Name: パッチ ・ クランプ後単一のセル多重逆のトランスクリプション ポリメラーゼ連鎖反応 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学ぶパッチクランプ後単一細胞多重RT-PCR法。神経細胞の遺伝子発現プロファイルを解析し、脳内細胞多様性と機能特性を解明する強力なツールです。

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博士アレクサンドル ・ Mourot は、原稿の彼のコメントを感謝いたします。この作品は、アジャンス ナシオナル デ ラ抜き (ANR 2011 MALZ 003 01; からの補助金によって支えられました。ANR-15-CE16-0010 と ANR-17-CE37-0010-03)、BLG 財団注ぐラ凝ったシュル アルツハイマーから交わりに支えられて。IBPS (フランス ・ パリ) の動物施設に感謝いたします。

著者が明らかに何もありません。

単一セルのマルチプレックス RT-PCR によるパッチ ・ クランプすることができます同時にかつ確実にプローブ的識別されたセル5以上 30 遺伝子の発現後。単一細胞レベルの遺伝子発現解析と、非常に効率的な PCR のプライマーが必要です。最も制限の手順の 1 つは、セルの内容のコレクションです。その効率は、セル サイズをマッチングしながら可能な限り大きくする必要がありますパッチ ピペットの先端の径に依存します。1-2 μ m オープン先端径のピペットは、最も神経のタイプに適してする証明されました。携帯電話コンテンツのみを収集するかどうかを確認する重要ですと周囲の組織ではないです。これは生理の収穫の際にタイトなシールの保存を制御することによって実現されます。さらにピペットの離脱時に外をパッチの構成の形成は、細胞の残骸から収穫された細胞質を保護します。調査セルの種類の Mrna の豊かさによって異なりますまたマルチプレックス RT-PCR による単一細胞の成功率。例えば、アストロ サイトは、比較的低い線量3における Mrna を表現で得られる利回...

大脳皮質には、様々 な生理学的なプロセスに関与する様々 な細胞タイプが装備されています。同定と解析、固有の機能を理解する前提条件することができます非常に挑戦的な大脳皮質細胞の種類1 を特徴付ける大きな形態学的、生理学、分子多様を与え、2,3,4。
単一セル多重 RT-PCR は、パッチ ・ クランプと RT-PCR 技術の組み合わせに基づいています。それは同時に生理識別されたセル5以上 30 事前定義された遺伝子の発現を調べることができます。さらに録音ピペットで神経トレーサーのインクルー ジョンにより、組織化学的啓示6,7,8,9,後記録された細胞の形態的特性10ですその形質5,9,10、11,12 の多変量解析に基づく神経型の分類に非常に便利な技だ。 ,,1314。単一のセル マルチプレックス RT-PCR によるアストロ サイト15,16,17など非神経細胞の特性に適しています、すべての脳構造18、事実上適用ことができます。 19,20,21,22,23とセル型、全細胞構成で記録できると仮定すると。
この手法は、非常に便利な細胞源の同定や伝送システム7,8,15,16,20,21、ターゲット 24,25,26,27,28, 特定の抗体が不足している場合は特に。それは視覚的に識別されたセルの29日からのホールセルパッチク ランプ記録に依存し、したがって特定の細胞環境8,15,16セルのターゲットができます。さらに脳スライスにおける脳組織の細胞構築が保持されるのでこの方法もできます神経および非神経要素7,8の特徴の細胞の解剖学的関係の検討,18。
この手法は、細胞質の収穫の量によって、RT の効率によって限られているので、低コピー数で表される mRNA の検出は難しくなります。高-高価なシーケンサーが必ずしも必要があります彼ら30,31,,単一のセル3,4の全トランスクリプトームを解析する RNaseq 技術に基づいて他のアプローチを可能にしますすべての研究室が使用できます。単一セル多重 RT-PCR 法は、エンドポイント PCR を使用しているためにだけ広く利用可能な thermocyclers が必要です。電気生理学的セットアップ装備研究所で簡単に開発することができ、高価な機器を必要としません。1 日の内で、定義済みの一連の遺伝子の表現の質的分析を提供できます。したがって、このアプローチは、迅速な方法で単一細胞の分子特性解析へ簡単にアクセスを提供します。

