マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

この方法は、これらの膵臓を使用して、建築的および細胞的に複雑な環境で内分泌細胞がどのように形成されるかを理解することにより、膵臓領域の主要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。この技術の主な利点は、周囲の間葉が含まれているため、膵臓が内分泌細胞を発達させることです。一般に、この方法に不慣れな人は、膵臓がe10.5で非常に小さいため、苦労します。

そして、解剖は、十分な非汚染組織を得るために膵臓を形成するために重要です。解剖の準備をするには、氷のバケツを満たし、氷の中にリン酸緩衝生理食塩水の容器を置きます。2つの細い先端の鉗子と解剖はさみを70%エタノールで洗浄します。

解剖領域の近くに、少なくとも3本のホウケイ酸キャピラリーチューブ、ライター、ろ過された1000マイクロリットルのピペットチップが入った容器をセットします。次に、氷上の12ウェルプレートの2番目のウェルで滅菌水で希釈された1ミリリットルあたり1.25ミリグラムの少なくとも1ミリリットルの冷分散酵素をピペットで移します。12ウェルプレートの第1、第3、および第4ウェルのPBSをピペットします。

また、氷上の1.5ミリリットルのチューブに0.05%トリプシンの1ミリリットルをピペットで移します。IACUCガイドラインに従ってe10.5時限妊娠マウスを安楽死させた後、腹部に70%エタノールを噴霧して領域を洗浄します。その後、ハサミと鉗子を使ってマウスの生殖器部分をV字切開し、横隔膜まで切開を続けます。

子宮の最上部の外側部分を切開し、臓器をマウスから上向きに引き離し、この切開を生殖器領域までたどってから反対側で繰り返すことにより、子宮を慎重に切除します。切除した子宮を冷たいPBSを入れた10センチのシャーレに入れます。光学解剖顕微鏡の下で、ペトリ皿を置き、各胚の間に2つの鉗子を置き、卵黄嚢から組織を剥がすことにより、子宮組織を慎重に開きます。

鉗子で卵黄嚢を優しくつかみ、新鮮で冷たいPBSを入れた10センチメートルのシャーレに胚を入れて胚を移植します。ペトリ皿を氷の上に置きます。次に、10センチのペトリ皿の蓋に複数のPBSドロップを置きます。

これらの液滴を使用して、解剖中に胚を移植し、胚外組織を除去して視認性を確保します。胚をPBSドロップに移し、残りの胚が氷上のPBSに留まっている間、鉗子を使用して卵黄嚢から静かに取り出します。鉗子を使用して胚を新しいPBSドロップに移動する前に頭を取り外し、組織に損傷を与えることなく胚を軽くすくい取ります。

新しいPBSドロップで、鉗子を使用して4つの手足の芽を取り除きます。四肢のつぼみがあった開口部に鉗子を置き、前方の最も外側の組織のみを優しく引き裂きます。胚を回転させ、後肢の芽で停止しながら後方向に繰り返します。

この時点で、消化管が見えるはずです。胃腸管の後部領域はわずかに曲がっています。この曲がりの後ろに、胃腸管と体壁の脊椎領域との間の開口部に鉗子を挿入します。胃腸管を切り離し、心臓領域が接続する最も前方の領域に到達するまでゆっくりと上向きに作業します。

次のステップでは、膵臓が非膵臓組織で汚染されないように、培養物の周囲組織を避けることが重要です。ただし、膵臓の芽全体をつかまないと、膵臓の数とサイズが損なわれます。胃腸管を新鮮なPBS液滴に移します。

胃腸管を囲む外側組織を引き続き取り除きます。この外側の組織を取り除くと、膵芽は肝臓の芽の後方、胃と腸の間に視覚化できます。次に、鉗子を取り、腸の突き出た芽の下の組織をそっとつまみ、膵臓の芽を少し持ち上げます。

