Name: 多重遺伝子型及び質量分析法と臨床コホート研究でテスト候補遺伝子 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: 学ぶ多重遺伝子型解析と質量分析法を用いた臨床コホート研究における疾患関連遺伝子マーカーの検出手法。コスト効率と時間効率に優れた診断法として、遺伝学的研究や臨床診断への応用が期待されます。

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著者の謝辞があります。

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここでは、質量分析法による多重遺伝子型解析法を示します。代表的な結果は、MALDI-TOF 質量分析法4分析化学と材料表13に掲げると共に PCR を使用して生成されました。このプラットフォームでは、合計 40 時間以内 9 SNPs の 1,255 個人 11,295 遺伝子型をラボで生成されます。
生成し、食物アレルギーと独立した複製 phenotyped 探索臨床コホート研究における候補遺伝子IL13の SNP データの分析によって遺伝的仮説に答える手法の有用性を示す.プラットフォームは DNA の品質を下げるため比較的堅牢で、最小限の出発原料、唯一 10 の入力を必要とする ng。プロトコルで重要な手順次のとおりです: 最大多重アッセイに SNP 含める対象地域の成功したシングル PCR 増幅器の増幅成功を確保するためのアッセイ デザイン プロセスのトラブルシューティングの注意ヌクレオチド拡張子拡張反応と質量スペクトル データを...

人間の複雑な疾患の遺伝的変異が疾患感受性に貢献、これらの亜種の定量化は理解病因、治療レスポンダーの高リスク患者のグループを識別するために有用かもしれない。確かに、精密医療の約束は患者サブグループ1を識別するためにゲノム情報を利用したに依存しています。残念ながら、どこ疾患表現型の相当な遺伝的多様性、低浸透度と変数表現力によって支えられている、複雑な病気の生物学領域内コホート サイズ ゲノム全体小説的なアプローチのための要件候補者は、しばしば膨大2です。また、標的候補遺伝子アプローチから始まる疾患病因3に固有の遺伝子/経路について事前の仮説。経路解析ツールは、探検するために多数の候補経路を生成する標的遺伝子座の病態生理学を調査するため使用されます。ここで人間のコホート研究4に適した 1 つの試金と Snp の数百人に数十の調査を可能にする多重遺伝子型アプローチを紹介します。このアプローチは比較的高スループット、数百、数千の新規探索研究誘因する DNA サンプルや特定経路の調査を許可します。ここで説明する方法は、比較的迅速かつ安価な方法で識別リスク対立遺伝子および臨床特徴との関連付けに役立ちます。このプラットフォームは、微生物感染症7ひと乳頭腫ウイルス8スクリーニングおよび診断目的5,6と最近では非常に有利にされています。
調査の結果、すなわち遺伝子のセットを選択から始まるこのプロトコル、文献検索、または病気プロセスに関与の先験的な仮説によって通常決定対象地域。または、おそらく選択した探索ゲノム広い連合 (GWA) 研究の主要な団体としてレプリケーション。遺伝子セットから研究者はタグ SNPs の洗練されたリストを選択します。つまり、連鎖不平衡 (LD)、または地域での亜種間で相関が高い LD、ハプロタイプと呼ばれる中の Snp のグループの代表的な 'タグを SNP を識別するために使用されます。地域の高い LD 継承を意味します、SNPs がしばしば一緒に遺伝子型 1 つの SNP がハプロタイプですべての Snp で変化を表すために十分になるよう。また、フォロー アップ SNPs の決定的なリストから多くの地域、例えば場合。、GWA 研究のレプリケーションでは、このプロセス必要がありますされません。多重遺伝子型は増幅プライマー拡張プライマーの質量が異なるは、解釈を生成する製品の質量スペクトル、アッセイは、これらのターゲットの周り設計されなければなりません。これらのパラメーターは、多重遺伝子型分析設計ツールによって簡単に実装されます。このデザインから前方および逆のプライマーは、SNP を含むシーケンスを増幅して興味のマーカーをターゲットに使用されます。拡張プライマーを直接 SNPs に近位付 SNP に補足である単一、大量更新、'ターミネーター' ベースが追加されます。ターミネーター ベース DNA の拡張をできなくなります。ベースの質量の変更により、質量分析による検出を 1 つのベースが異なるフラグメント。ジェノタイピング化学を含むプレート質量分析プラットフォームに測定用チップに適用されます。適切な品質管理をシステムによって検出された生ジェノタイピング呼び出しに適用すると、データをエクスポートし、疾患表現型との関連付けをテストするのには統計分析に使用できます。

