リーシュ マニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

この手法の全体的な目標は、翻訳中の個々のmRNAとポリソームの関与を研究することです。ポリソームプロファイリングは、mRNAとリボソームおよびポリソームとの関与を研究するための強力な技術です。この技術は、タンパク質合成の調節、翻訳活性化、および抑制の研究にとって重要です。

ここでは、私たちのチームは、ポリソーム分画の技術と、3つの生物を例にした画分の分析を紹介します。寄生虫リーシュマニアメジャー、培養ヒト細胞、および動物組織。このアプローチは、ライセート調製、ショ糖勾配調製と超遠心分離、ポリソーム分画、サンプル収集の4つの主要なステップで構成されています。

分数の分析。さまざまな供給源からの細胞を採取、洗浄、溶解バッファー中で、針またはDounceホモジナイザーを通して溶解します。遠心分離は、ライセートを清澄化する細胞破片を除去するために使用されます。

連続的なスクロース勾配は、グラジエントメーカーで10%と50%のスクロース溶液を混合することによって形成されます。ライセートはグラデーションの上部にロードされます。超遠心分離は、異なる数のリボソームに関連するmrNAを分離します。

これは、分画中にUV検出器によって監視され、明確な吸収剤スペクトルを形成します。ライセート調製。ライセートの調製には、供給源によっていくつかの違いがあります。

ライセート調製後の手順は、サンプルの起源に関係なく同じです。リーシュマニアの主要な細胞質溶解物製剤。リーシュマニアの主要細胞を30ミリリットルの培地に100, 000細胞/ミリリットルの密度で入れます。

このステップは、バイオセーフティキャビネットで行われます。リーシュマニア培養液を入れたフラスコをインキュベーターに入れ、対数期まで摂氏27度で細胞を増殖させます。通常、成長には約2日かかります。

リーシュマニアの主要細胞は顕微鏡で簡単に見ることができます。シクロヘキシミドを成長したリーシュマニア培養物に添加し、最終濃度を100マイクログラム/ミリリットルにすることで、翻訳されたmRNA上のリボソームを停止させます。細胞をインキュベーターに27°Cで10分間戻します。

シクロヘキシミド処理が完了した後、細胞を50ミリリットルの円錐管に移し、それを1,800gで8分間紡糸する。上清を捨てます。細胞を30ミリリットルのpbsで洗浄し、遠心分離します。

上清を捨て、細胞を1ミリリットルのpbsに再懸濁します。細胞のアリコートを取り、ホルムアルデヒド溶液と混合します。次に、血球計算盤で細胞をカウントします。

必要な数の細胞をマイクロフュージチューブに移します。細胞を1,800gで摂氏4度で8分間回転させます。次に、上清を捨てます。

細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤とRNAsinを含む1ミリリットルの溶解緩衝液に再懸濁します。細胞を23ゲージの針に3回通します。針を通過した後、溶解液は透明になります。

11,200gで4°Cで10分間遠心分離し、溶解物を清澄化します。清澄化したライセートを新しいマイクロチューブに移し、ショ糖勾配超遠心分離まで氷上に保ちます。培養ヒト細胞からの細胞質溶解物調製。

インキュベーター内の大きなプレートでHeLa細胞を摂氏37度、CO2を5%で増殖させます。成長したHeLa細胞にシクロヘキシミドを最終濃度100μg/mLまで添加し、翻訳されたmRNA上のリボソームを停止させます。細胞を摂氏37度で10分間インキュベートし、5%CO2で培養します。

中程度に吸引し、冷たいPBSで氷の上でプレートを2回洗います。500マイクロリットルの溶解バッファーをプレートに加え、細胞を掻き取ります。溶解した細胞をマイクロチューブに移します。

細胞を23ゲージの針に3回通します。11, 200 gで8分間遠心して、ライセートを透明化します。遠心分離後、氷上でチューブを動かし、上清を新しいチューブに移します。

アリコートを取って希釈し、ナノドロップを使用して260ナノメートルの吸光度を測定します。複数のサンプルがある場合は、ライセートを同じ光学濃度に調整し、ショ糖勾配超遠心分離までサンプルを氷上に保ちます。マウス精巣からの細胞質溶解物調製。

マウスの精巣を解剖します。アルブゲニアの内膜に小さな切開を行い、精巣の精細管を収集し、それらを5ミリリットルのpbsを含む円錐形のチューブに移します。ティッシュを激しく混ぜます。

そして、ティッシュを氷の上に5分間落ち着かせます。バッファーを取り出し、pbsでさらに2回洗浄します。精細管を2ミリリットルのチューブに移し、500gで1分間スピンダウンします。

上清を取り除きます。500マイクロリットルの溶解バッファーを尿細管に加え、ピペットを使用して組織を破壊します。懸濁液を少量のダウンスホモジナイザーに移します。

を7〜8回ストロークして組織を破壊します。ライセートをマイクロ遠心チューブに移します。サンプルを12, 000gで摂氏4度で8分間遠心分離し、ライセートを除去します。

上清を新しいチューブに移し、氷の上に保ちます。その後、ショ糖勾配の調製を進めます。ショ糖勾配の調製。

超遠心チューブをマイクロブロックに挿入し、ブロックの上層部に沿って線を引きます。次に、チューブを安定したラックに移します。10ミリリットルのシリンジを取り、レイヤリングデバイスを取り付け、シリンジに10%スクロース溶液を入れます。

ショ糖溶液がマークに達するまで、超遠心チューブの底で静かに放出します。別のシリンジに50%スクロース溶液を入れ、その層状化装置を10%スクロース層からチューブの底に慎重に挿入します。スクロース溶液を下からチューブのマークに達するまで穏やかに放出します。

