Name: 超低入力ヒトゲノム単一 Tardigrade の標本からのライブラリの準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 学ぼう、Hypsibius dujardiniの単一標本から50ピコグラムのゲノムDNAでシーケンスライブラリを構築する方法。抗生物質と視覚検査で細菌汚染を最小化し、凍融サイクルまたは手動粉砕で均質化します。MiSeqでシーケンスします。

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著者はゲノム配列決定でテクニカル サポートのため希阿部、希高井菜穂子石井をありがちましょう。この作業によって支えられた費日本社会のための科学振興会研究員、科研費科研費若手 (No.22681029)、科研費科研費研究 (B)、第 17 H 03620、日本学術振興会からので、基本的な科学研究プロジェクト、住友財団 (No.140340) から、山形県・鶴岡市から研究資金によって部分的に助成。クロレラクマムシをフィードするために使用されたベルフォートは、クロレラ工業 (株)

1. 準備
<ol><li>90 mm プラスチック製培養皿で 10 mL、1% ペニシリン/ストレプトマイシン DW のとカクテルの溶媒として蒸留水 (DW) を使用して 2% の agarose のゲルを準備します。ゲルは 18 ° C で設定インキュベーターで 2 〜 3 週間に保存できます。 注: は、低温は agarose のゲル、ゲルと、クマムシをトラップできる培養皿の壁の非常に小さいギャップの結果を縮小するための 10 の ° C の下のゲルの任意のストレージを避けてください。</li>
</ol>2. 試料調製及び汚染物質の排除
<ol><li>単一のクマムシを収集、準備された寒天プレート上に配置、それを洗う - 任意の残りの粒子を除去する社殿と 3 x x 2。</li>
	<li>腸から任意の余分な食品を削除する 24 h 18-22 ° C でクマムシを孵化させなさい。</li>
	<li>ペニシリン/ストレプトマイシンの抗生物質細菌汚染を削除し、浄化した動物 P10 ピペットを使用してきれいなスライド ガラス上に 2-6 h に飢えたクマムシを配置します。</li>
	<li>500 倍の倍率での顕微鏡下でクマムシを観察し、残存細菌がないことを確認します。 注: 顕微鏡の高倍率は望ましいが、光学顕微鏡はまたなく観察を適用するされることがあります。</li>
	<li>最大液 5 μ L の P10 のピペットを使用して個々 の収集、低結合ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) チューブに入れます、できるだけ余分な水分を削除します。 注: マイクロ チューブ、PCR チューブ ・ ピペット チップ必要がありますすべて低結合する DNA の損失を最小限に。 注: を行う急速な乾燥、できるだけ均質化または動物の死は、ゲノム DNA を損傷する可能性が大きく。</li>
</ol>3. 均質化と DNA の抽出
<ol><li>次の方法のいずれかでそのゲノム DNA (gDNA) を取得する動物を均質化します。 注: (列と基づくビーズ) 他のキットはこの非常に低い入力で効果がないため DNA 抽出手順の材料表に示されている指定されたキットを使用するが重要です。ゲノムの換散バッファーを使用する β-メルカプトエタノール前に 0.5% と指定しました。<ol>
<li>凍結融解サイクル18動物をホモジナイズしてください。<ol>
<li>手順 2.5 の直後、クマムシを含む PCR チューブに換散バッファーの 100 μ L を追加します。</li>
			<li>37 ° C に加温熱ブロックに移動 10 分、10 分と、液体窒素で PCR チューブを配置2 x この手順を繰り返します。 注: 均質化は不十分であるまたは手動粉砕後に実行できる場合は、この手順を繰り返すことができます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>手動で動物をつぶします。<ol>
<li>直後、顕微鏡下のステップ 2.5、PCR の管の壁に動物を押すことによってピペットの P10 の先端を持つ個人を粉砕し、すぐに換散バッファーの 100 μ L を追加します。 注: 海中でもすることができます簡単にスリップし、非効率的な破砕 gDNA を抽出に失敗になりますので、顕微鏡の下でこのプロシージャを観察するが重要です。換散バッファー有機体に侵入することができますので、tardigrade のキューティクルが壊れていることを確認します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>管に発生する換散のため室温で 30 分間インキュベートします。 注: 最低 30 分、効率的な換散のため必要ですが、孵化は長くすることができます。</li>
	<li>きれいな 1.5 mL 低結合マイクロ チューブに溶解混合物の全集 (100 μ L) を転送します。</li>
	<li>均質化のために使用された、空、今低結合 PCR チューブに換散バッファーの 100 μ l 添加し混合物を分注後、ステップ 3.3 で使用される 1.5 mL 低結合マイクロ チューブに転送。2 x この手順を繰り返します。</li>