<table><tbody><tr><td>ゲノムDNA&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>1 &mu;5〜10ng/&muの濃度のLL</td></tr><tr><td>プライマー:フォワードおよびリバース増幅および伸長</td><td>IDT</td><td>-</td><td>プライマーの設計に関する原稿セクション1.2.1を参照</td></tr><tr><td>脱イオン水&nbsp;</td><td>例:ミリQ水&nbsp;</td><td>-</td><td>18.2 M&Omega;で脱イオン化。cm 抵抗率</td></tr><tr><td>ジェノタイピング試薬キット iPLEX Gold Chemistry 試薬セット&nbsp;</td><td>Agena Bioscience</td><td>#10148-2</td><td>には、2.2.1、2.3.1、2.4.2、チップおよび樹脂</td></tr><tr><td>PCRプレート(384ウェル)</td>の反応用のすべての試薬が含まれています<td>Abgene</td> <td>#ABGAB-1384</td><td>AbgeneのMassARRAYシステムプレートには、互換性のある</td></tr><tr><td>マイクロピペットの</td><td></td><td></td><td>シングルおよび8チャンネル</td></tr><tr><td>遠心分離機があります&nbsp;</td><td></td><td></td><td>384ウェルプレートに対応</td></tr><tr><td>2.2.4、2.3.2、2.4.3に詳述されているPCRプログラムに対応した</td><td>サーモサイクラー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ディンプル樹脂プレート&nbsp;</td><td>Agena Bioscience</td><td></td><td>6mg, 384-well</td></tr><tr><td>プレートローテーター&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassARRAY Analyzer 4 System</td><td>Agena Biosciences</td><td></td><td>MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization &ndash; time of flight) 質量分析計。</td></tr><tr><td>RS1000 ナノディスペンサー</td><td>Agena Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Assay Design Suite</td><td>Agena Biosciences</td><td></td><td>マルチプレックスジェノタイピングアッセイの設計に使用されるツール</td></tr><tr><td>Hot Start Taq</td><td></td><td></td><td>DNAポリメラーゼ酵素&nbsp;</td></tr><tr><td>樹脂&nbsp;</td><td>Agena Biosciences</td><td></td><td>iPLEXキット付属</td></tr></tbody></table>

多重遺伝子型及び質量分析法と臨床コホート研究でテスト候補遺伝子

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

複雑な病気の多くの場合疾患感受性に貢献する複数の一般的な遺伝子変異によって支えられています。ここでは、ジェノタイピング マルチプレックス アッセイ質量分析法を用いた臨床コホートで遺伝子経路の連合を調査するコスト効果の高いタグ単一ヌクレオチド多型 (SNP) アプローチについて述べる。例として食品アレルギー候補遺伝子座Interleukin13 (IL13) を調べた。このメソッドは、領域内の共有連鎖不平衡 (LD) を利用して効率的にカバレッジを最大化します。選択した LD SNPs、設計されています多重アッセイに同時に分析するまで 40 の異なる Snp の有効化費用対効果を高めます。ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) は単一のヌクレオチドの拡張子、ターゲット遺伝子を増幅するため使用され、amplicons マトリックス支援レーザー脱離/イオン化-時間 flight(MALDI-TOF) 質量分析装置を使用して測定されます。Raw 出力を厳格な品質管理の定義と切り取りトレードオフを使用してソフトウェアを呼び出す遺伝子で解析、確率が高い遺伝子型の決定しデータ分析のための出力します。

上記プロトコルを使用我々 は誤は食品アレルギーの場合とコントロール9のコホートにおける Th2 免疫遺伝子IL13の SNPs をタグ付け。関心領域内の遺伝的変異が食品アレルギー リスクを増加させるかどうかをテストするのには、祖先とその他の潜在的な共変量調整後のロジスティック回帰分析を行った。テーブル 109は、1 つのバリアント rs1295686 チャレンジで実績のある食物アレルギーに関連付けられていることを示し同じを使用してレプリケーション コホートにおけるこの協会多重遺伝子型アプローチを確認しました。2 つのコホートから結果のメタ分析は、FA (表 11)9 IL13の協会の強力な証拠を提供されています。我々 は遺伝子と推測、祖先有益な SNP マーカー パネルを使用して公開されたパネル<sup class="xref"...

