Name: リーシュ マニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: 学ぶポリソームプロファイリング法で、リーシュマニア・マジョールやマウス精巣など複数の生物におけるmRNA翻訳調節メカニズムを解析する技術です。超速遠心分離と分画収集により、タンパク質合成の翻訳活性を詳細に調査できます。

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著者はチン ・ リーのオーディオ録音との助けをありがちましょう。テキサス工科大学医療科学センターからスタートアップ資金によって支えられたし、神経科学研究と治療 (CTNT) のための卓越性のセンター A.L.K.; に PN CTNT 2017-05 AKHRJDHW を与える研究NIH グラントによって部分的に K.Z. ジェームス c. ハフマンとクリステン ・ r ・ デバカ R01AI099380 CISER (幹統合教育研究センター) 学者、プログラムによってサポートされていました。

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著者が明らかに何もありません。

ショ糖密度勾配によるポリソーム分別が RNA と結合し、タンパク質画分の分析は個々 の mRNAs または全体 translatome の並進状態だけでなく、並進を規定する蛋白質の要因の役割を分析するための強力な方法通常の生理や病気の状態の間に機械。Polysomal プロファイリングリーシュ マニア転写制御は主として不在、遺伝子発現制御が主に発生しますを含む trypanosomatids などの生物の翻訳制御の研究に特に適している手法は、します。中に翻訳します。
ここでは、3 つのモデルで使用されるポリソーム分別のプロトコルについて述べる:リーシュ マニア寄生虫、ひと培養細胞およびマウス組織。ポリソーム分別手順は本質的にこの試験で使用される異なった有機体のための同じただし、lysate の準備いくつかの違いがあります。リーシュ マニア原虫の細胞液体文化で育つし、セルがカウントされますように溶解前にグラデーションの読み込みと同じ遠心分離によって収集されます。人間の細胞を洗浄し、直接板の上に分離できます。等しい荷重は、光学濃度に...

細胞の遺伝子発現制御は、転写、転写、翻訳のメカニズムによって制御されます。ディープの RNA シーケンスの進歩は、前例のないレベルでゲノム スケールで定常状態の mRNA のレベルの研究を許可します。しかし、最近の知見は、定常 mRNA レベルがない、常にタンパク質生産1,2と相関を明らかにしました。個々 のトラン スクリプトの運命は非常に複雑な内部/外部刺激、ストレスなどのような多くの要因によって異なります。タンパク質の生合成遺伝子発現の調節は、状況の変化にすばやく応答するために必要な式コントロールの別の層を提供します。ポリソーム (または"polyribosome") のプロファイリング、分離と積極的にリボソームの翻訳の可視化は、タンパク質合成の調節を研究する強力な方法です。最初の実験的応用は 1960 年代3に登場、ポリソームのプロファイリングは現在タンパク質翻訳研究4で最も重要なテクニックの 1 つ。単一の Mrna は、ポリソームの形成につながる 1 つ以上のリボソームで翻訳できます。成績証明書はシクロヘキシミド5リボソーム上停止することができ。、ショ糖勾配遠心6,7ポリソーム分別過程で Mrna はポリソームの別の番号を含むを分けることができます。,8,9. polysomal 分画の RNA 解析、により個々 の mRNAs の並進状態の変化の測定、ゲノム規模で、さまざまな生理的条件4,7,中10. メソッドは、5' UTR と 3' UTR シーケンス mRNA 訳し11の制御の役割を明らかにする、翻訳抑制12の Mirna の役割を調べる、リボソーム生合成13 の欠陥を明らかにも使用されています、および人間の病気14,15にリボソーム蛋白質の役割を理解します。過去 10 年間の中には、ヒトの疾患におけるその重要性を示す翻訳中に遺伝子発現の役割の拡大が浮上しています。がん、代謝における翻訳調節と神経変性疾患のための証拠は、圧倒的な15,16,17,18です。EIF4E 依存翻訳調節の調節不全に貢献するたとえば、自閉症関連の赤字15と FMRP14自閉症にリンクされている Mrna にリボソームの失速に関与しています。したがって、polysomal プロファイルは、複数の人間の病気の翻訳制御の欠陥を研究する非常に重要なツールです。
Polysomal 分数別の生理学的条件下での蛋白質の解析は、翻訳中のリボソームと関連因子の関数を暴き出します。ポリソーム プロファイリング手法は、酵母、哺乳類細胞、植物、原生動物10,19,20,21など多くの種で使用されています。原虫トリパノソーマリーシュ マニアなどの遺伝子発現の転写調節機構限定展示します。そのゲノムはプロモーター規制転写22を持たないコードする遺伝子クラスターに分類されます。代わりに、発達の遺伝子発現は主にタンパク質翻訳およびトリパノソーマ科種23,24で mRNA の安定性のレベルで制御されます。したがって、転写制御の不在で並進制御の理解はこれらの有機体のため特に重要です。Polysomal ・ プロファイリングは、リーシュ マニア25,26,27,28遺伝子発現の転写後調節を研究する強力なツールです。
現実では個々 の mRNAs レベルの検出の最近の進歩は時間 (RT qPCR) の量的な PCR とプロテオミクス技術と同様、次世代シーケンシングによるトランスクリプトーム、解像度、新しいレベルに polysomal プロファイルの利点をもたらします。これらのメソッドの使用は、ディープの RNA シーケンス細胞ゲノム規模での並進状態を監視するプロテオーム解析の併用による個々 の polysomal 分画の解析によってさらに拡張できます。これは、異なる生理学的および病理学的条件の下で翻訳を調節する新規分子プレイヤーの識別できます。ここでは、提案する 3 つのモデルで使用されるプロトコルをプロファイリング ユニバーサル ポリソーム: 原虫リーシュ マニア原虫、培養細胞、動物組織。異なった有機体、勾配条件の最適化、RNase 阻害剤の選択と本研究でポリソーム分数を分析する RT qPCR、西部のしみ、RNA の電気泳動の適用からのセル lysates の準備でのアドバイスを紹介します。