	<li>ステップ 3.4 のように低結合 PCR チューブに換散バッファーの 300 μ L を追加し、ピペッティングした後低バインディングの 1.5 mL マイクロ チューブに混合物を移動します。1.5 mL 低結合マイクロ チューブは、このステップの後 600 μ L の混合物を含める必要があります。 注: この手順は、サンプルを複数回洗浄することにより PCR チューブ壁にバインドされた gDNA の損失を最小限に抑えることです。</li>
	<li>コレクションの管に置かスピン列に溶解混合物の 600 μ L の合計を追加し、1 分 10,000 × g で遠心分離します。</li>
	<li>1 分の 10,000 × g で遠心し、列に流れを再適用されます。 注: この手順は確実に重要な gDNA のほとんどが列にバインドされています。</li>
	<li>スピン列に洗浄バッファーの 500 μ l 添加しきれいな 1.5 mL のマイクロ チューブにスピン列 1 分転送 10,000 x g で遠心分離機します。</li>
	<li>10 mM トリス-HCl、pH 8.5、スピンの列、5 分待って、室温での 20 μ L を適用し、1 分の 10,000 × g で遠心分離機します。 注: ライブラリの準備酵素と干渉するため、溶出バッファーは、EDTA を含んでいないする必要があります。</li>
	<li>スピンの列と常温静置後の 5 分後のフローに再適用、10,000 × g で 1 分間遠心します。 注: この手順は、列にバインドされた gDNA の最大溶出するために重要です。</li>
</ol>4. 図書館建設シーケンス
<ol><li>
DNA の断片化
	<ol>
<li>DNA 断片化の 15 μ L マイクロ チューブに gDNA 溶離液の 15 μ L を転送し、1 分卓上遠心機を使用して管を遠心分離します。 注: 指定したマイクロ チューブ材料の表に示すように低入力に最適です。低ボリューム超音波と断片化は危険で、これは DNA の非常に低濃度のため酵素断片化で置換することはできません。</li>
		<li>550 gDNA をフラグメント bp。 注: を用いて 550 bp 設定は次のとおり: 入射ピークパワー 30 W、デューティー比を = = 20%、バーストあたりのサイクル数 = 50、治療時間 = 23 s。</li>
		<li>徹底的なピペッティングした後クリーン低結合 PCR チューブに断片化された DNA の混合物の 10 μ L を転送します。 注: 実験をここで停止することができます。4 ° C または-20 ° C で DNA を保持します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
図書館建設のシーケンス 注: 入力 DNA の低い量のため、次の手順でテーブルの材料で指定されたキットを使用するが絶対に重要です。<ol>
<li>テンプレートの準備バッファーの 2 μ L とテンプレート準備酵素の 1 μ L を加えて徹底的にピペットでそれらをミックスします。</li>
		<li>以下の条件でサーマルサイクラーにテンプレート準備反応を実行: 25 分、20 分、4 ° C ホールド 101-105 ° C で加熱蓋に 55 ° C の 22 ° C反応が完了するは、次の手順に進みます。</li>
		<li>テンプレート作製の反応生成物にライブラリ合成バッファーの 1 μ L とライブラリ合成酵素の 1 μ L を追加し、(4 ° C ホールド) と 40 分の 22 ° C で混合物を孵化させなさい。反応が完了するは、次の手順に進みます。</li>
		<li>ライブラリ増幅マスター ミックス (ライブラリ増幅バッファーの 25 μ L、ライブラリ増幅酵素の 1 μ L、ヌクレアーゼ フリー水の 4 μ L) の 30 μ L とインデックスの試薬の 5 μ L を追加します。</li>
		<li>ピペットを徹底的にミックスのすべてと卓上遠心分離機で簡単に混合物を遠心分離機します。</li>
		<li>表 1に示した条件で PCR を行います。</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>温度</td>
			<td>時間</td>
			<td>サイクル</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ° C</td>
			<td>3 分</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>85 ° C</td>
			<td>2 分</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>98 ° C</td>
			<td>2 分</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>98 ° C</td>
			<td>20 秒</td>
			<td rowspan="3">4 サイクル</td>
		</tr>
<tr>
<td>67 ° C</td>
			<td>20 秒</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ° C</td>
			<td>40 秒</td>
		</tr>
<tr>
<td>98 ° C</td>
			<td>20 秒</td>