複雑な人間の病気に貢献する遺伝的変異の同定機構を識別することができます。ここでは、候補者の遺伝子または遺伝子パスウェイ解析低コストでカバレッジを最大化、コホートに基づく研究に従う方法多重遺伝子型を示します。

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

この方法は、ヒトパピローマウイルスを含む疾患の転帰に関連する遺伝子マーカーの検出など、臨床診断および遺伝学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、費用対効果が高く、的を絞った、時間効率の高い診断方法であることです。この手順を開始するには、注文した凍結乾燥プライマーを分子グレードの水で再構成します。各マルチプレックスアッセイのフォワードプライマーとリバースプライマーをストックプライマーミックスに引き込み、各プライマーがゼロポイント5ミリモルの濃度で含まれるようにします。この後、テキストプロトコルに概説されているように、PCR用のマスターミックスを調製します。この混合物を384ウェルPCRプレートの各ウェルに4マイクロリットル加え、1マイクロリットルあたり5〜10ナノグラムの濃度で1マイクロリットルのゲノムDNAを加えます。プレートをプレートカバーで覆い、室温で200倍Gを1分間遠心分離します。次に、テキストプロトコルで説明されているようにPCRを実行します。1マイクロリットルのPCR産物と3マイクロリットルのローディングバッファーを2%アガロースゲルにロードします。100ボルトで45分間運転し、DNA増幅が成功したことを確認します。次に、テキストプロトコルで説明されているように、SAPマスターミックスを準備します。作りたてのSAPマスターミックスを2マイクロリットル、以前に実行したPCRプレートの各ウェルに加えます。1, 000倍Gで1分間短時間遠心分離します。次に、プレートをサーモサイクラーに戻します。サーモサイクラーを摂氏37度で40分間運転します。その後、摂氏85度で5分間、酵素を不活性化します。各プライマーの希釈係数を計算した後、各プライマーの決定された容量を組み合わせてプライマープールを構成します。必要に応じて水を加えて、このプールを希釈します。テキストプロトコルに概説されているように、ハイプレックスアッセイまたはロープレックスアッセイのいずれかのエクステンションマスターミックスを組み立てます。プレートの各ウェルに2マイクロリットルのエクステンションマスターミックスを加え、各ウェルの総容量を最大9マイクロリットルにします。1, 000倍Gで1分間短時間遠心分離し、プレートをサーモサイクラーに戻します。この後、各ウェルに16マイクロリットルの脱イオン水を追加し、ウェルあたり総容量を最大25マイクロリットルにします。6ミリグラムのレジンをディンプルレジンプレート全体に均等に塗布します。樹脂を室温で20分間乾燥させます。次に、レジンを反応プレートに塗布します。サスペンションミキサーを使用して、プレートを室温で5分間低速で回転させます。次に、プレートを3,200倍Gで5分間遠心分離して、樹脂がマススペクトルチップに付着しないようにします。プレートのサンプルレイアウトをシステムのソフトウェアインターフェースにアップロードします。分注システムを使用して、プレートからのジェノタイピング分析物混合物をジェノタイピングチップに適用します。チップをMALDI-TOFシステムにロードして、分析物混合物から質量スペクトルを生成し、プラットフォームのソフトウェアインターフェースを使用してそれを解釈します。この研究では、質量分析を使用してマルチプレックスジェノタイピングが達成されます。代表的なSNPデータは、食物アレルギーの表現型が付けられた発見臨床コホートの候補遺伝子IL13について生成および分析されます。1つの変異株であるrs1295686は、チャレンジで証明された食物アレルギーに関連しています。この関連性は、このプロトコルで実証されたマルチプレックスジェノタイピングアプローチを使用した複製コホートで確認されます。2つのコホートの結果のメタアナリシスは、IL13とFAとの関連についての強力な証拠を提供します。この手順を試行する際は、サンプルや試薬を汚染しないことが重要です。また、ピペッティングエラーを考慮するために、各PCRに10%マスターミックスを追加で調製することも重要です。この手順に続いて、遺伝子発現が同定された疾患関連遺伝子マーカーと相関しているかどうかなどの追加の質問に答えるために、リアルタイムPCRなどの他の方法を実行できます。開発後、この技術は、臨床診断と遺伝学の分野の研究者が患者コホートの疾患関連を探求する道を開きました。ジェノタイピング試薬やMALDI-TOFシステムを扱う際には危険な場合があり、この手順を実行する際には常に手袋や白衣の着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

