連付けられて間充織から 3 D マウス pancreatoids を表現するインスリンを生成するプロトコルを紹介します。

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

この方法は、これらの膵臓を使用して、建築的および細胞的に複雑な環境で内分泌細胞がどのように形成されるかを理解することにより、膵臓領域の主要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。この技術の主な利点は、周囲の間葉が含まれているため、膵臓が内分泌細胞を発達させることです。一般に、この方法に不慣れな人は、膵臓がe10.5で非常に小さいため、苦労します。そして、解剖は、十分な非汚染組織を得るために膵臓を形成するために重要です。解剖の準備をするには、氷のバケツを満たし、氷の中にリン酸緩衝生理食塩水の容器を置きます。2つの細い先端の鉗子と解剖はさみを70%エタノールで洗浄します。解剖領域の近くに、少なくとも3本のホウケイ酸キャピラリーチューブ、ライター、ろ過された1000マイクロリットルのピペットチップが入った容器をセットします。次に、氷上の12ウェルプレートの2番目のウェルで滅菌水で希釈された1ミリリットルあたり1.25ミリグラムの少なくとも1ミリリットルの冷分散酵素をピペットで移します。12ウェルプレートの第1、第3、および第4ウェルのPBSをピペットします。また、氷上の1.5ミリリットルのチューブに0.05%トリプシンの1ミリリットルをピペットで移します。IACUCガイドラインに従ってe10.5時限妊娠マウスを安楽死させた後、腹部に70%エタノールを噴霧して領域を洗浄します。その後、ハサミと鉗子を使ってマウスの生殖器部分をV字切開し、横隔膜まで切開を続けます。子宮の最上部の外側部分を切開し、臓器をマウスから上向きに引き離し、この切開を生殖器領域までたどってから反対側で繰り返すことにより、子宮を慎重に切除します。切除した子宮を冷たいPBSを入れた10センチのシャーレに入れます。光学解剖顕微鏡の下で、ペトリ皿を置き、各胚の間に2つの鉗子を置き、卵黄嚢から組織を剥がすことにより、子宮組織を慎重に開きます。鉗子で卵黄嚢を優しくつかみ、新鮮で冷たいPBSを入れた10センチメートルのシャーレに胚を入れて胚を移植します。ペトリ皿を氷の上に置きます。次に、10センチのペトリ皿の蓋に複数のPBSドロップを置きます。これらの液滴を使用して、解剖中に胚を移植し、胚外組織を除去して視認性を確保します。胚をPBSドロップに移し、残りの胚が氷上のPBSに留まっている間、鉗子を使用して卵黄嚢から静かに取り出します。鉗子を使用して胚を新しいPBSドロップに移動する前に頭を取り外し、組織に損傷を与えることなく胚を軽くすくい取ります。新しいPBSドロップで、鉗子を使用して4つの手足の芽を取り除きます。四肢のつぼみがあった開口部に鉗子を置き、前方の最も外側の組織のみを優しく引き裂きます。胚を回転させ、後肢の芽で停止しながら後方向に繰り返します。この時点で、消化管が見えるはずです。胃腸管の後部領域はわずかに曲がっています。この曲がりの後ろに、胃腸管と体壁の脊椎領域との間の開口部に鉗子を挿入します。胃腸管を切り離し、心臓領域が接続する最も前方の領域に到達するまでゆっくりと上向きに作業します。次のステップでは、膵臓が非膵臓組織で汚染されないように、培養物の周囲組織を避けることが重要です。ただし、膵臓の芽全体をつかまないと、膵臓の数とサイズが損なわれます。胃腸管を新鮮なPBS液滴に移します。胃腸管を囲む外側組織を引き続き取り除きます。この外側の組織を取り除くと、膵芽は肝臓の芽の後方、胃と腸の間に視覚化できます。次に、鉗子を取り、腸の突き出た芽の下の組織をそっとつまみ、膵臓の芽を少し持ち上げます。つぼみが腸につながる部分をつまんだ後、つぼみを分離します。新しいPBSバブルで1回洗ってから、つぼみを12ウェルプレートの最初のウェルに移し、氷の上でPBSを冷やします。すべての芽が胚から採取され、12ウェルプレートの最初のウェルに配置されるまで繰り返します。次に、12ウェルディッシュを光学解剖顕微鏡の下に置きます。後で分割率を計算するために、正常に解剖された膵芽の数を数えます。キャピラリーチューブを取り付けた状態で、ろ過された1000マイクロリットルのピペットチップをピペットに入れます。キャピラリーチューブを火炎滅菌し、チューブに曲がりを作らせて使いやすくします。キャピラリーを使用して、つぼみを冷たいディスパーゼ溶液を含む2番目のウェルに2分間移してから、きれいなPBSを含む3番目のウェルに移します。つぼみを上下にピペッティングし、きれいなPBSを含む4番目のウェルに移します。最後に、毛細血管装置を使用して、芽を0.05%トリプシンを含む1.5ミリリットルのチューブに移します。予め温めた摂氏37度のシェーカーにチューブを置き、1, 500 RPMで4〜5分間振とうします。約10秒間ボルテックスした後、すぐにチューブを遠心分離機に入れ、200gで5分間回転させます。遠心分離した細胞を乱さないように、約50マイクロリットルを除くすべての溶液を慎重に除去します。400マイクロリットルの器官形成培地で遠心分離した細胞に収集された芽ごとに、ボルテックスを3回パルスし、低付着96ウェルプレートのウェルあたり100マイクロリットルをプレート化し、芽を1対4の比率で分割します。顕微鏡で確認し、解離した細胞が自由に浮遊している様子を観察できます。次に、培養皿を5%の二酸化炭素を入れた摂氏37度のインキュベーターに、中速でロッカーに置きます。子宮角からe10.5でマウス胚を注意深く解剖すると、PBSで損傷を受けていない胚が得られ、さらなる解剖が可能になります。消化管は胚から効率的に除去することができ、腸と胃の接合部にある背側の膵芽の識別を可能にします。器官形成培地では、これらの自由に浮遊する足場のない細胞が自己組織化して三次元膵臓に組織化し、培養中で少なくとも10日間成長して持続します。プロテインキナーゼC活性化剤を高濃度で適用すると、発生中の膵臓の形態が変化し、上皮細胞が緩やかに結合し、分岐が増加します。さらに、トランスジェニック動物を使用することで、細胞が分化する過程をリアルタイムで可視化することができます。膵臓間葉組織と膵臓上皮細胞との関連を評価するために、各組織のマーカーに対して免疫染色を行うことができます。内分泌マーカーと核を用いた管マーカーの免疫染色により、膵臓骨の多系統形成が明らかになります。膵臓前駆細胞マーカーと共染色された間葉マーカーは、間葉が膵臓を包み込むことを示しています。ベータ細胞の発生は、上皮マーカーとベータ細胞マーカーを染色することで明らかになります。定量的PCR解析により、前駆遺伝子や分化マーカーなど、前駆細胞や分化細胞の転写産物を評価することができます。一度習得すると、このテクニックは、適切に実行されれば、準備時間を含めて約1時間で行うことができます。このビデオを見た後、10.5マウスから膵臓組織を採取して膵臓を生成するための解剖を行う方法についてよく理解しているはずです。この手順を試みる際には、胚から消化管を慎重に取り除くことを覚えておくことが重要です、そうしないと膵芽を見つけるのが非常に困難になります。この手順に続いて、GSISやELISAなどの他の方法を実行して、グルコース刺激後にどれだけのインスリンまたはC-ペプチドが生成されるかなどの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、低分子を用いたPKC活性化の形態学的影響を探求する道を開きました。このシステムをさらに実装して、発現の転写因子の影響を研究し、さらに重要なエピスタシス実験を行う方法。

