Name: パッチ ・ クランプ後単一のセル多重逆のトランスクリプション ポリメラーゼ連鎖反応 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学ぶパッチクランプ後単一細胞多重RT-PCR法。神経細胞の遺伝子発現プロファイルを解析し、脳内細胞多様性と機能特性を解明する強力なツールです。

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博士アレクサンドル ・ Mourot は、原稿の彼のコメントを感謝いたします。この作品は、アジャンス ナシオナル デ ラ抜き (ANR 2011 MALZ 003 01; からの補助金によって支えられました。ANR-15-CE16-0010 と ANR-17-CE37-0010-03)、BLG 財団注ぐラ凝ったシュル アルツハイマーから交わりに支えられて。IBPS (フランス ・ パリ) の動物施設に感謝いたします。

著者が明らかに何もありません。

単一セルのマルチプレックス RT-PCR によるパッチ ・ クランプすることができます同時にかつ確実にプローブ的識別されたセル5以上 30 遺伝子の発現後。単一細胞レベルの遺伝子発現解析と、非常に効率的な PCR のプライマーが必要です。最も制限の手順の 1 つは、セルの内容のコレクションです。その効率は、セル サイズをマッチングしながら可能な限り大きくする必要がありますパッチ ピペットの先端の径に依存します。1-2 μ m オープン先端径のピペットは、最も神経のタイプに適してする証明されました。携帯電話コンテンツのみを収集するかどうかを確認する重要ですと周囲の組織ではないです。これは生理の収穫の際にタイトなシールの保存を制御することによって実現されます。さらにピペットの離脱時に外をパッチの構成の形成は、細胞の残骸から収穫された細胞質を保護します。調査セルの種類の Mrna の豊かさによって異なりますまたマルチプレックス RT-PCR による単一細胞の成功率。例えば、アストロ サイトは、比較的低い線量3における Mrna を表現で得られる利回...

大脳皮質には、様々 な生理学的なプロセスに関与する様々 な細胞タイプが装備されています。同定と解析、固有の機能を理解する前提条件することができます非常に挑戦的な大脳皮質細胞の種類1 を特徴付ける大きな形態学的、生理学、分子多様を与え、2,3,4。
単一セル多重 RT-PCR は、パッチ ・ クランプと RT-PCR 技術の組み合わせに基づいています。それは同時に生理識別されたセル5以上 30 事前定義された遺伝子の発現を調べることができます。さらに録音ピペットで神経トレーサーのインクルー ジョンにより、組織化学的啓示6,7,8,9,後記録された細胞の形態的特性10ですその形質5,9,10、11,12 の多変量解析に基づく神経型の分類に非常に便利な技だ。 ,,1314。単一のセル マルチプレックス RT-PCR によるアストロ サイト15,16,17など非神経細胞の特性に適しています、すべての脳構造18、事実上適用ことができます。 19,20,21,22,23とセル型、全細胞構成で記録できると仮定すると。
この手法は、非常に便利な細胞源の同定や伝送システム7,8,15,16,20,21、ターゲット 24,25,26,27,28, 特定の抗体が不足している場合は特に。それは視覚的に識別されたセルの29日からのホールセルパッチク ランプ記録に依存し、したがって特定の細胞環境8,15,16セルのターゲットができます。さらに脳スライスにおける脳組織の細胞構築が保持されるのでこの方法もできます神経および非神経要素7,8の特徴の細胞の解剖学的関係の検討,18。
この手法は、細胞質の収穫の量によって、RT の効率によって限られているので、低コピー数で表される mRNA の検出は難しくなります。高-高価なシーケンサーが必ずしも必要があります彼ら30,31,,単一のセル3,4の全トランスクリプトームを解析する RNaseq 技術に基づいて他のアプローチを可能にしますすべての研究室が使用できます。単一セル多重 RT-PCR 法は、エンドポイント PCR を使用しているためにだけ広く利用可能な thermocyclers が必要です。電気生理学的セットアップ装備研究所で簡単に開発することができ、高価な機器を必要としません。1 日の内で、定義済みの一連の遺伝子の表現の質的分析を提供できます。したがって、このアプローチは、迅速な方法で単一細胞の分子特性解析へ簡単にアクセスを提供します。