			<td rowspan="2">16 サイクル</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ° C</td>
			<td>50 秒</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 ° C</td>
			<td>ホールド</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: PCR の条件。
<ol start="3"><li>
PCR の製品の浄化 注: この手順は、他の浄化方法と代替可能します。分光光度計を使用して生成される DNA の純度を確認する別の方法を使用する場合を確認します。260/280 と 260 の吸光度比/230 1.8 上両方する必要があります。<ol>
<li>磁気ビーズを 50 μ l 添加、ピペットのソリューションは、10 x、簡単に卓上遠心機で遠心力場それ。</li>
		<li>常温で 2 分のためのソリューションを孵化させなさい。</li>
		<li>5 分、マグネット スタンドにそれを孵化させなさいまたはソリューションが完全になるまでをオフにし、上清を除去します。</li>
		<li>マグネット スタンドに低結合 PCR チューブに作りたての 80% エタノール 200 μ L を追加、30 s と削除上清を待ちます。2 x この手順を繰り返します。ビーズが不可でした。</li>
		<li>簡単に卓上遠心と低結合 PCR チューブを遠心し、マグネット スタンドに任意の余分なエタノールを削除します。ビーズを風乾、オーバードライを避けてください。</li>
		<li>10 mm トリス-HCl、pH 8.5 15 μ L でビーズを再懸濁します徹底的に磁気ビーズが均一に分散されるようにソリューションをピペット、簡単なの遠心分離後、室温で 2 分の管を孵化させなさい、2、マグネット スタンドにインキュベートソリューションがクリアされるまでの分。 注: シーケンスの化学と干渉するため、溶出バッファーは、EDTA を含んでいない必要があります。</li>
		<li>新しい低結合 PCR チューブ、ペレットを乱すことがなく、培養上清を転送します。 注: 実験をここで停止することができます。4 ° c または-20 ° C、長期に渡る保存 DNA を保持します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 品質チェック、定量化、および DNA のシーケンス
注: 品質チェックは DNA の低い量のためにこの工程の前に行わない。
<ol><li>
DNA ライブラリのサイズ分布の検証 注: サイズ分布のデジタル レポートと他の高感度電気泳動システムを使用できます。<ol>
<li>電気泳動バッファー試薬を戻り、ゲルのカートリッジ (25 1,000 bp の範囲で) 部屋の温度にします。</li>
		<li>配列ライブラリの 1 μ L を電気泳動バッファー試薬の 3 μ L を追加し、渦と 1 分の徹底的にそれらをミックスし、簡単に卓上遠心分離機、遠心分離機のそれら。</li>
		<li>電気泳動を行い、関連ソフトウェアのライブラリ サイズ分布を検証します。主なフラグメント ピークは、1,000 に約 300 から広く及ぶべき bp。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA の定量化 他の蛍光ベースのメソッドまたは量的な PCR 注: を使用することができますが、それはシーケンス ライブラリを定量化するために十分に正確ではないと、吸光光度法を避けてください。<ol>
<li>ソリューション バッファーの 796 μ L と蛍光試薬の 4 μ L を追加し、徹底的にそれらをミックスします。2 つの測定管に取り組んで解決策の 190 μ L と 1 つの試験管に 197 μ L を調剤します。</li>
		<li>作業ソリューションの 190 μ L を含む各試験管に DNA 既知濃度基準の 10 μ L と準備作業ソリューションの 197 μ L を含むアッセイ チューブ ライブラリの 3 μ L を追加します。</li>
		<li>渦管を簡単に卓上遠心分離の遠心分離機のそれらと。3 μ の設定で、蛍光光度計を用いた DNA を定量化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dna ライブラリ 注: シーケンス処理プラットフォームは、指定されたライブラリ構築キットと互換性があります。<ol>
<li>製造元のプロトコルに基づいて配列ライブラリを準備します。</li>
		<li>シーケンス楽器に試薬カセットとフロー セルを設定し、次の製造元のプロトコル情報を実行シーケンスを入力します。</li>
		<li>シーケンスを実行します。 注: 2 つのシーケンスの実行を行った: 4 つのサンプルを 1 つの実行の多重化と同様、1 つのサンプル/実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 計算解析
<ol><li>ベース呼び出しと、必要な場合は、読み取りをデマルチプレックスします。</li>
	<li>FastQC19シーケンス データの品質を検証します。 注: 得られたデータのより詳細な検証、当社の以前のレポート16を参照してください。</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