<table><tbody><tr><td>Instruments:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>グラジ</td>エントマスター <td>Biocomp Instruments Inc.</td><td>108</td><td></td></tr><tr><td>ピストングラジエント分留装置</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td>152</td><td></td></tr><tr><td>フラクションコレクター</td><td>Gilson, Inc.</td><td>FC203B</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop One</td><td></td></tr><tr><td>ニコン倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>ECLIPSE Ts2-FL/TS2</td><td></td></tr><tr><td>2720 サーマルサイクラー</td><td>ライフサイエンス社 Applied Biosystems by Life Technologies</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td>パナソニック ヘルスケア株式会社</td><td>MCO-170A1CUV</td><td></td></tr><tr><td>HERATHERMインキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>51028063</td><td></td></tr><tr><td>Biological Safety Cabinet, class II, type A2</td><td>NuAire Inc.</td><td>NU-543-400</td><td></td></tr><tr><td>Revco 冷凍庫</td><td>Revco Technologies</td><td>ULT1386-5-D35</td><td></td></tr><tr><td>ベックマン L8-M Ultracentifuge</td><td>ベックマン・コールター</td><td>L8M-70</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離</td>機 <td>エッペンドルフ</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機 ローター SW41</td><td>ベックマン・コールター</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>スイングバケットローター</td><td>エッペンドルフ</td><td>A-4-62</td><td></td></tr><tr><td>固定角ローター</td><td>エッペンドルフ</td><td>F-45-30-11</td><td></td></tr><tr><td>クオンツスタジオ 12K Flex リアルタイムPCRマシン 285880228</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4470661</td><td></td></tr><tr><td>TC20 自動セルカウンター</td><td>バイオ・ラッド</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>ハウサー・サイエンティフィック</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トライアックスソフトウェア&nbsp;</td><td>バイオコンプインスツルメンツ株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>材料:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>計数スライド、細胞カウンター用デュアルチャンバー</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>オープントップポリクリア遠心チューブ、(14 mm x 89 mm)</td><td>Seton Scientific</td><td>7030</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ、5 mL</td><td>BD</td><td></td><td></td>309646</tr><tr><td>BD シリンジ 3 mL23 ゲージ 1 インチ ニードル</td><td>BD</td><td>10020439</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta 定盤、14 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta 定盤、9 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 急流 90 mm フィルターユニット、500 mL、0.2 aPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 75 cm3 フラスコ</td><td>Thermo Scientific</td><td>130193</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 mL 円錐形遠心分離管</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizol LS</td><td>Ambion by Life Technologies</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1378-5KG</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ修正イーグルの中高グルコース (DMEM)</td> <td>シグマ</td><td>D6429-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td> <td>シグマ</td><td>F0926-50ML</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (P/S)</td> <td>シグマ</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物 (MgCl2x6H2O)</td><td>Acros Organics</td><td>AC413415000</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td> <td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 (NP-40)</td><td>Fluka (Sigma-Aldrich)</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>組換えルナシンリボヌクレアーゼ阻害剤</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム塩</td><td></td><td>Sigma H3993-1MU</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTAフリープロテアーゼ阻害剤</td><td>ロシュ・ダイアグノスティック</td>ス <td></td> 11836170001<td></td></tr><tr><td>グリコーゲン</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0551</td><td></td></tr><tr><td>ウォーター</td><td>シグマ</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>シクロヘキシミド</td><td>Sigma</td><td>C7698-1G</td><td></td></tr><tr><td>クロロホル</td><td>ム フィッシャー サイエンティフィック 194002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジチオトレイトール(DTT)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>BP172-5</td><td></td></tr>エ<tr><td>チジウムブロマイ</td>ドフィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>BP-1302-10</td><td></td></tr>エ<tr><td>チレンジアミン四酢酸二ナトリウム脱水(EDTA)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S316-212</td><td></td></tr>オプ<tr><td>ティメム</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ22600050</td><td></td></tr><tr><td>プロマイシン二塩酸塩</td><td>シグマ</td><td>P8833-100MG</td><td></td></tr><tr><td>スクロー</td><td>スフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S5-3KG</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA溶液</td><td>シグマ</td><td>T4049-100MLhgh</td><td></td></tr><tr><td>容量cDNA逆転写酵素キット</td><td>ライフサイエンス技術による応用バイオシステム</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>パワーSYBRグリーンPCRマスターミックスライフサイエンス</td>による<td>応用バイオシステム</td><td>4367659 HCl</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP26324</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム (KOH)</td><td>シグマ</td><td>221473-500G</td><td></td></tr><tr><td>抗 RPL11 抗体</td><td>アブカム</td><td>ab79352</td><td></td></tr><tr><td>リボソームタンパク質 S6 (C-8) 抗体</td><td>サンタクルーズ バイオテクノロジー インク</td><td>sc-74459</td><td></td></tr><tr><td>1xM199</td><td>Sigma</td><td>M0393-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>塩化リチウム</td><td>Σ</td><td>L-9650</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>ゲルローディングバッファー II</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM8546G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Thermo Scientific</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>トリクロロ酢酸 (TCA)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A322-100</td><td></td></tr><tr><td>スーパーシグナル ウェストピコ PLUS 化学発光基質</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>34580</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td> <td>シグマ</td><td>L5750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>フッ化フェニルメチルスルホニル (PMSF)</td> <td>シグマ</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy ミニキット</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 5&プライム;-三リン酸二ナトリウム塩水和物 (ATP)</td><td>シグマ</td><td>A1852-1VL</td><td></td></tr><tr><td>シトシン 5'-三リン酸二ナトリウム塩水和物 (CTP)</td><td>シグマ</td><td>C1506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>ウリジン 5'-三リン酸三ナトリウム塩水和物 (UTP)</td><td>シグマ</td><td>U6625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>グアノシン5'-三リン酸ナトリウム塩水和物(GTP)</td><td>Σ</td><td>G8877-250MG</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNAポリメラーゼ</td><td>NEB</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>ピロホシャターゼ</td><td>ΣI1643-500UN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スペルミジン</td><td></td><td>ΣS0266-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