<table><tbody><tr><td>MACAW v.2.0.5</td><td>NCBI</td><td></td><td>プライマー設計のためのマルチプルアラインメント</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>VWR</td><td>443852A</td><td>RT</td></tr><tr><td>ランダムプライマー</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>11034731001</td><td>RT</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-4065-52</td><td>RTおよびPCR</td></tr><tr><td>RNasin リボヌクレアーゼ阻害剤</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>RT</td></tr><tr><td>SuperScript II 逆転写酵素</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td>RT</td></tr><tr><td>Taq DNA ポリメラーゼ</td><td>Qiagen</td><td>201205</td><td>PCR</td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M5904-5ML</td><td>PCR</td></tr><tr><td>PCR プライマー</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td><td>PCR / 脱塩および200 &microで希釈;M</td></tr><tr><td>チューブ、0.5 mL、フラットキャップ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0350</td><td>RT および PCR</td></tr><tr><td>BT10 シリーズ - 10 &micro;L フィルターチップ</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT10</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>BT20 Series - 20 &micro;L フィルターチップ</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT20</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>BT200 Series - 200 &micro;L フィルターチップ</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT200</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>BT1000 Series - 1000 &micro;L フィルターチップ</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT1000.96</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>DNA Thermal Cylcer</td><td>Perkin Elmer Cetus</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>E1510-10ML</td><td>アガロースゲル電気泳動</td></tr><tr><td>Tris-Borate-EDTAバッファー</td><td>Sigma-Aldrich(メルク)</td><td>T4415-1L</td><td>アガロースゲル電気泳動</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td>ア<td>ガロースゲル電気泳動</td></tr><tr><td>&Phi;X174 DNA-Hae III Digest</td><td>NEB (New England BioLabs)</td><td>N3026S</td><td>アガロースゲル電気泳動</td></tr><tr><td>EDA 290</td><td>コダック</td><td></td><td>アガロースゲル電気泳動</td></tr><tr><td>電源 EPS 3500</td><td>Pharmacia Biotech</td><td></td><td>アガロースゲル電気泳動</td></tr><tr><td>Midi 水平電磁気球 ユニットモデル SHU13</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td><td>アガロースゲル電気泳動</td></tr><tr><td>サテンの外観の滑らかな紙</td><td>フィッシャーブランド</td><td>1748B</td><td>パッチ クランプ内部溶液</td></tr><tr><td>カリウム ヒドロキシド</td><td>Sigma-Aldrich (メルク)</td> <td>60377</td><td>パッチ クランプ内部溶液</td></tr><tr><td>エチレングリコール-ビス (2-アミノエチルエーテル)-N,N,N&prime;,N&prime;-四酢酸</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>E3889</td><td>パッチ クランプ内部溶液</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H4034</td><td>パッチ クランプ内部溶液</td></tr><tr><td>D-グルコン酸カリウム</td><td>Sigma-Aldrich (メルク)</td> <td>G4500</td><td>パッチ クランプ内部溶液</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich (メルク)</td> <td>M1028</td><td>パッチ クランプ内部溶液</td></tr><tr><td>5500 蒸気圧浸透圧計</td><td>Wescor</td><td></td><td>パッチ クランプ内部溶液</td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich (メルク)</td><td>B4261</td><td>パッチクランプ内部溶液</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich(メルク)</td><td>S5016</td><td>スライス調製</td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース一水和物</td><td>Sigma-Aldrich(メルク)</td><td>49159</td><td>スライス調製</td></tr>ナトリウム<tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich(メルク)</td><td>S6191</td>スライス<td>調製</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich(メルク)</td><td>60128</td><td>スライス調製</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich(Merck)</td><td>31437-M</td><td>スライス調製</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性</td><td>Sigma-Aldrich(メルク)</td><td>S5011</td><td>スライス調製</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich(メルク)</td><td>63069</td><td>スライス調製</td></tr><tr><td>塩化カルシウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich(メルク)</td><td>21115</td><td>スライス調製</td></tr><tr><td>キヌレン酸</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>K3375</td><td>スライス調製</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Piramal Healthcare UK</td><td></td><td>スライス調製</td></tr><tr><td>VT 1000S</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>14047235613</td><td>スライス調製</td></tr><tr><td>過酸化水素溶液</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H1009</td><td>パッチクランプセットアップ洗浄</td></tr><tr><td>フィラメント</td><td>付き薄肉ガラスキャピラリーワールド精密機器</td><td>TW150F-4</td><td>パッチクランプ</td></tr><tr><td>PP-83</td><td>ナリシゲ</td><td></td><td>パッチクランプ</td></tr><tr><td>エッペンドルフ マイクロローダー</td><td>エッペンドルフ</td><td>5242956003</td><td>パッチクランプ</td></tr><tr><td>BX51WI 正立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td></td><td>パッチクランプ</td></tr><tr><td>XC-ST70/CE CCD B/W ビデオカメラ</td><td>ソニー</td><td></td><td>パッチクランプ</td></tr><tr><td>Axopatch 200B アンプ</td><td>モレキュラーデバイス</td><td></td><td>パッチクランプ</td></tr><tr><td>Digidata 1440</td><td>モレキュラーデバイス</td><td></td><td>パッチクランプ</td></tr><tr><td>pCLAMP 10 ソフトウェアスイート</td><td>モレキュラーデバイス</td><td></td><td>パッチクランプ</td></tr><tr><td>10mLシリンジ</td><td>テルモ</td><td>SS-10ES</td><td></td></tr><tr><td>ストレートボディ Eシリーズ (ホルダー)</td><td>Phymep</td><td>64-0997</td><td>Expelling</td></tr><tr><td>Na phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S7907</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S8282</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>P6148</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>X100</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>冷水魚の皮</td><td>からのゼラチンSigma-Aldrich (Merck)</td><td>G7041</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11223</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>Histochemical revelation</td></tr></tbody></table>