細菌汚染は、微生物のゲノム配列決定に脅威を与えます。Tardigrade ゲノムに関する先行研究を広範な情報学研究の方法12,20を使用して汚染をフィルター処理、一方我々 は汚染のリスクを最小限に抑えるために単一の個人からゲノムをシーケンスです。個々 緩歩動物ゲノム DNA16の約 50-200 pg が含まれているキチン質の外骨格の厚い層で包み込まれているので、汚染物質や高品質の DNA の抽出の排除、このプロトコルでは重要なポイントです。既存のクマムシ文化は、無菌ではありません、それらは、多くの汚染物質の表面だけでなく、自分の腸内に食物残渣野生のキャリーから収集します。以前クマムシのゲノム プロジェクトは、1 つサンプル12,14結果、細菌汚染による影響を受ける可能性が高いことを意味としてまとめて 10,000-100,000 人をシーケンスしました。彼...

クマムシは、乾燥に直面するとき、乾燥耐性と呼ばれる ametabolic 状態を入力することができます顕微鏡動物です。彼らは水1,2の吸収による回復します。Ametabolic 状態ではクマムシが極端な温度3高圧4、5ガンマ線、x 線、紫外線光6の高用量を含む様々 な極限環境に耐えることができます。7,8、および宇宙空間9。ゲノムデータは乾燥耐性の分子機構の研究のために不可欠な基礎です。
クマムシのゲノムをシーケンス処理する前の試みは、細菌汚染10、11,12,13,14の兆候を示しています。このような小さな生物からゲノム配列決定多数の動物を必要とし、細菌汚染になりやすいです。したがって、我々 は既に15汚染のリスクを最小限に抑えるため、クマムシの単一の標本から超低入力メソッドを使用してシーケンス プロトコルを確立されています。これらのデータを使用して、さらに実施した高品質の順序とH. dujardini16,17のゲノムの再構築。ここで述べるこの(図 1tardigrade 一個人からゲノム配列決定法)。このシーケンスの結果の検証は本稿の焦点を越えて、私たちの以前のレポート16で既に、徹底的に議論されています。
このメソッドは、2 つの部分で構成されています: 最低汚染可能と DNA のピクトグラム レベルの質の高い抽出単一クマムシの分離。海中でもは飢えたと抗生物質と同様に、水ですすぎ、任意の細菌汚染の除去を確実に 500 倍の倍率での顕微鏡で観察しました。以前の推定値と測定、クマムシの単一の個人にゲノム DNA の16、凍結融解のサイクルによってまたは手動の均質化によって、キチン質の外骨格を割れによって抽出される約 50 200 pg が含まれていることを示しています。この DNA は、図書館の建設に提出し、DNA シーケンシング装置でシーケンス処理します。追加情報分析は、以前の tardigrade シーケンス プロジェクトと比較して汚染の低レベルと同様、高品質のシーケンスを示しています。