リーシュ マニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

右金額は、適切なタイミングで適切なタンパク質発現正常な細胞機能と急速に変化する環境での生存の基礎であります。長い間、遺伝子発現研究は、転写レベルでの研究によって支配されていた。しかし、Mrna の定常状態レベルは蛋白質の生産と相関がない、Mrna の翻訳可能性は条件によって大きく異なります。リーシュ マニア原虫寄生虫のようないくつかの生物の蛋白質の表現は翻訳のレベルではほとんど規制されています。最近の研究は、その蛋白質の翻訳調節不全、代謝、がん、神経変性疾患や他の疾患に関連付けられて示した。ポリソームのプロファイリングは、タンパク質翻訳規則を研究する強力な方法です。それは個々 の mRNAs の並進状態を測定したり、ゲノム規模での翻訳を確認することができます。この手法の基本は、ポリソーム、リボソームのサブユニットと無料 Mrna 遠心分離、細胞質の中にショ糖密度勾配による溶解分離です。ユニバーサル ポリソーム プロファイル使用されるプロトコルで 3 つの異なるモデル原虫リーシュ マニア原虫、ひと培養細胞、動物組織を紹介します。リーシュ マニア原虫の細胞は懸濁液の自由に成長し、動物組織サンプルを表しますマウス精巣培養細胞付着性単分子膜の成長します。したがって、技術はこれらの源すべてに適応です。Polysomal 分画の分析のためのプロトコルには、個々 の mRNA のレベル Rt-qpcr、によってに、西部のしみとリボソーム Rna 電気泳動による解析によるタンパク質の検出が含まれています。メソッドは、分数の質量分析法による深い RNA シーケンスによってトランスクリプトームのレベルにリボソームの Mrna 協会の検討とリボソームのタンパク質の解析によってさらに拡張できます。このメソッドは、他の生物学的モデルに簡単に調整できます。