<table><tbody><tr><td>MACAW v.2.0.5</td><td>NCBI</td><td></td><td>プライマー設計のためのマルチプルアラインメント</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>VWR</td><td>443852A</td><td>RT</td></tr><tr><td>ランダムプライマー</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>11034731001</td><td>RT</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-4065-52</td><td>RTおよびPCR</td></tr><tr><td>RNasin リボヌクレアーゼ阻害剤</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>RT</td></tr><tr><td>SuperScript II 逆転写酵素</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td>RT</td></tr><tr><td>Taq DNA ポリメラーゼ</td><td>Qiagen</td><td>201205</td><td>PCR</td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M5904-5ML</td><td>PCR</td></tr><tr><td>PCR プライマー</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td><td>PCR / 脱塩および200 &microで希釈;M</td></tr><tr><td>チューブ、0.5 mL、フラットキャップ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0350</td><td>RT および PCR</td></tr><tr><td>BT10 シリーズ - 10 &micro;L フィルターチップ</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT10</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>BT20 Series - 20 &micro;L フィルターチップ</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT20</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>BT200 Series - 200 &micro;L フィルターチップ</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT200</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>BT1000 Series - 1000 &micro;L フィルターチップ</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT1000.96</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>DNA Thermal Cylcer</td><td>Perkin Elmer Cetus</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>E1510-10ML</td><td>アガロースゲル電気泳動</td></tr><tr><td>Tris-Borate-EDTAバッファー</td><td>Sigma-Aldrich(メルク)</td><td>T4415-1L</td><td>アガロースゲル電気泳動</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td>ア<td>ガロースゲル電気泳動</td></tr><tr><td>&Phi;X174 DNA-Hae III Digest</td><td>NEB (New England BioLabs)</td><td>N3026S</td><td>アガロースゲル電気泳動</td></tr><tr><td>EDA 290</td><td>コダック</td><td></td><td>アガロースゲル電気泳動</td></tr><tr><td>電源 EPS 3500</td><td>Pharmacia Biotech</td><td></td><td>アガロースゲル電気泳動</td></tr><tr><td>Midi 水平電磁気球 ユニットモデル SHU13</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td><td>アガロースゲル電気泳動</td></tr><tr><td>サテンの外観の滑らかな紙</td><td>フィッシャーブランド</td><td>1748B</td><td>パッチ クランプ内部溶液</td></tr><tr><td>カリウム ヒドロキシド</td><td>Sigma-Aldrich (メルク)</td> <td>60377</td><td>パッチ クランプ内部溶液</td></tr><tr><td>エチレングリコール-ビス (2-アミノエチルエーテル)-N,N,N&prime;,N&prime;-四酢酸</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>E3889</td><td>パッチ クランプ内部溶液</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H4034</td><td>パッチ クランプ内部溶液</td></tr><tr><td>D-グルコン酸カリウム</td><td>Sigma-Aldrich (メルク)</td> <td>G4500</td><td>パッチ クランプ内部溶液</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich (メルク)</td> <td>M1028</td><td>パッチ クランプ内部溶液</td></tr><tr><td>5500 蒸気圧浸透圧計</td><td>Wescor</td><td></td><td>パッチ クランプ内部溶液</td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich (メルク)</td><td>B4261</td><td>パッチクランプ内部溶液</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich(メルク)</td><td>S5016</td><td>スライス調製</td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース一水和物</td><td>Sigma-Aldrich(メルク)</td><td>49159</td><td>スライス調製</td></tr>ナトリウム<tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich(メルク)</td><td>S6191</td>スライス<td>調製</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich(メルク)</td><td>60128</td><td>スライス調製</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich(Merck)</td><td>31437-M</td><td>スライス調製</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性</td><td>Sigma-Aldrich(メルク)</td><td>S5011</td><td>スライス調製</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich(メルク)</td><td>63069</td><td>スライス調製</td></tr><tr><td>塩化カルシウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich(メルク)</td><td>21115</td><td>スライス調製</td></tr><tr><td>キヌレン酸</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>K3375</td><td>スライス調製</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Piramal Healthcare UK</td><td></td><td>スライス調製</td></tr><tr><td>VT 1000S</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>14047235613</td><td>スライス調製</td></tr><tr><td>過酸化水素溶液</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H1009</td><td>パッチクランプセットアップ洗浄</td></tr><tr><td>フィラメント</td><td>付き薄肉ガラスキャピラリーワールド精密機器</td><td>TW150F-4</td><td>パッチクランプ</td></tr><tr><td>PP-83</td><td>ナリシゲ</td><td></td><td>パッチクランプ</td></tr><tr><td>エッペンドルフ マイクロローダー</td><td>エッペンドルフ</td><td>5242956003</td><td>パッチクランプ</td></tr><tr><td>BX51WI 正立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td></td><td>パッチクランプ</td></tr><tr><td>XC-ST70/CE CCD B/W ビデオカメラ</td><td>ソニー</td><td></td><td>パッチクランプ</td></tr><tr><td>Axopatch 200B アンプ</td><td>モレキュラーデバイス</td><td></td><td>パッチクランプ</td></tr><tr><td>Digidata 1440</td><td>モレキュラーデバイス</td><td></td><td>パッチクランプ</td></tr><tr><td>pCLAMP 10 ソフトウェアスイート</td><td>モレキュラーデバイス</td><td></td><td>パッチクランプ</td></tr><tr><td>10mLシリンジ</td><td>テルモ</td><td>SS-10ES</td><td></td></tr><tr><td>ストレートボディ Eシリーズ (ホルダー)</td><td>Phymep</td><td>64-0997</td><td>Expelling</td></tr><tr><td>Na phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S7907</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S8282</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>P6148</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>X100</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>冷水魚の皮</td><td>からのゼラチンSigma-Aldrich (Merck)</td><td>G7041</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11223</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>Histochemical revelation</td></tr></tbody></table>