<table><tbody><tr><td>SZ61 顕微鏡</td><td>OLYMPUS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BactoAgar</td><td>Difco Laboratories</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>Gibco by life technologies</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>VHX-5000 System</td><td>Keyence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2mL シリコーンコーティングチューブ</td><td>Bio Medical Science</td><td>BC-bmb20200</td><td></td></tr><tr><td>Quick-DNAMicroprep Kit</td><td>ZYMO Research</td><td>D3021</td><td>このキットの使用は絶対的に重要です。ステップ 3.1</td></tr><tr><td>1.5 mL マイクロチューブ</td><td>グライナー バイオワン</td><td>616-201</td><td>参照 4.1.1</td></tr><tr><td>高速冷蔵マイクロ遠心分離機</td><td>タカラトミー</td><td>MX-307</td><td></td></tr><tr><td>コバリス M220</td><td>コバリス Inc.</td><td></td><td></td>4482277</tr><tr><td>ThruPLEX DNA-Seq kit</td><td>Rubicon Genomics</td><td>CAT. NO. R400406</td><td>このキットの使用は絶対的に重要です。ステップ 4.2</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Bioer Technology</td><td>TC-96GHbC</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP reagent</td><td>BECKMAN COULTER Life Science</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Wako</td><td>054-027335</td><td></td></tr><tr><td>EB buffer</td><td>QIAGEN</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation</td><td>Agilent</td><td>G2965AA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D1000 試薬</td><td>Agilent</td><td>5067-5583</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR バッファー/試薬</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Cubee Mini-Centrifuge</td><td>RecenttecGenereach</td><td>R5-AQBD01aqbd</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 600 cycle v3</td><td>Illumina Inc.</td><td>MS-102-3003</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq シーケンサー</td><td>イルミナ株式会社</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

超低入力ヒトゲノム単一 tardigrade の標本からのライブラリの準備

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

クマムシは、乾燥とすることができますに直面するときと呼ばれる乾燥耐性を元の状態に返すときに水が供給されて ametabolic 状態顕微鏡動物です。時々 これらの動物の遺伝子の水平伝達の範囲についてたとえば、誤った解釈につながるクマムシ リスク細菌汚染など顕微鏡動物のゲノム配列を決定。ここでは、我々 は単一の標本からHypsibius dujardiniクマムシのゲノムを配列する超低入力メソッドを提供します。50 の効率的な抽出と厳密な洗浄および汚染物質の除外を用いて 〜 200 pg 単一の個人からのゲノム DNA、DNA シーケンシング装置でシーケンス化されたライブラリを構築しました。これらのライブラリは、高い再現性で、公平をされ他h. dujardiniのゲノム シーケンスされた読み取りのインフォマティクス解析は汚染の最小限の量を示した。このメソッドは、以前の方法を使用していないシーケンスが難のクマムシに適用できます。

汚染物質の除外:
このプロトコルには、海中でも、汚染を最小限に抑えるために抗生物質治療と殺菌の徹底した洗浄が含まれます。また、これらのプロセスの完全性を確保するため、視覚的なチェック プロセスが含まれます。検証 (ステップ 2.4 プロトコルの) 中に作られた顕微鏡イメージは図 2に示します。500 倍の倍率で観察するとは、個々 のクマムシを動かす小さな粒子として細菌細胞を見ることができます。
DNA ライブラリの品質の検証:
構築された Seq DNA ライブラリの総量は約 109.5...

顕微鏡の有機体のゲノムのシーケンス処理中に汚染大きい問題に残る。ここでは、汚染のリスクを最小限に抑えるため全ゲノム増幅 DNA のわずか 50 pg を単一の標本からクマムシのゲノムをシーケンス処理する方法を示します。