パッチ ・ クランプ後単一のセル多重逆のトランスクリプション ポリメラーゼ連鎖反応

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

大脳皮質は多数の細胞の種類様々 な形態学的、生理学、分子機能を展示で構成されます。この多様性は、これらの細胞の種類、固有の機能を研究するための前提条件の簡単な同定と解析を妨げます。この記事では、パッチ ・ クランプのスライスに記録後、単一のセルに同時に遺伝子の発現を検出するにより多重単一セル逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) プロトコルについて説明します。この単純な方法は形態的特性と実装でき、血管近傍などさまざまなセルタイプおよび彼らの特定の細胞の環境の形質を決定することも多い。この議定書の原則は記録するセルを収穫し、逆に、パッチ ・ クランプの技術ではその細胞質の内容を書き写す、マルチプレックス pcr 法の定性的検出する遺伝子の定義済みセットの式。PCR のプライマーおよび RT-PCR 法と互換性がある細胞内のパッチ ・ クランプ ソリューションの注意深いデザインを必要があります。選択的かつ信頼性の高い成績を確保するため検出、この手法には細胞質が増幅ステップに収穫から適切なコントロールも必要です。注意ここで説明は厳密に従う必要があります、実質的に任意の電気生理学的検査は、RT - pcr マルチプレックスの単一のセルを使用できます。

マルチプレックス RT-PCR 法の代表的な検証を図 3に示します。プロトコルは、同時に 12 の異なる遺伝子の発現を調べるために設計されました。小胞グルタミン酸トランスポーター vGluT1 は、グルタミン酸作動性ニューロン42の肯定的な制御として取られました。GABA 合成酵素 (GAD65 と歩き 67)、ニューロペプチド Y(NPY)、およびソマトスタチン (SOM) は、gaba 作動性介在ニューロンの3、5,11のマーカーとして使用されました。シクロオキシゲナーゼ 2 酵素 (COX-2) は、錐体細胞のサブ人口3,16のマーカーとして使用されました。<...