この研究では、3 つの異なるソースの polysomal のプロファイリング技術の応用について述べる: 寄生リーシュ マニア原虫、培養ひと細胞およびマウス精巣。リーシュ マニア原虫の細胞は自由に懸濁液中の液体媒体の成長、ひと培養細胞はプレートに付着性単分子膜の成長し、マウス精巣組織サンプルを表します。メソッドは、懸濁液、組織、または別の有機体からさまざまな種類および培養細胞の種類で自由に成長した細胞の他のタイプを簡単に調整できます。アプローチは、4 つの主要な手順で構成されています: ライセート調製、サッカロースの勾配の準備と遠心手順、ポリソーム分別およびサンプル コレクション画分の分析が続きます。さまざまなソースからの細胞は、収集および洗浄針や Dounce ホモジナイザーを通過に換散バッファーの分離します。遠心分離、ライセートを明らかに細胞の残骸を削除する使用されます。勾配分画法の方式は、図 1 aに表示されます。連続ショ糖密度勾配は、勾配メーカーで 10% と 50% の...

ポリソーム プロファイリング技術の全体的な目標は、タンパク質合成時に個々 の mRNAs のトランスクリプトーム Mrna 翻訳活性の分析です。メソッドは、タンパク質合成の制御、翻訳活性化と健康と複数の人間の病気の抑制の研究にとって重要です。