超低入力ヒトゲノム単一 Tardigrade の標本からのライブラリの準備

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

このプロトコルの目標は、クマムシと呼ばれる微視的な生物のゲノムを配列決定することです。私たちは、クマムシHypsibius dujardiniのゲノムを、50ピコグラムという低いゲノムDNAを持つ単一の標本から全ゲノム応用で解読する方法を確立しました。1匹のクマムシを分離した後、抗生物質と目視検査を使用して細菌汚染を最小限に抑えます。また、2つの均質化方法も利用しています。まず、C.elegansで最も一般的に使用されるのは、凍結融解サイクルを使用し、次に、ピペットチップでクマムシを手動で粉砕することです。次に、DNAを使用してシーケンシングライブラリを構築し、MiSeq機器でシーケンシングします。プロトコルの全体的な概要。1個体を単離した後、均質化のために3回の凍結融解サイクルにかけます。ゲノムDNAを抽出および精製し、超音波処理により断片化します。次に、シーケンシングライブラリを構築し、ライブラリサイズ分布を検証した後、シーケンシング装置でシーケンシングします。90 mmのプラスチック培養皿に蒸留水を溶媒として使用して2%アガロースゲルを調製し、蒸留水で10 mmの1%ペニシリンストレプトマイシンを調製します。ゲルは、18度に設定されたインキュベーターで2〜3週間保存できます。クマムシを1匹集めて準備した寒天プレートに置き、蒸留水で2〜3回洗って残りの粒子を取り除きます。細菌汚染を除去するために、単一のクマムシをペニシリンストレプトマイシン抗生物質に2〜6時間置き、P10ピペットを使用して除染した動物を清潔なスライドグラスに置きます。.クマムシを顕微鏡で500倍に拡大して観察し、細菌が残っていないことを確認します。最大5マイクロリットルの液体が入ったP10ピペットを使用して個を採取し、低結合のPCRチューブに入れ、余分な液体をできるだけ取り除きます。均質化とDNA抽出。動物を均質化してゲノムDNAを得るには、以下のいずれかの方法があります。凍結融解サイクルによる均質化。ステップ2.5の直後に、クマムシを含むPCRチューブに100マイクロリットルの溶解バッファーを追加します。PCRチューブを液体窒素に10分間入れ、ヒートブロックに移し、37°Cに10分間温めます。この手順を 3 回繰り返します。手動破砕。実体顕微鏡下で、動物をPCRチューブ壁に押し付けてP10ピペットチップで個体を粉砕し、直ちに100マイクロリットルの溶解緩衝液を添加する。室温で30分間インキュベートし、溶解が起こるようにします。溶解混合物の全容量をきれいな1.5ミリリットルの低結合マイクロチューブに移します。100マイクロリットルの溶解バッファーを低結合PCRチューブに加えると、ホモジナイズに使用され、空になりました。そしてピペッティング後、混合物を1.5低結合マイクロチューブに移します。この手順を 2 回繰り返します。低結合性PCRチューブに300マイクロリットルの溶解バッファーを加え、ピペッティング後、混合物を1.5ミリリットルの低結合性マイクロチューブに移します。コレクションチューブに入れたスピンカラムに合計600マイクロリットルの溶解混合物を加え、10, 000Gで1分間遠心分離します。フロースルーをカラムに再適用し、10、000Gで1分間遠心分離します。このステップは、ゲノムDNAのほとんどがカラムに結合していることを確認するために重要です。スピンカラムに500マイクロリットルの洗浄バッファーを加え、10, 000Gで1分間遠心分離します。スピンカラムをきれいな1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。スピンカラムに20マイクロリットルの10ミリモルのファーストACLを塗布し、室温で5分間待ちます。10, 000 G で 1 分間遠心分離します。希釈バッファーは、実験室調製酵素に干渉するため、EDTAを含んではなりません。スピンカラムにフロースルーを再適用し、室温で5分間インキュベートした後、10, 000 G.Sequencingライブラリ構築で1分間遠心分離します。DNA断片化。15マイクロリットルのゲノムDNA溶出液をDNA断片化のために15マイクロリットルのマイクロチューブに移し、卓上遠心分離機を使用して1分間遠心分離します。ゲノムDNAを550塩基対にフラグメント化します。スルーピペッティング後、10マイクロリットルの断片化されたDNA混合物を清潔で低結合のPCRチューブに移します。実験はここで停止できます。DNAを4度またはマイナス20度で保存します。シーケンシングライブラリの構築。以下の手順では、DNAのインプットが少ないため、指定されたキットを使用することが絶対に重要です。