パッチ ・ クランプ後単一のセル多重逆のトランスクリプション ポリメラーゼ連鎖反応

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

大脳皮質は多数の細胞の種類様々 な形態学的、生理学、分子機能を展示で構成されます。この多様性は、これらの細胞の種類、固有の機能を研究するための前提条件の簡単な同定と解析を妨げます。この記事では、パッチ ・ クランプのスライスに記録後、単一のセルに同時に遺伝子の発現を検出するにより多重単一セル逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) プロトコルについて説明します。この単純な方法は形態的特性と実装でき、血管近傍などさまざまなセルタイプおよび彼らの特定の細胞の環境の形質を決定することも多い。この議定書の原則は記録するセルを収穫し、逆に、パッチ ・ クランプの技術ではその細胞質の内容を書き写す、マルチプレックス pcr 法の定性的検出する遺伝子の定義済みセットの式。PCR のプライマーおよび RT-PCR 法と互換性がある細胞内のパッチ ・ クランプ ソリューションの注意深いデザインを必要があります。選択的かつ信頼性の高い成績を確保するため検出、この手法には細胞質が増幅ステップに収穫から適切なコントロールも必要です。注意ここで説明は厳密に従う必要があります、実質的に任意の電気生理学的検査は、RT - pcr マルチプレックスの単一のセルを使用できます。

マルチプレックス RT-PCR 法の代表的な検証を図 3に示します。プロトコルは、同時に 12 の異なる遺伝子の発現を調べるために設計されました。小胞グルタミン酸トランスポーター vGluT1 は、グルタミン酸作動性ニューロン42の肯定的な制御として取られました。GABA 合成酵素 (GAD65 と歩き 67)、ニューロペプチド Y(NPY)、およびソマトスタチン (SOM) は、gaba 作動性介在ニューロンの3、5,11のマーカーとして使用されました。シクロオキシゲナーゼ 2 酵素 (COX-2) は、錐体細胞のサブ人口3,16のマーカーとして使用されました。<...

このプロトコルでは、重要なステップとパッチ ・ クランプ後単一のセル多重逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を実行に必要な注意事項をについて説明します。この手法は、あらかじめ決められた一連のホールセルパッチク ランプ記録によって特徴付けられる単一細胞からの遺伝子発現プロファイルを解析するシンプルで効果的な方法です。

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

この方法は、神経集団の特性評価や伝達システムの発生源と標的の特定など、神経科学研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、単一細胞から事前に選択された遺伝子セットの発現プロファイルを迅速かつ容易に決定できることです。したがって、この方法はランダムダイバーシティマウスについての洞察を提供することができます。また、アストロサイトや多くの動物モデルなど、他の細胞タイプにも適用できます。この方法のデモンストレーションは、データの分析には大量の細胞質が必要なため、アグレッションステップとアスピアーリングステップの習得が難しい場合があるため、非常に重要です。切片化する前に、手術用ハサミ、細かい虹彩ハサミ、2つのヘラ、鉗子、ペーパーフィルターのディスク、シアノアクリレート接着剤を含む解剖キットを準備します。次に、氷冷した切断液をカーボジンで飽和させ、切断チャンバーを摂氏マイナス20度で冷却します。次に、動物の頭皮を取り除き、頭蓋骨を開きます。脳を慎重に抽出し、カルボゲン化氷冷切断液で満たされた小さなビーカーに入れます。その後、カッティングチャンバーをマイナス20°Cから取り外し、ペーパータオルで水分を落とします。脳を慎重に解剖して、関心のある領域を分離します。それをカッティングチャンバーに接着し、カーボジン化された氷冷カッティング溶液を加えます。ビブラトンを使用して、300マイクロメートルの厚さのスライスをセクション化します。スライスを酸素化切断液で満たされた休息チャンバーに室温で移し、少なくとも30分間回復させます。シングルセルRT-PCRおよび標的細胞の特性評価では、mRNAseを保存するために、全細胞の記録を20分以内に制限してください。記録の最後に、2マイクロリットルの5xRTミックスと0.5マイクロリットルの20xDTTで満たされた500マイクロリットルのPCRチューブを準備します。紡いで氷の上に保存します。次に、穏やかな負圧を加えて細胞の細胞質を採取します。細胞の内容物がピペットに入るのを防ぎながら、しっかりと密閉された状態を保ちながら監視および制御し、一部の遺伝子が考慮される場合は核の収集を回避します。遺伝子の場合、核の収集を避け、gDNAを増幅することを目的とした一連のプライマーを含めて、一般的な汚染に備えることが不可欠です。核がピペットの先端に近づいている場合は、負圧を解除してピペットを離します。密閉性が保たれていることを確認し、新しいピペット位置で細胞質の採取を再開します。次に、ピペットを静かに引き抜いて外側のアウトパッチを形成し、細胞外破片による汚染を制限し、その後の組織化学分析のために細胞膜を閉鎖します。ナブ、マイクロマニピュレーター、コンピューターキーボード、またはコンピューターマウスは、プロトンを帯電したRNAーゼ汚染源