このプロトコルでは、重要なステップとパッチ ・ クランプ後単一のセル多重逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を実行に必要な注意事項をについて説明します。この手法は、あらかじめ決められた一連のホールセルパッチク ランプ記録によって特徴付けられる単一細胞からの遺伝子発現プロファイルを解析するシンプルで効果的な方法です。

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

この方法は、神経集団の特性評価や伝達システムの発生源と標的の特定など、神経科学研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、単一細胞から事前に選択された遺伝子セットの発現プロファイルを迅速かつ容易に決定できることです。したがって、この方法はランダムダイバーシティマウスについての洞察を提供することができます。また、アストロサイトや多くの動物モデルなど、他の細胞タイプにも適用できます。この方法のデモンストレーションは、データの分析には大量の細胞質が必要なため、アグレッションステップとアスピアーリングステップの習得が難しい場合があるため、非常に重要です。切片化する前に、手術用ハサミ、細かい虹彩ハサミ、2つのヘラ、鉗子、ペーパーフィルターのディスク、シアノアクリレート接着剤を含む解剖キットを準備します。次に、氷冷した切断液をカーボジンで飽和させ、切断チャンバーを摂氏マイナス20度で冷却します。次に、動物の頭皮を取り除き、頭蓋骨を開きます。脳を慎重に抽出し、カルボゲン化氷冷切断液で満たされた小さなビーカーに入れます。その後、カッティングチャンバーをマイナス20°Cから取り外し、ペーパータオルで水分を落とします。脳を慎重に解剖して、関心のある領域を分離します。それをカッティングチャンバーに接着し、カーボジン化された氷冷カッティング溶液を加えます。ビブラトンを使用して、300マイクロメートルの厚さのスライスをセクション化します。スライスを酸素化切断液で満たされた休息チャンバーに室温で移し、少なくとも30分間回復させます。シングルセルRT-PCRおよび標的細胞の特性評価では、mRNAseを保存するために、全細胞の記録を20分以内に制限してください。記録の最後に、2マイクロリットルの5xRTミックスと0.5マイクロリットルの20xDTTで満たされた500マイクロリットルのPCRチューブを準備します。紡いで氷の上に保存します。次に、穏やかな負圧を加えて細胞の細胞質を採取します。細胞の内容物がピペットに入るのを防ぎながら、しっかりと密閉された状態を保ちながら監視および制御し、一部の遺伝子が考慮される場合は核の収集を回避します。遺伝子の場合、核の収集を避け、gDNAを増幅することを目的とした一連のプライマーを含めて、一般的な汚染に備えることが不可欠です。核がピペットの先端に近づいている場合は、負圧を解除してピペットを離します。密閉性が保たれていることを確認し、新しいピペット位置で細胞質の採取を再開します。次に、ピペットを静かに引き抜いて外側のアウトパッチを形成し、細胞外破片による汚染を制限し、その後の組織化学分析のために細胞膜を閉鎖します。ナブ、マイクロマニピュレーター、コンピューターキーボード、またはコンピューターマウスは、プロトンを帯電したRNAーゼ汚染源であることに注意してください。録音中に触れた場合は、手袋を交換してください。続いて、ピペットをエクスペラーに取り付け、正圧を加えて内容物をPCRチューブに排出します。ピペットの先端をPCRチューブに割って、内容物の収集を助けます。次に、チューブを短時間遠心分離し、0.5マイクロリットルのRNAse阻害剤と0.5マイクロリットルのRTAseを追加します。穏やかに混合し、再度遠心分離し、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、チューブを回転させ、摂氏マイナス80度で最大数か月間保管します。PCR分析まで、最初の増幅ステップを実行します。PCRを検証するには、プライマーペアを混合して希釈し、シングルセルRTPCR専用のピペットで1マイクロモルを追加します。サーモサイクラーを摂氏95度で3分間セットし、40サイクル実行した後、摂氏72度で最終伸びステップを5分間実行します。