超低入力ヒトゲノム単一 Tardigrade の標本からのライブラリの準備

このプロトコルの目標は、クマムシと呼ばれる微視的な生物のゲノムを配列決定することです。私たちは、クマムシHypsibius dujardiniのゲノムを、50ピコグラムという低いゲノムDNAを持つ単一の標本から全ゲノム応用で解読する方法を確立しました。1匹のクマムシを分離した後、抗生物質と目視検査を使用して細菌汚染を最小限に抑えます。

また、2つの均質化方法も利用しています。まず、C.elegansで最も一般的に使用されるのは、凍結融解サイクルを使用し、次に、ピペットチップでクマムシを手動で粉砕することです。次に、DNAを使用してシーケンシングライブラリを構築し、MiSeq機器でシーケンシングします。

プロトコルの全体的な概要。1個体を単離した後、均質化のために3回の凍結融解サイクルにかけます。ゲノムDNAを抽出および精製し、超音波処理により断片化します。

次に、シーケンシングライブラリを構築し、ライブラリサイズ分布を検証した後、シーケンシング装置でシーケンシングします。90 mmのプラスチック培養皿に蒸留水を溶媒として使用して2%アガロースゲルを調製し、蒸留水で10 mmの1%ペニシリンストレプトマイシンを調製します。ゲルは、18度に設定されたインキュベーターで2〜3週間保存できます。

クマムシを1匹集めて準備した寒天プレートに置き、蒸留水で2〜3回洗って残りの粒子を取り除きます。細菌汚染を除去するために、単一のクマムシをペニシリンストレプトマイシン抗生物質に2〜6時間置き、P10ピペットを使用して除染した動物を清潔なスライドグラスに置きます。.クマムシを顕微鏡で500倍に拡大して観察し、細菌が残っていないことを確認します。

最大5マイクロリットルの液体が入ったP10ピペットを使用して個を採取し、低結合のPCRチューブに入れ、余分な液体をできるだけ取り除きます。均質化とDNA抽出。動物を均質化してゲノムDNAを得るには、以下のいずれかの方法があります。

凍結融解サイクルによる均質化。ステップ2.5の直後に、クマムシを含むPCRチューブに100マイクロリットルの溶解バッファーを追加します。PCRチューブを液体窒素に10分間入れ、ヒートブロックに移し、37°Cに10分間温めます。

この手順を 3 回繰り返します。手動破砕。実体顕微鏡下で、動物をPCRチューブ壁に押し付けてP10ピペットチップで個体を粉砕し、直ちに100マイクロリットルの溶解緩衝液を添加する。

室温で30分間インキュベートし、溶解が起こるようにします。溶解混合物の全容量をきれいな1.5ミリリットルの低結合マイクロチューブに移します。100マイクロリットルの溶解バッファーを低結合PCRチューブに加えると、ホモジナイズに使用され、空になりました。

そしてピペッティング後、混合物を1.5低結合マイクロチューブに移します。この手順を 2 回繰り返します。低結合性PCRチューブに300マイクロリットルの溶解バッファーを加え、ピペッティング後、混合物を1.5ミリリットルの低結合性マイクロチューブに移します。

コレクションチューブに入れたスピンカラムに合計600マイクロリットルの溶解混合物を加え、10, 000Gで1分間遠心分離します。フロースルーをカラムに再適用し、10、000Gで1分間遠心分離します。このステップは、ゲノムDNAのほとんどがカラムに結合していることを確認するために重要です。

スピンカラムに500マイクロリットルの洗浄バッファーを加え、10, 000Gで1分間遠心分離します。スピンカラムをきれいな1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。スピンカラムに20マイクロリットルの10ミリモルのファーストACLを塗布し、室温で5分間待ちます。

10, 000 G で 1 分間遠心分離します。希釈バッファーは、実験室調製酵素に干渉するため、EDTAを含んではなりません。スピンカラムにフロースルーを再適用し、室温で5分間インキュベートした後、10, 000 G.Sequencingライブラリ構築で1分間遠心分離します。

DNA断片化。15マイクロリットルのゲノムDNA溶出液をDNA断片化のために15マイクロリットルのマイクロチューブに移し、卓上遠心分離機を使用して1分間遠心分離します。ゲノムDNAを550塩基対にフラグメント

スルーピペッティング後、10マイクロリットルの断片化されたDNA混合物を清潔で低結合のPCRチューブに移します。実験はここで停止できます。DNAを4度またはマイナス20度で保存します。