generation-scaffold-free-three-dimensional-insulin-expressing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

膵臓のような前駆細胞がインスリンを発現するコロニーへの分化を可能にする三次元のクローン原性アッセイが記載されている。単一の前駆細胞が増殖と分化するこの方法は、メチルセルロース、マトリゲルと成長因子を含有する半固体培地を利用しています...

インスリン発現コロニーを形成する前駆細胞の定量アッセイ

ここでは、マウス胚性膵臓の分離、培養および操作のための方法を説明します。これは、優れたを表し...

のためのシステム<em&gt; ex vivoで</em胚膵臓&gt;培養

このプロトコルで説明した3次元培養法は、分枝状の臓器へのそれらの大幅な拡大、分化および形態形成などの分散したマウス胎児の膵臓前駆細胞から膵臓の発達を再現。この方法は、画像化、ニッチの機能的干渉や操作に適している。...

分散マウス胚性前駆細胞からin vitro膵臓器官形成

自己再生および成体マウスの膵臓から単離された前駆細胞の分化を検出するためのインビトロコロニーアッセイに考案されています。これらのアッセイでは、膵臓前駆細胞は、メチルセルロースを含む半固形培地中で3次元空間での細胞コロニーを生じます。単一細胞、個々のコロニーの特徴を処理するためのプロトコルが記載されています。...

インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

このプロトコルは、マウス島の単離および脱細胞化された骨格上への播種を実証する。足場支持膵島を、ストレプトゾトシン（STZ）誘発糖尿病マウスの精巣上体脂肪パッドに移植した。島は移植部位で生存し、高血糖状態を逆転させた。...

糖尿病マウスの精巣上体脂肪細胞における膵島支持骨格移植

ここでは、膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+にひと多能性幹細胞 (hPSCs) を区別するために詳細なプロトコルを提案 (PDX1+) の非植民地型単層成長に基づいて膵臓系譜の生成のためのセル単一細胞を分離しました。このメソッドは、同種 hPSC...

効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hPSCs から

本プロトコルは、平面単層におけるヒト多能性幹細胞(hPSC)に由来する膵臓前駆細胞におけるPDX1およびNKX6.1転写因子の共発現を増加させるための増強された方法を記載する。これは、新鮮なマトリックスを補充し、細胞密度を操作し、内胚葉細胞を解離することによって達成される。...

2D培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化

幹細胞の膵島細胞への分化は、従来の糖尿病治療や疾患モデリングに代わるソリューションを提供します。市販の分化キットと以前に検証された方法を組み合わせて、インスリン分泌性幹細胞由来の膵島を皿で産生するのに役立つ詳細な幹細胞培養プロトコルについて説明します。...

ヒト多能性幹細胞のインスリン産生膵島クラスターへの分化

この記事はセルのようなβ細胞の指示された微分そして機能分析のためのプロトコルを示す。インスリン産生膵細胞を作製する前のヒト多能性幹細胞の最適な培養条件と継代について記述します。6段階の分化は、決定的な内胚葉の形成から、グルコースに反応してインスリンを分泌する機能的なβ細胞様細胞へと進行します。...

ヒト多能性幹細胞から機能的な膵臓インシュリン分泌細胞を生成するための最適化されたプロトコル

私たちは、免疫不全マウスへのヒト幹細胞由来膵幹細胞膵島の筋肉内移植のための低侵襲プロトコルを提供し、 生体内...

マウスにおけるヒト多能性幹細胞由来膵臓内分泌細胞の筋肉内移植

学ぶマウス膵臓前駆細胞からスキャフォールドフリーでインスリンを発現する三次元パンクレアトイドの作製法。間葉組織を含む複雑な環境での内分泌細胞形成を理解するための発生生物学モデルです。

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールドフリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

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マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

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