多重遺伝子型及び質量分析法と臨床コホート研究でテスト候補遺伝子

この方法は、ヒトパピローマウイルスを含む疾患の転帰に関連する遺伝子マーカーの検出など、臨床診断および遺伝学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、費用対効果が高く、的を絞った、時間効率の高い診断方法であることです。この手順を開始するには、注文した凍結乾燥プライマーを分子グレードの水で再構成します。

各マルチプレックスアッセイのフォワードプライマーとリバースプライマーをストックプライマーミックスに引き込み、各プライマーがゼロポイント5ミリモルの濃度で含まれるようにします。この後、テキストプロトコルに概説されているように、PCR用のマスターミックスを調製します。この混合物を384ウェルPCRプレートの各ウェルに4マイクロリットル加え、1マイクロリットルあたり5〜10ナノグラムの濃度で1マイクロリットルのゲノムDNAを加えます。

プレートをプレートカバーで覆い、室温で200倍Gを1分間遠心分離します。次に、テキストプロトコルで説明されているようにPCRを実行します。1マイクロリットルのPCR産物と3マイクロリットルのローディングバッファーを2%アガロースゲルにロードします。

100ボルトで45分間運転し、DNA増幅が成功したことを確認します。次に、テキストプロトコルで説明されているように、SAPマスターミックスを準備します。作りたてのSAPマスターミックスを2マイクロリットル、以前に実行したPCRプレートの各ウェルに加えます。

1, 000倍Gで1分間短時間遠心分離します。次に、プレートをサーモサイクラーに戻します。サーモサイクラーを摂氏37度で40分間運転します。

その後、摂氏85度で5分間、酵素を不活性化します。各プライマーの希釈係数を計算した後、各プライマーの決定された容量を組み合わせてプライマープールを構成します。必要に応じて水を加えて、このプールを希釈します。

テキストプロトコルに概説されているように、ハイプレックスアッセイまたはロープレックスアッセイのいずれかのエクステンションマスターミックスを組み立てます。プレートの各ウェルに2マイクロリットルのエクステンションマスターミックスを加え、各ウェルの総容量を最大9マイクロリットルにします。1, 000倍Gで1分間短時間遠心分離し、プレートをサーモサイクラーに戻します。

この後、各ウェルに16マイクロリットルの脱イオン水を追加し、ウェルあたり総容量を最大25マイクロリットルにします。6ミリグラムのレジンをディンプルレジンプレート全体に均等に塗布します。樹脂を室温で20分間乾燥させます。

次に、レジンを反応プレートに塗布します。サスペンションミキサーを使用して、プレートを室温で5分間低速で回転させます。次に、プレートを3,200倍Gで5分間遠心分離して、樹脂がマススペクトルチップに付着しないようにします。

プレートのサンプルレイアウトをシステムのソフトウェアインターフェースにアップロードします。分注システムを使用して、プレートからのジェノタイピング分析物混合物をジェノタイピングチップに適用します。チップをMALDI-TOFシステムにロードして、分析物混合物から質量スペクトルを生成し、プラットフォームのソフトウェアインターフェースを使用してそれを解釈します。

この研究では、質量分析を使用してマルチプレックスジェノタイピングが達成されます。代表的なSNPデータは、食物アレルギーの表現型が付けられた発見臨床コホートの候補遺伝子IL13について生成および分析されます。1つの変異株であるrs1295686は、チャレンジで証明された食物アレルギーに関連しています。

この関連性は、このプロトコルで実証されたマルチプレックスジェノタイピングアプローチを使用した複製コホートで確認されます。2つのコホートの結果のメタアナリシスは、IL13とFAとの関連についての強力な証拠を提供します。この手順を試行する際は、サンプルや試薬を汚染しないことが重要です。また、ピペッティングエラーを考慮するために、各PCRに10%マスターミックスを追加で調製することも重要です。

この手順に続いて、遺伝子発現が同定された疾患関連遺伝子マーカーと相関しているかどうかなどの追加の質問に答えるために、リアルタイムPCRなどの他の方法を実行できます。開発後、この技術は、臨床診断と遺伝学の分野の研究者が患者コホートの疾患関連を探求する道を開きました。ジェノタイピング試薬やMALDI-TOFシステムを扱う際には危険な場合があり、この手順を実行する際には常に手袋や白衣の着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。