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

この手法の全体的な目標は、翻訳中の個々のmRNAとポリソームの関与を研究することです。ポリソームプロファイリングは、mRNAとリボソームおよびポリソームとの関与を研究するための強力な技術です。この技術は、タンパク質合成の調節、翻訳活性化、および抑制の研究にとって重要です。ここでは、私たちのチームは、ポリソーム分画の技術と、3つの生物を例にした画分の分析を紹介します。寄生虫リーシュマニアメジャー、培養ヒト細胞、および動物組織。このアプローチは、ライセート調製、ショ糖勾配調製と超遠心分離、ポリソーム分画、サンプル収集の4つの主要なステップで構成されています。分数の分析。さまざまな供給源からの細胞を採取、洗浄、溶解バッファー中で、針またはDounceホモジナイザーを通して溶解します。遠心分離は、ライセートを清澄化する細胞破片を除去するために使用されます。連続的なスクロース勾配は、グラジエントメーカーで10%と50%のスクロース溶液を混合することによって形成されます。ライセートはグラデーションの上部にロードされます。超遠心分離は、異なる数のリボソームに関連するmrNAを分離します。これは、分画中にUV検出器によって監視され、明確な吸収剤スペクトルを形成します。ライセート調製。ライセートの調製には、供給源によっていくつかの違いがあります。ライセート調製後の手順は、サンプルの起源に関係なく同じです。リーシュマニアの主要な細胞質溶解物製剤。リーシュマニアの主要細胞を30ミリリットルの培地に100, 000細胞/ミリリットルの密度で入れます。このステップは、バイオセーフティキャビネットで行われます。リーシュマニア培養液を入れたフラスコをインキュベーターに入れ、対数期まで摂氏27度で細胞を増殖させます。通常、成長には約2日かかります。リーシュマニアの主要細胞は顕微鏡で簡単に見ることができます。シクロヘキシミドを成長したリーシュマニア培養物に添加し、最終濃度を100マイクログラム/ミリリットルにすることで、翻訳されたmRNA上のリボソームを停止させます。細胞をインキュベーターに27°Cで10分間戻します。シクロヘキシミド処理が完了した後、細胞を50ミリリットルの円錐管に移し、それを1,800gで8分間紡糸する。上清を捨てます。細胞を30ミリリットルのpbsで洗浄し、遠心分離します。上清を捨て、細胞を1ミリリットルのpbsに再懸濁します。細胞のアリコートを取り、ホルムアルデヒド溶液と混合します。次に、血球計算盤で細胞をカウントします。必要な数の細胞をマイクロフュージチューブに移します。細胞を1,800gで摂氏4度で8分間回転させます。次に、上清を捨てます。細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤とRNAsinを含む1ミリリットルの溶解緩衝液に再懸濁します。細胞を23ゲージの針に3回通します。針を通過した後、溶解液は透明になります。11,200gで4°Cで10分間遠心分離し、溶解物を清澄化します。清澄化したライセートを新しいマイクロチューブに移し、ショ糖勾配超遠心分離まで氷上に保ちます。培養ヒト細胞からの細胞質溶解物調製。インキュベーター内の大きなプレートでHeLa細胞を摂氏37度、CO2を5%で増殖させます。成長したHeLa細胞にシクロヘキシミドを最終濃度100μg/mLまで添加し、翻訳されたmRNA上のリボソームを停止させます。細胞を摂氏37度で10分間インキュベートし、5%CO2で培養します。中程度に吸引し、冷たいPBSで氷の上でプレートを2回洗います。500マイクロリットルの溶解バッファーをプレートに加え、細胞を掻き取ります。溶解した細胞をマイクロチューブに移します。細胞を23ゲージの針に3回通します。11, 200 gで8分間遠心して、ライセートを透明化します。遠心分離後、氷上でチューブを動かし、上清を新しいチューブに移します。アリコートを取って希釈し、ナノドロップを使用して260ナノメートルの吸光度を測定します。複数のサンプルがある場合は、ライセートを同じ光学濃度に調整し、ショ糖勾配超遠心分離までサンプルを氷上に保ちます。マウス精巣からの細胞質溶解物調製。マウスの精巣を解剖します。アルブゲニアの内膜に小さな切開を行い、精巣の精細管を収集し、それらを5ミリリットルのpbsを含む円錐形のチューブに移します。ティッシュを激しく混ぜます。そして、ティッシュを氷の上に5分間落ち着かせます。バッファーを取り出し、pbsでさらに2回洗浄します。精細管を2ミリリットルのチューブに移し、500gで1分間スピンダウンします。上清を取り除きます。500マイクロリットルの溶解バッファーを尿細管に加え、ピペットを使用して組織を破壊します。懸濁液を少量のダウンスホモジナイザーに移します。ガラス乳棒を7〜8回ストロークして組織を破壊します。ライセートをマイクロ遠心チューブに移します。サンプルを12, 000gで摂氏4度で8分間遠心分離し、ライセートを除去します。上清を新しいチューブに移し、氷の上に保ちます。その後、ショ糖勾配の調製を進めます。ショ糖勾配の調製。超遠心チューブをマイクロブロックに挿入し、ブロックの上層部に沿って線を引きます。次に、チューブを安定したラックに移します。10ミリリットルのシリンジを取り、レイヤリングデバイスを取り付け、シリンジに10%スクロース溶液を入れます。ショ糖溶液がマークに達するまで、超遠心チューブの底で静かに放出します。別のシリンジに50%スクロース溶液を入れ、その層状化装置を10%スクロース層からチューブの底に慎重に挿入します。スクロース溶液を下からチューブのマークに達するまで穏やかに放出します。次に、付属のキャップでチューブを密封します。ショ糖のグラデーションを準備するには、グラデーションメーカーデバイスの電源を入れます。次に、上ボタンまたは下ボタンを使用してプレートを水平にし、完了を押します。プレートを水平にした後、グラディエーターを押します。グラデーションメニューのリストに移動し、SW41ローターを選択します。次に、目的のショ糖勾配を選択します。使用を押します。