つぼみが腸につながる部分をつまんだ後、つぼみを分離します。新しいPBSバブルで1回洗ってから、つぼみを12ウェルプレートの最初のウェルに移し、氷の上でPBSを冷やします。すべての芽が胚から採取され、12ウェルプレートの最初のウェルに配置されるまで繰り返します。

次に、12ウェルディッシュを光学解剖顕微鏡の下に置きます。後で分割率を計算するために、正常に解剖された膵芽の数を数えます。キャピラリーチューブを取り付けた状態で、ろ過された1000マイクロリットルのピペットチップをピペットに入れます。

キャピラリーチューブを火炎滅菌し、チューブに曲がりを作らせて使いやすくします。キャピラリーを使用して、つぼみを冷たいディスパーゼ溶液を含む2番目のウェルに2分間移してから、きれいなPBSを含む3番目のウェルに移します。つぼみを上下にピペッティングし、きれいなPBSを含む4番目のウェルに移します。

最後に、毛細血管装置を使用して、芽を0.05%トリプシンを含む1.5ミリリットルのチューブに移します。予め温めた摂氏37度のシェーカーにチューブを置き、1, 500 RPMで4〜5分間振とうします。約10秒間ボルテックスした後、すぐにチューブを遠心分離機に入れ、200gで5分間回転させます。

遠心分離した細胞を乱さないように、約50マイクロリットルを除くすべての溶液を慎重に除去します。400マイクロリットルの器官形成培地で遠心分離した細胞に収集された芽ごとに、ボルテックスを3回パルスし、低付着96ウェルプレートのウェルあたり100マイクロリットルをプレート化し、芽を1対4の比率で分割します。顕微鏡で確認し、解離した細胞が自由に浮遊している様子を観察できます。

次に、培養皿を5%の二酸化炭素を入れた摂氏37度のインキュベーターに、中速でロッカーに置きます。子宮角からe10.5でマウス胚を注意深く解剖すると、PBSで損傷を受けていない胚が得られ、さらなる解剖が可能になります。消化管は胚から効率的に除去することができ、腸と胃の接合部にある背側の膵芽の識別を可能にします。

器官形成培地では、これらの自由に浮遊する足場のない細胞が自己組織化して三次元膵臓に組織化し、培養中で少なくとも10日間成長して持続します。プロテインキナーゼC活性化剤を高濃度で適用すると、発生中の膵臓の形態が変化し、上皮細胞が緩やかに結合し、分岐が増加します。さらに、トランスジェニック動物を使用することで、細胞が分化する過程をリアルタイムで可視化することができます。

膵臓間葉組織と膵臓上皮細胞との関連を評価するために、各組織のマーカーに対して免疫染色を行うことができます。内分泌マーカーと核を用いた管マーカーの免疫染色により、膵臓骨の多系統形成が明らかになります。膵臓前駆細胞マーカーと共染色された間葉マーカーは、間葉が膵臓を包み込むことを示しています。

ベータ細胞の発生は、上皮マーカーとベータ細胞マーカーを染色することで明らかになります。定量的PCR解析により、前駆遺伝子や分化マーカーなど、前駆細胞や分化細胞の転写産物を評価することができます。一度習得すると、このテクニックは、適切に実行されれば、準備時間を含めて約1時間で行うことができます。

このビデオを見た後、10.5マウスから膵臓組織を採取して膵臓を生成するための解剖を行う方法についてよく理解しているはずです。この手順を試みる際には、胚から消化管を慎重に取り除くことを覚えておくことが重要です、そうしないと膵芽を見つけるのが非常に困難になります。この手順に続いて、GSISやELISAなどの他の方法を実行して、グルコース刺激後にどれだけのインスリンまたはC-ペプチドが生成されるかなどの追加の質問に答えることができます。

開発後、この技術は、低分子を用いたPKC活性化の形態学的影響を探求する道を開きました。このシステムをさらに実装して、発現の転写因子の影響を研究し、さらに重要なエピスタシス実験を行う方法。