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神経科学

発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

ニューロンは、最初の電気生理学的に特徴づけられる。その後、記録されたニューロンから細胞質を吸引し、神経伝達物質合成酵素、イオンチャンネル、受容体のmRNAの発現を検出するために転写-...

シングルセルRT - PCR技術を用いて黒質神経細胞に電位依存性カリウムチャネルのmRNA発現のプロファイリング

単一細胞の発現プロファイリングは、個々の細胞の詳細な遺伝子発現解析が可能になります。我々は心筋細胞の単離のための方法を説明し、特定のターゲットの全トランスクリプトームのマイクロアレイや定量PCRのどちらかの結果のライセートを調製した。...

成体マウスの心筋細胞の単一細胞転写プロファイリング

単一網膜細胞およびそれらのcDNAのその後の増幅を単離するための方法が説明されています。単一細胞トランスクリプトーム組織内に存在する細胞の不均質性の程度を明らかにし、まれな細胞集団の新たなマーカー遺伝子を発見します。付随するプロトコルは、多くの異なる種類の細胞に合わせて調整することができます。...

単一セルの開発のプロファイリングと成熟網膜神経細胞

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚におけるマウトナーニューロンおよび他の細網脊髄細胞の電気的特性を研究する方法である、全細胞パッチクランプ電気生理学と呼ばれる技術を説明しています。...

全細胞パッチクランプ電気生理学:ニューロンの電気的特性を研究する方法

多電極パッチクランプ記録は、複雑なタスクを構成する。ここでは、実験的な手順の多くを自動化することによって、それがパフォーマンスと録音の数の質的向上につながるプロセスを加速することが可能であるか、を示します。...

コンピュータ支援多電極パッチクランプシステム

ここで説明するには、セルに接続されたパッチクランプ技術を用いて1イオンチャネルから現在の記録の長いストレッチを取得するための手順です。この方法は、リアルタイムで、観察するための生体信号の基礎となる開閉チャネルコンフォメーションのパターンを可能にする。これらのデータは、邪魔されずに生体膜におけるチャネルのプロパティをお知らせ。...

一チャネルセル付パッチクランプ法

このプロトコルは、クローンレベルでの遺伝子の大規模な配列の発現を評価する方法について説明します。単一細胞RT-qPCRをサンプルと数百の遺伝子のための強力な感度を有する信頼性の高い結果が得られます。...

レアリンパ集団の不均一性を特徴づけるためにマルチプレックスRT-qPCRのを使用した単一細胞の遺伝子発現

この記事では、HEK293細胞を用いた電気生理学的全細胞パッチクランプ記録により、チャネルロドプシンのイオン選択性がどのように決定されるかを説明しています。ここでは、陰イオン選択性チャネルロドプシンの塩化物選択性を調べるための実験手順を示します。しかしながら、この手順は、異なる選択性を有する他のチャネルロドプシンに移管可能である。...

チャンネルロドプシンにおけるイオン選択性の電気生理学的測定のための全細胞パッチクランプ記録

ここでは、マウス胚組織における遺伝子発現をプロファイルする多重化単一細胞mRNAシーケンシング法を提示した。多重化戦略と組み合わせた液滴ベースの単一細胞mRNAシーケンシング(scRNA-Seq)法は、複数のサンプルから単一細胞を同時にプロファイルできるため、試薬コストを大幅に削減し、実験的なバッチ効果を最小限に抑えることができます。...

マウス胚細胞の多重化単細胞mRNAシーケンシング解析

学ぶパッチクランプ後単一細胞多重RT-PCR法。神経細胞の遺伝子発現プロファイルを解析し、脳内細胞多様性と機能特性を解明する強力なツールです。

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