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遺伝学

遺伝的関連は、多くの場合、機能レベルで解明されないままである。このメソッドは、転写されたSNPについてヘテロ接合体の細胞を分析することによって遺伝子発現の表現型に関連する遺伝子マーカーの効果を評価することを目的とする。技術は、アレル特異的なプライマー伸長産物を定量化するためにMALDI -...

遺伝的関連の機能的基準をテストするための対立遺伝子特異的遺伝子発現アッセイ

プロトコルは、大規模な遺伝子型決定を行うためにイルミナインフィニウムアッセイを使用することが記載されている。これらのアッセイは、確実に3日間で、個々のDNAサンプルの数百人を越えSNPの何百万人の遺伝子型を決定することができます。一度生成された、これらの遺伝子型は異なる疾患または表現型の様々な関連性をチェックするために使用することができる。...

大規模なSNPジェノタイピングアプリケーション用インフィニウムアッセイ

我々は、超並列「次世代」配列決定による臨床腫瘍標本における主要癌関連変異の検出のためのバーコードDNAライブラリーおよびその後のハイブリダイゼーションに基づくエクソンキャプチャの製造を記載し​​ている。標的エクソン配列決定は、低周波の変異を検出するための高感度を得、高スループット、低コスト、かつ深い配列カバーの利点を提供しています。...

エクソンキャプチャと超並列配列決定することにより腫瘍標本における体細胞遺伝子変異を検出する

腫瘍学検体の標的次世代シーケンシングのための統合システムが説明されています。このクロスプラットフォームシステムは、低品質および少量の腫瘍生検に最適化されており、低DNAインプットに対応し、十分に特徴付けられた多変量コントロールを含み、定量的な分析前品質管理手段によって通知される新しいバリアントコーラーを備えています。...

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

転写因子(TF)DNA結合に影響を与える非コード遺伝的変異を特定するための戦略的な計画とプロトコルを提示します。遺伝子型依存性TF...

機能電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を用いた非コーディング遺伝的変異体およびDNA親和性沈殿アッセイ（DAPA）のスクリーニング

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遺伝的変異のアミノ酸レベル信号対雑音解析によるバリアント病原性の可能性を決定します。

ここでは、患者の生体液(生体流体)に存在する循環DNAにおける腫瘍体細胞変異を検出するプロトコルを提示する。当社の液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)ベースの方法は、腫瘍変異アレーリン周波数(MAF)の定量化を可能にし、腫瘍応答の診断および時間的モニタリングに最小限に侵襲的な補体を促進する。...

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

この記事では、アンカーされた多重ポリメラーゼ連鎖反応ベースのライブラリー調製キットの使用について詳しく述べたり、臨床固形腫瘍サンプルにおける発生遺伝子融合を評価するための次世代シーケンシングが続きます。ウェットベンチとデータ分析の両方の手順について説明します。...

アンカー多重ポリメラーゼ連鎖反応を用いた腫瘍性遺伝子融合検出、次世代シーケンシング

このプロトコルは、半導体ベースの次世代シーケンシングプラットフォーム上での異数性に対する移植前遺伝子検査に必要なラボ内の全体的な手順を提示します。ここでは、全ゲノム増幅、DNA断片選択、ライブラリ構築、テンプレート調製、シーケンシング作業フローの詳細なステップを代表的な結果とともに紹介します。...

半導体ベースの次世代シーケンシングプラットフォームにおける異数性のための移植前遺伝子検査

私たちは、遺伝子改変マウスモデルで発生した腫瘍の治療標的と対応するヒト腫瘍の種類を同定および比較するために、ゲノム解析と機能的ゲノムスクリーニングを利用した種間比較腫瘍ゲノミクスアプローチを開発しました。...

悪性末梢神経鞘腫瘍のマウスモデルにおける治療標的を特定するための遺伝子プロファイリングおよびゲノムスケールドロップアウトスクリーニング

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多重遺伝子型及び質量分析法と臨床コホート研究でテスト候補遺伝子

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