マグネットベースチューブホルダーをグラジエントメーカーに置きます。次に、チューブをホルダーに移します。最大6つのグラデーションを同時に準備できます。実行を押します。グラジエントメーカーは、プログラムの速度と角度でチューブを回転させ、線形グラディエントを形成します。グラデーションの準備には数分しかかかりません。プロセスが完了したら、チューブをラックに置きます。スクロース勾配のある超遠心チューブの上部からサンプル量と同じ容量を取り出します。500マイクロリットルのライセートを上に慎重にロードします。チューブをローターバケットに入れ、バランスを取ります。摂氏4度で2時間、260, 000 gで遠心分離します。ポリソーム分画とサンプル収集。超遠心分離後、チューブをローターバケットに氷の上に置きます。フラクションコレクターとフラクショネーターをオンにします。フラクショネーターメニューのスキャンをクリックします。収集チューブ付きのラックをフラクションコレクターに入れます。分留器の側面にあるリンスリザーバーを脱イオン水で満たします。すすぎキーを10秒間押して、ポンプをすすぎます。水で満たされたシリンジ付きのリンスアダプターをピストンに取り付けて、キャリブレーションを行います。コンピューターでフラクショネーターソフトウェアを開きます。キャリブレーションを押します。デフォルト設定を使用し、シリンジから水を注入する準備ができ Ok.Be を押します。[OK]を押してキャリブレーションを行います。すぐに次の5秒間水を注入し始めます。「ゼロキャリブレーションが完了しました」という記号が表示されます。シリンジでリンスアダプターを取り外し、分留器のピストンに先端を取り付けます。真鍮製エアバルブを開き、エアキーを10秒間押して、エアチューブとフローセルを乾燥させます。エアバルブを閉じます。ローターバケットからグラジエントチューブを取り出し、ラックに置きます。チューブホルダーキャップをチューブの上部に取り付け、チューブを慎重にチューブホルダーに移動してロックします。ホルダーをピストンの下に置きます。多くの場合、ポリソームバンドは目で見ることができます。分数と体積に必要な設定を紹介します。ファイルに名前を付けて[OK]を押し、[グラフ]ボタンに移動します。次のウィンドウで、スキャンの開始を押します。設定が表示され、Okを押しますコレクターは側溝から最初の分数に移動し、ピストンはチューブに移動します。ピストンが勾配の頂点に達すると、選択した速度まで減速し、フラクションが収集されます。通常、それぞれ500マイクロリットルで24個のフラクションを収集します。完了すると、ピストンはグラジエントチューブから移動します。真鍮製のエアバルブを開きます。フラクショネーターのエアキーを押して、最後のフラクションを取得します。実行の最後に、グラディエントの吸光度プロファイルが表示されます。分数の分析。得られた画分は、RNAおよびタンパク質分析に使用できます。RNAは、電気泳動とノーザンブロットで解析するか、cDNA産生に使用した後、RT-qPCR反応で個々のmRNAとポリソームとの関連を解析することができます。次世代シーケンシングは、トランスクリプトームスケールでのmRNAの翻訳状態の解析に利用できます。ポリソーム画分のタンパク質分析では、タンパク質をトリクルリセジン酸で沈殿させて濃縮します。次に、タンパク質をウェスタンブロッティングまたは質量分析法でプロテオームレベルで分析します。業績。ここでは、ポリソーム分画の結果と3つの生物の例での分析を示します。リーシュマニア、培養ヒト細胞、マウス組織。ポリソーム分画は、翻訳およびリーシュマニア専攻におけるSherpおよびTubulin mRNAとリボソームとの関連を研究するために使用されました。分画の吸光度グラフは、リボソームサブユニット40Sおよび60S、モノソーム80S、およびポリソームの典型的なピークを持つ明確な形状をしています。フラクションのアリコートを3つのグループにまとめました。プレポリソーム、軽ポリソーム、および重ポリソーム。mRNAの相対レベルは、リアルタイムの定量的PCRによって研究されました。このデータは、Tubulin mRNAが活発に翻訳されていることを示唆しています。それは主に重いポリソームと軽いポリソームに関連付けられていたからです。一方、Sherp mRNAの翻訳はあまり活発ではありません。これは主にプレポリソームおよびライトポリソームに関連して発見されました。したがって、この実験は、翻訳における個々のmRNAの関与を研究する技術の能力を明確に示しています。この図は、HeLa細胞のポリソーム分画の典型的な吸光度グラフを示しています。タンパク質は、10%トリクロロ酢酸を沈殿させることにより濃縮した。small subunit ribosomal protein RPS6およびlarge subunit ribosomal protein RPL11をWestern Blotで検出しました。それらの分布は、吸光度スペクトル上の明確なピークとよく相関していました。この図では、マウス精巣の分画ポリソームにおける電気泳動によるリボソームRNAの検出例を示しています。結論。ポリソームプロファイリングは、個々のmRNAの翻訳状態の解析、リボソーム関連タンパク質の検査、さまざまな条件下でのさまざまなモデル生物の翻訳調節の研究に使用できる汎用性の高い手法です。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

感染THP1細胞と寄生虫の救助や変態アッセイ...

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学ぶポリソームプロファイリング法で、リーシュマニア・マジョールやマウス精巣など複数の生物におけるmRNA翻訳調節メカニズムを解析する技術です。超速遠心分離と分画収集により、タンパク質合成の翻訳活性を詳細に調査できます。

リーシュマニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

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