必要な試薬をメーカーのプロトコルに従って調製し、シーケンシングライブラリを一切変更せずに構築します。ライブラリー増幅混合物をライブラリー合成混合物に適用した後、サーマルサイクラーでPCR反応を行います。PCR反応は図のように実施した。PCR反応の精製。50マイクロリットルの磁気ビーズとピペットを10回加え、卓上マイクロ遠心分離機で短時間遠心分離します。室温で2分間インキュベートします。磁気スタンドで5分間、または溶液が完全に透明になるまでインキュベートし、上清を取り除きます。メーカーのプロトコルに従ってください。ペレットを乱さずに上清を新しい低結合性PCRチューブに移します。DNAの品質チェックと定量、およびシーケンシング。DNAライブラリーサイズ分布の検証。3マイクロリットルのサンプル水と1マイクロリットルのシーケンシングライブラリを加え、ボルテックスで1分間十分に混合し、卓上遠心分離機で短時間遠心分離します。電気泳動を行い、関連ソフトウェアを使用してライブラリサイズ分布を検証します。メインフラグメントのピークは、約300〜1,000塩基対の範囲に広くなければなりません。DNA定量。796マイクロリットルの溶液バッファーと4マイクロリットルの蛍光試薬を加え、十分に混合します。190マイクロリットルの作業溶液を2本のアッセイチューブに、197マイクロリットルを1本のアッセイチューブに分注します。190マイクロリットルのワーキング溶液を含む各アッセイチューブに、既知の濃度のDNAを含む10マイクロリットルの標準試料を添加し、調製したライブラリの3マイクロリットルを197マイクロリットルのワーキング溶液を含むアッセイチューブに加えます。一時的に渦巻き、卓上遠心分離機で遠心分離します。3マイクロリットルの設定で蛍光光度計を使用してDNAを定量します。DNAライブラリーのシーケンシング。シーケンシングライブラリは、製造元のプロトコルに基づいて調製します。試薬カセットとフローセルをシーケンシング装置にセットし、メーカーのプロトコルに従ってシーケンシングの実行情報を入力します。シーケンシングを実行します。表示された結果。高品質のDNA抽出における汚染物質の曝露は、私たちのプロトコルの重要なポイントであることに変わりはありません。それらが汚染物質であるかどうかを視覚的に調べるために、クマムシをペニシリンとストレプトマイシンである抗生物質でインキュベートし、さらに500回の顕微鏡で個体を調べました。このように、クマムシの周りの目に見える微生物は完全に照らされています。効率的な均質化、DNA抽出、断片化、およびライブラリ調製に続いて。ライブラリのサイズ分布は、品質管理のための高感度電気泳動を使用して検証されます。紫と緑の線は、それぞれ1、500、および25塩基対の上位マーカーと下部マーカーを示しています。レーンLはラダーマーカー、レーンSとN1からN4は同じ実験の5回の反復であり、すべて1つのクマムシ標本から始まります。それは200と1, 000塩基対の間の広範な均一と分布から見ることができるように、私たちのプロトコルは、超低入力でも非常に再現性があります。以下は、1回のシーケンシングランから得られた同期リードの高速QCの結果です。リードは 300 塩基対のスペアエンドとして取得され、フォワードリードとリバースリードはそれぞれ上と下に表示されます。ここに示す分布は、300ペアのエンドリードの典型であり、最初の200ベースペアでQ30を超える非常に高品質のベースコールがあり、最後まで徐々に減少します。したがって、この方法では、1つのサンプルに対して1人の個体のみを使用します。以前のクマムシゲノムシーケンシングプロジェクトで必要とされたような大量の動物は必要ありません。ほとんどのクマムシの養殖方法はまだ確立されていません。したがって、フィールドワークから直接得られるような単一の個体からのゲノミクスシーケンシングを可能にすることは、クマムシの分子生物学、そしておそらく他の小動物に大きな影響を与えるでしょう。DNAシークエンシング法は、希少なブタクサ、線虫、ミズモミなど、まだシーケンシングされていない多数の微生物を、ゾーンの一部とより広い公共エリアとつなげることで解析することを可能にし、さまざまな生物学的メカニズムが可能になる環境をさらに広げます。

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Genetics

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超低入力ヒトゲノム単一 Tardigrade の標本からのライブラリの準備

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