黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムに及ぼす 5-アミノレブリン酸による光線力学療法を勉強する体外モデル

この実験の全体的な目標は、黄色ブドウ球菌のバイオフィルムに対する 5-アミノレブリン酸または ALA を介した光線力学療法の抗菌効果を評価することです。この方法は、バイオフィルム感染を制御するための代替治療として光線力学細胞修復をどのように使用できるかという細菌バイオフィルム分野の重要な質問に答えることができます。この手順の利点は、最小限の調整で他の細菌に使用できる可能性があることです。

96ウェルプレートでバイオフィルムを生成するには、まず、37°Cのインキュベーターで、トリプトン大豆ブロスまたはTSB、培地の5ミリリットルを含む個々の14ミリリットルの丸底チューブで臨床株培養を形成する300°Cのマイナス80°CのThOD黄色ブドウ球菌USAを300°Cに接種し、一晩振とうします。培養物が固定相に達したら、細菌細胞を遠心分離し、ペレットとPBSを1ミリリットルの濃度あたり10〜9番目のコロニー形成単位の2倍に再懸濁します。これらの細菌懸濁液を1対200の比率で希釈し、TSB培地にゼロポイント5%グルコースを添加し、ポリスチレン細胞培養処理済み96ウェルマイクロプレートで実験グループごとに1ウェルあたり3ウェルにウェルあたり200マイクロリットルの細菌細胞をシードし、摂氏37度で24時間インキュベーションし、酸素で、 振らずに。

翌日、バイオフィルムを乱さずにPBSでウェルを3回やさしく洗います。次に、調製したばかりのALA200マイクロリットルを適切な実験ウェルに加え、プレートを摂氏25度に1時間置いて光から保護します。次に、100ミリワット/平方センチメートルの光強度で発光ダイオードをプレートに1時間照射します。

光線療法治療の最後にグループあたりの生存細菌の数を数えるには、PBSで各ウェルを3回優しく洗浄して、非接着性細胞を取り除きます。次に、ピペットチップを使用して、各ウェルの底から付着した細菌をこすり落とします。実験条件ごとに各グループの細胞を1つのエッペンドルフチューブに引き込み、遠心分離によって細胞をペレット化します。

ペレットを0.25%パンクレアチン酵素とPBSの1ミリリットルに再懸濁し、摂氏37度で90分間インキュベートした後、別の遠心分離を行います。ペレットを200マイクロリットルのPBSに再懸濁し、各グループで1〜10回の段階希釈を行い、5マイクロリットルの段階希釈サンプルを個々のトリプトン大豆寒天プレートに加えます。次に、プレートを摂氏37度で16時間インキュベートし、グループごとの細菌コロニーの数を数えます。

共焦点レーザー走査型顕微鏡法でバイオフィルムを評価するには、示されているようにバイオフィルムを生成して照射します。照射したバイオフィルムをPBSで洗浄し、生細胞と死細胞をそれぞれ1ミリリットルの緑色蛍光核および染色体原核細胞膜透過性染料と1ミリリットルの1マイクロモルヨウ化プロピジウムで染色します。20分後、余分な汚れを取り除き、1.4NAの63倍の油浸対物レンズの下で共焦点レーザー走査型顕微鏡でバイオフィルムを画像化します。

バイオフィルム細菌の生存率は、ALA光線療法の二重治療後、対照の単一または未治療のバイオフィルム細菌の生存率および試験された4つの株すべてと比較して低下します。共焦点レーザー走査型顕微鏡によるバイオフィルムの可視化は、この発見を裏付けており、ALA光線療法の二重治療群では、ヨウ化プロピジウム陽性の細胞のほとんどが立っていることが観察されました。この手順を試みる際には、ALA処理された細菌全体の操作は暗闇で行う必要があり、形成されたバイオフィルムを乱さないように材料のバイオフィルムを優しく取り扱う必要があることを覚えておくことが重要です。

このメッセージは、細菌感染分野の研究者がin vitroで細菌バイオフィルムに対する光線力学療法の抗菌効果を調査するために適用できます。