パッチ ・ クランプ後単一のセル多重逆のトランスクリプション ポリメラーゼ連鎖反応

この方法は、神経集団の特性評価や伝達システムの発生源と標的の特定など、神経科学研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、単一細胞から事前に選択された遺伝子セットの発現プロファイルを迅速かつ容易に決定できることです。したがって、この方法はランダムダイバーシティマウスについての洞察を提供することができます。

また、アストロサイトや多くの動物モデルなど、他の細胞タイプにも適用できます。この方法のデモンストレーションは、データの分析には大量の細胞質が必要なため、アグレッションステップとアスピアーリングステップの習得が難しい場合があるため、非常に重要です。切片化する前に、手術用ハサミ、細かい虹彩ハサミ、2つのヘラ、鉗子、ペーパーフィルターのディスク、シアノアクリレート接着剤を含む解剖キットを準備します。

次に、氷冷した切断液をカーボジンで飽和させ、切断チャンバーを摂氏マイナス20度で冷却します。次に、動物の頭皮を取り除き、頭蓋骨を開きます。脳を慎重に抽出し、カルボゲン化氷冷切断液で満たされた小さなビーカーに入れます。

その後、カッティングチャンバーをマイナス20°Cから取り外し、ペーパータオルで水分を落とします。脳を慎重に解剖して、関心のある領域を分離します。それをカッティングチャンバーに接着し、カーボジン化された氷冷カッティング溶液を加えます。

ビブラトンを使用して、300マイクロメートルの厚さのスライスをセクション化します。スライスを酸素化切断液で満たされた休息チャンバーに室温で移し、少なくとも30分間回復させます。シングルセルRT-PCRおよび標的細胞の特性評価では、mRNAseを保存するために、全細胞の記録を20分以内に制限してください。

記録の最後に、2マイクロリットルの5xRTミックスと0.5マイクロリットルの20xDTTで満たされた500マイクロリットルのPCRチューブを準備します。紡いで氷の上に保存します。次に、穏やかな負圧を加えて細胞の細胞質を採取します。

細胞の内容物がピペットに入るのを防ぎながら、しっかりと密閉された状態を保ちながら監視および制御し、一部の遺伝子が考慮される場合は核の収集を回避します。遺伝子の場合、核の収集を避け、gDNAを増幅することを目的とした一連のプライマーを含めて、一般的な汚染に備えることが不可欠です。核がピペットの先端に近づいている場合は、負圧を解除してピペットを離します。

密閉性が保たれていることを確認し、新しいピペット位置で細胞質の採取を再開します。次に、ピペットを静かに引き抜いて外側のアウトパッチを形成し、細胞外破片による汚染を制限し、その後の組織化学分析のために細胞膜を閉鎖します。ナブ、マイクロマニピュレーター、コンピューターキーボード、またはコンピューターマウスは、プロトンを帯電したRNAーゼ汚染源であることに注意してください。

録音中に触れた場合は、手袋を交換してください。続いて、ピペットをエクスペラーに取り付け、正圧を加えて内容物をPCRチューブに排出します。ピペットの先端をPCRチューブに割って、内容物の収集を助けます。

次に、チューブを短時間遠心分離し、0.5マイクロリットルのRNAse阻害剤と0.5マイクロリットルのRTAseを追加します。穏やかに混合し、再度遠心分離し、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、チューブを回転させ、摂氏マイナス80度で最大数か月間保管します。

PCR分析まで、最初の増幅ステップを実行します。PCRを検証するには、プライマーペアを混合して希釈し、シングルセルRTPCR専用のピペットで1マイクロモルを追加します。サーモサイクラーを摂氏95度で3分間セットし、40サイクル実行した後、摂氏72度で最終伸びステップを5分間実行します。

プライマーダイマーの形成を最小限に抑えるには、摂氏95度に予熱したサーモサイクラーにPCRチューブを配置してホットスタートを行います。30秒後、オイルの上に20マイクロリットルのプライマーミックスをすばやく排出します。プライマーペアが検証されたら、マルチプレックスプロトコルでテストします。

外部プライマーを1マイクロモルで混合して希釈します。マルチプレックスプライマーミックスをマイナス20°Cで最大数週間保存します。次に、プレミックスを準備して氷の上に置きます。

PCRチューブをフリックして回転させ、ミネラルオイルを2滴加えます。摂氏95度で3分間過ごした後、20回のPCRサイクルを実行します。20マイクロリットルのマルチプレックスプライマーミックスで説明したようにホットスタートを実行します。

次に、解析する遺伝子の数と同じ数のPCRチューブを準備します。1遺伝子につき1マイクロリットルの第1PCR産物をテンプレートとして、プレミックスを調製します。解析する遺伝子の数に応じてすべての容量を調整し、ピペッティングエラーを補正するために10%の追加容量を使用することを検討してください。

穏やかに振とうし、チューブを回転させ、80マイクロリットルのプレミックスを各PCRチューブに送り出します。チューブの壁やキャップに触れないように、チューブごとに2滴の鉱油を追加します。35 PCR サイクルを実行した後、20 マイクロリットルの内部プライマー混合物を排出してホットスタートを行います。

2番目のPCRプロジェクトをアラゴーゼゲル電気泳動で解析します。第5層の錐体ニューロンは、その大きな体細胞と顕著な頂端樹状突起によって視覚的に識別されました。プルセル記録により、第5層の規則的なスパイクニューロンの典型的な電気生理学的特性が明らかになり、低入力抵抗、長時間の活動電位、および顕著なスパイク周波数適応が明らかになりました。

このニューロンの分子解析により、vGluT1の発現が明らかになり、そのグルタマイト作動性表現型が確認されました。このニューロンは、ソマトスタチンとATP1-α-1、およびナトリウム-カリウムATPAの3つのサブユニットも発現しました。記録されたニューロンのバイオサイトン標識により、錐体様の形態が確認されました。

グルタマイト作動性ニューロンから予想されるように、26層5錐体細胞の分子解析により、vGluT1の発現は明らかになりましたが、2つのGADのいずれも発現しませんでした。一度の技術は、それが適切に準備されていれば、2日以内に行うことができます。この手順を試みるときは、汚染を避けるために細心の注意を払うことを覚えておくことが重要です。

このビデオを見た後、脳スライスによるパッチ凝集を特徴とする単一細胞から、細胞質採取、逆転写、ホットスタートPCRの後、数十の遺伝子の発現を同時に調べる方法についてよく理解できるはずです。臭化エチジウムでの作業は非常に危険であり、この手順を実行する際には手袋や白衣の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。