プライマーダイマーの形成を最小限に抑えるには、摂氏95度に予熱したサーモサイクラーにPCRチューブを配置してホットスタートを行います。30秒後、オイルの上に20マイクロリットルのプライマーミックスをすばやく排出します。プライマーペアが検証されたら、マルチプレックスプロトコルでテストします。外部プライマーを1マイクロモルで混合して希釈します。マルチプレックスプライマーミックスをマイナス20°Cで最大数週間保存します。次に、プレミックスを準備して氷の上に置きます。PCRチューブをフリックして回転させ、ミネラルオイルを2滴加えます。摂氏95度で3分間過ごした後、20回のPCRサイクルを実行します。20マイクロリットルのマルチプレックスプライマーミックスで説明したようにホットスタートを実行します。次に、解析する遺伝子の数と同じ数のPCRチューブを準備します。1遺伝子につき1マイクロリットルの第1PCR産物をテンプレートとして、プレミックスを調製します。解析する遺伝子の数に応じてすべての容量を調整し、ピペッティングエラーを補正するために10%の追加容量を使用することを検討してください。穏やかに振とうし、チューブを回転させ、80マイクロリットルのプレミックスを各PCRチューブに送り出します。チューブの壁やキャップに触れないように、チューブごとに2滴の鉱油を追加します。35 PCR サイクルを実行した後、20 マイクロリットルの内部プライマー混合物を排出してホットスタートを行います。2番目のPCRプロジェクトをアラゴーゼゲル電気泳動で解析します。第5層の錐体ニューロンは、その大きな体細胞と顕著な頂端樹状突起によって視覚的に識別されました。プルセル記録により、第5層の規則的なスパイクニューロンの典型的な電気生理学的特性が明らかになり、低入力抵抗、長時間の活動電位、および顕著なスパイク周波数適応が明らかになりました。このニューロンの分子解析により、vGluT1の発現が明らかになり、そのグルタマイト作動性表現型が確認されました。このニューロンは、ソマトスタチンとATP1-α-1、およびナトリウム-カリウムATPAの3つのサブユニットも発現しました。記録されたニューロンのバイオサイトン標識により、錐体様の形態が確認されました。グルタマイト作動性ニューロンから予想されるように、26層5錐体細胞の分子解析により、vGluT1の発現は明らかになりましたが、2つのGADのいずれも発現しませんでした。一度の技術は、それが適切に準備されていれば、2日以内に行うことができます。この手順を試みるときは、汚染を避けるために細心の注意を払うことを覚えておくことが重要です。このビデオを見た後、脳スライスによるパッチ凝集を特徴とする単一細胞から、細胞質採取、逆転写、ホットスタートPCRの後、数十の遺伝子の発現を同時に調べる方法についてよく理解できるはずです。臭化エチジウムでの作業は非常に危険であり、この手順を実行する際には手袋や白衣の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

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このプロトコルは、レーザーキャプチャマイクロ解剖を使用して、扁桃体の中心核から単一のニューロン、ミクログリア、およびアストロサイトを高精度かつ解剖特異性で収集する方法を説明します。さらに、これらの細胞のトランスクリプトームのサブセットを測定するためのマイクロ流体RT-qPCRの使用について説明する。...

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ここでは、マウス胚組織における遺伝子発現をプロファイルする多重化単一細胞mRNAシーケンシング法を提示した。多重化戦略と組み合わせた液滴ベースの単一細胞mRNAシーケンシング(scRNA-Seq)法は、複数のサンプルから単一細胞を同時にプロファイルできるため、試薬コストを大幅に削減し、実験的なバッチ効果を最小限に抑えることができます。...

マウス胚細胞の多重化単細胞mRNAシーケンシング解析

学ぶパッチクランプ後単一細胞多重RT-PCR法。神経細胞の遺伝子発現プロファイルを解析し、脳内細胞多様性と機能特性を解明する強力なツールです。

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