次に、付属のキャップでチューブを密封します。ショ糖のグラデーションを準備するには、グラデーションメーカーデバイスの電源を入れます。次に、上ボタンまたは下ボタンを使用してプレートを水平にし、完了を押します。

プレートを水平にした後、グラディエーターを押します。グラデーションメニューのリストに移動し、SW41ローターを選択します。次に、目的のショ糖勾配を選択します。

使用を押します。マグネットベースチューブホルダーをグラジエントメーカーに置きます。次に、チューブをホルダーに移します。

最大6つのグラデーションを同時に準備できます。実行を押します。グラジエントメーカーは、プログラムの速度と角度でチューブを回転させ、線形グラディエントを形成します。

グラデーションの準備には数分しかかかりません。プロセスが完了したら、チューブをラックに置きます。スクロース勾配のある超遠心チューブの上部からサンプル量と同じ容量を取り出します。

500マイクロリットルのライセートを上に慎重にロードします。チューブをローターバケットに入れ、バランスを取ります。摂氏4度で2時間、260, 000 gで遠心分離します。

ポリソーム分画とサンプル収集。超遠心分離後、チューブをローターバケットに氷の上に置きます。フラクションコレクターとフラクショネーターをオンにします。

フラクショネーターメニューのスキャンをクリックします。収集チューブ付きのラックをフラクションコレクターに入れます。分留器の側面にあるリンスリザーバーを脱イオン水で満たします。

すすぎキーを10秒間押して、ポンプをすすぎます。水で満たされたシリンジ付きのリンスアダプターをピストンに取り付けて、キャリブレーションを行います。コンピューターでフラクショネーターソフトウェアを開きます。

キャリブレーションを押します。デフォルト設定を使用し、シリンジから水を注入する準備ができ Ok.Be を押します。[OK]を押してキャリブレーションを行います。

すぐに次の5秒間水を注入し始めます。「ゼロキャリブレーションが完了しました」という記号が表示されます。シリンジでリンスアダプターを取り外し、分留器のピストンに先端を取り付けます。

真鍮製エアバルブを開き、エアキーを10秒間押して、エアチューブとフローセルを乾燥させます。エアバルブを閉じます。ローターバケットからグラジエントチューブを取り出し、ラックに置きます。

チューブホルダーキャップをチューブの上部に取り付け、チューブを慎重にチューブホルダーに移動してロックします。ホルダーをピストンの下に置きます。多くの場合、ポリソームバンドは目で見ることができます。

分数と体積に必要な設定を紹介します。ファイルに名前を付けて[OK]を押し、[グラフ]ボタンに移動します。次のウィンドウで、スキャンの開始を押します。

設定が表示され、Okを押しますコレクターは側溝から最初の分数に移動し、ピストンはチューブに移動します。ピストンが勾配の頂点に達すると、選択した速度まで減速し、フラクションが収集されます。通常、それぞれ500マイクロリットルで24個のフラクションを収集します。

完了すると、ピストンはグラジエントチューブから移動します。真鍮製のエアバルブを開きます。フラクショネーターのエアキーを押して、最後のフラクションを取得します。

実行の最後に、グラディエントの吸光度プロファイルが表示されます。分数の分析。得られた画分は、RNAおよびタンパク質分析に使用できます。

RNAは、電気泳動とノーザンブロットで解析するか、cDNA産生に使用した後、RT-qPCR反応で個々のmRNAとポリソームとの関連を解析することができます。次世代シーケンシングは、トランスクリプトームスケールでのmRNAの翻訳状態の解析に利用できます。ポリソーム画分のタンパク質分析では、タンパク質をトリクルリセジン酸で沈殿させて濃縮します。

次に、タンパク質をウェスタンブロッティングまたは質量分析法でプロテオームレベルで分析します。業績。ここでは、ポリソーム分画の結果と3つの生物の例での分析を示します。リーシュマニア、培養ヒト細胞、マウス組織。

ポリソーム分画は、翻訳およびリーシュマニア専攻におけるSherpおよびTubulin mRNAとリボソームとの関連を研究するために使用されました。分画の吸光度グラフは、リボソームサブユニット40Sおよび60S、モノソーム80S、およびポリソームの典型的なピークを持つ明確な形状をしています。フラクションのアリコートを3つのグループにまとめました。

プレポリソーム、軽ポリソーム、および重ポリソーム。mRNAの相対レベルは、リアルタイムの定量的PCRによって研究されました。このデータは、Tubulin mRNAが活発に翻訳されていることを示唆しています。

それは主に重いポリソームと軽いポリソームに関連付けられていたからです。一方、Sherp mRNAの翻訳はあまり活発ではありません。これは主にプレポリソームおよびライトポリソームに関連して発見されました。

したがって、この実験は、翻訳における個々のmRNAの関与を研究する技術の能力を明確に示しています。この図は、HeLa細胞のポリソーム分画の典型的な吸光度グラフを示しています。タンパク質は、10%トリクロロ酢酸を沈殿させることにより濃縮した。

small subunit ribosomal protein RPS6およびlarge subunit ribosomal protein RPL11をWestern Blotで検出しました。それらの分布は、吸光度スペクトル上の明確なピークとよく相関していました。この図では、マウス精巣の分画ポリソームにおける電気泳動によるリボソームRNAの検出例を示しています。結論。

ポリソームプロファイリングは、個々のmRNAの翻訳状態の解析、リボソーム関連タンパク質の検査、さまざまな条件下でのさまざまなモデル生物の翻訳調節の研究に使用できる汎用性の高い手法です。