ニワトリ胚組織の開発培養法

このプロトコルの全体的な目標は、胚の複雑な発生経路の詳細な研究を可能にするために、インビトロ環境で胚のニワトリの目へのアクセスを提供することです。胚期のニワトリでは、まぶたの発達、胚の動き、および余分な胚組織の成長により、目の研究が困難なことがよくあります。薬物や阻害剤などの化合物も胚に致死的な影響を与える可能性があるため、これらの化合物を使用して遺伝子経路を調節することが困難になります。

in vitro組織培養の進歩により、科学者はこれらの組織を分離し、前述の障壁の多くを排除することができました。私たちのプロトコルは、神経網膜や網膜色素上皮など、発達中に相互作用する可能性のあるすべての組織を含む、目全体を研究できるという点で有利です。まず、材料をオートクレーブして、手順の前にすべての溶液と機器が無菌であることを確認します。

これを行うには、2リットルの蒸留水と1リットルのひよこ生理食塩水、ティッシュの箱、半多孔質の濾紙、金網、水容器、使い捨てガラスピペットをオートクレーブします。インキュベーターの棚とドアを70%エタノールで完全に滅菌し、容器にオートクレーブ処理した蒸留水を入れ、インキュベーターを摂氏37度に予熱します。インキュベーター内の抗生物質ペニシリンストレプトマイシンのチューブとともに、栄養培地を予温します。

ワークスペース全体にペーパータオルを置き、70%エタノールで滅菌します。すべての鉗子とハサミを滅菌します。鶏の頭をオートクレーブ保存したひよこの生理食塩水で、ひよこの頭を正中線で二等分し、各眼の周りにいくつかの組織を残します。

余分な組織は、目が培養物の緊張を維持するのを助けるだけでなく、目全体の栄養素の取り込みを助け、目が濾紙から滑り落ちるのを防ぎます。これらの組織は、後の分析で眼の向きを決める際の目印としても機能します。解剖した組織を室温のひよこの生理食塩水に残して、培養物を準備します。

培養皿を準備します。100mmシャーレ1枚に35mmシャーレを2枚入れます。各小皿に金網ステージを1つずつ配置します。

目のあるハーフヘッドを濾紙の上に置き、目が紙から滑り落ちないように少し傾けます。ティッシュペーパーと濾紙を金網ステージの上にある小さなシャーレに移します。同じ胚のもう一方の半分の頭で繰り返します。

2つの小さなシャーレのそれぞれに培地を追加します。メディウムをティッシュペーパーのレベルまで上げます。組織を培地に沈めないでください。

細菌感染を防ぐために、各皿の栄養培地に50マイクロリットルの抗生物質ペニシリンストレプトマイシンストック溶液を追加します。.折りたたまれた薄いティッシュを大きなシャーレの内側の端に置き、蒸留水で湿らせます。暗いインキュベーターで摂氏37度の培養器で最大4日間培養します。

培養後、濾紙から組織を取り出し、4%パラホルムアルデヒドで固定します。最初の列は、培養開始時の胚のひよこの目を表すHH34の目を示しています。2列目は、HH34から4日間培養した胚のヒヨコの目を示しています。

3列目はHH38の眼を示しており、これはHH34を超える4日間のインオボ開発に相当します。パネルA〜Fは未染色ですが、パネルG〜Iはアルカリホスファターゼ酵素について染色されています。一番上の列、パネルAからCは、各パネルの矢印で示されている羽芽の出現とまぶたの成長によって証明されるように、目が培養を通じて発達し続けることを示しています。

中央の列、パネルDからFは、結膜乳頭が培養中で変性し始めることを示しています。下段のパネルGからIは、強膜小骨誘導の時空間パターンが培養中に維持されていることを示しており、この方法を使用して研究できる発生経路の一例として機能します。このプロトコルにより、組織は培養全体を通じて発生の主要な空間的および時間的側面を維持できます。

このプロトコルは、感覚器官全体の培養における重要な進歩を表しており、関与する複雑な発達経路を研究するための代替方法論を提供します。