シーケンシングライブラリの構築。以下の手順では、DNAのインプットが少ないため、指定されたキットを使用することが絶対に重要です。必要な試薬をメーカーのプロトコルに従って調製し、シーケンシングライブラリを一切変更せずに構築します。

ライブラリー増幅混合物をライブラリー合成混合物に適用した後、サーマルサイクラーでPCR反応を行います。PCR反応は図のように実施した。PCR反応の精製。

50マイクロリットルの磁気ビーズとピペットを10回加え、卓上マイクロ遠心分離機で短時間遠心分離します。室温で2分間インキュベートします。磁気スタンドで5分間、または溶液が完全に透明になるまでインキュベートし、上清を取り除きます。

メーカーのプロトコルに従ってください。ペレットを乱さずに上清を新しい低結合性PCRチューブに移します。DNAの品質チェックと定量、およびシーケンシング。

DNAライブラリーサイズ分布の検証。3マイクロリットルのサンプル水と1マイクロリットルのシーケンシングライブラリを加え、ボルテックスで1分間十分に混合し、卓上遠心分離機で短時間遠心分離します。電気泳動を行い、関連ソフトウェアを使用してライブラリサイズ分布を検証します。

メインフラグメントのピークは、約300〜1,000塩基対の範囲に広くなければなりません。DNA定量。796マイクロリットルの溶液バッファーと4マイクロリットルの蛍光試薬を加え、十分に混合します。

190マイクロリットルの作業溶液を2本のアッセイチューブに、197マイクロリットルを1本のアッセイチューブに分注します。190マイクロリットルのワーキング溶液を含む各アッセイチューブに、既知の濃度のDNAを含む10マイクロリットルの標準試料を添加し、調製したライブラリの3マイクロリットルを197マイクロリットルのワーキング溶液を含むアッセイチューブに加えます。一時的に渦巻き、卓上遠心分離機で遠心分離します。

3マイクロリットルの設定で蛍光光度計を使用してDNAを定量します。DNAライブラリーのシーケンシング。シーケンシングライブラリは、製造元のプロトコルに基づいて調製します。

試薬カセットとフローセルをシーケンシング装置にセットし、メーカーのプロトコルに従ってシーケンシングの実行情報を入力します。シーケンシングを実行します。表示された結果。

高品質のDNA抽出における汚染物質の曝露は、私たちのプロトコルの重要なポイントであることに変わりはありません。それらが汚染物質であるかどうかを視覚的に調べるために、クマムシをペニシリンとストレプトマイシンである抗生物質でインキュベートし、さらに500回の顕微鏡で個体を調べました。このように、クマムシの周りの目に見える微生物は完全に照らされています。

効率的な均質化、DNA抽出、断片化、およびライブラリ調製に続いて。ライブラリのサイズ分布は、品質管理のための高感度電気泳動を使用して検証されます。紫と緑の線は、それぞれ1、500、および25塩基対の上位マーカーと下部マーカーを示しています。

レーンLはラダーマーカー、レーンSとN1からN4は同じ実験の5回の反復であり、すべて1つのクマムシ標本から始まります。それは200と1, 000塩基対の間の広範な均一と分布から見ることができるように、私たちのプロトコルは、超低入力でも非常に再現性があります。以下は、1回のシーケンシングランから得られた同期リードの高速QCの結果です。

リードは 300 塩基対のスペアエンドとして取得され、フォワードリードとリバースリードはそれぞれ上と下に表示されます。ここに示す分布は、300ペアのエンドリードの典型であり、最初の200ベースペアでQ30を超える非常に高品質のベースコールがあり、最後まで徐々に減少します。したがって、この方法では、1つのサンプルに対して1人の個体のみを使用します。

以前のクマムシゲノムシーケンシングプロジェクトで必要とされたような大量の動物は必要ありません。ほとんどのクマムシの養殖方法はまだ確立されていません。したがって、フィールドワークから直接得られるような単一の個体からのゲノミクスシーケンシングを可能にすることは、クマムシの分子生物学、そしておそらく他の小動物に大きな影響を与え

DNAシークエンシング法は、希少なブタクサ、線虫、ミズモミなど、まだシーケンシングされていない多数の微生物を、ゾーンの一部とより広い公共エリアとつなげることで解析することを可能にし、さまざまな生物学的メカニズムが可能になる環境をさらに