Microrespiration 分析と顕微解剖を使用して冬の発芽を調査

ここで紹介する手順の全体的な目標は、遺伝子転写産物のレベルを評価できるように、胞子発芽の段階を特定することです。これらの変化を分析すると、病気の拡散の重要な段階に関するさらなる知識が得られます。この方法は、遺伝子転写産物レベルの変化に関連し、したがって遺伝子発現制御の変化を反映するテリオスポア発芽中の遷移に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、目に見える形態学的スイッチに対応しない呼吸レベルの遷移を特定し、発芽の明確な段階でテリオスポアを物理的に分離できることです。この技術は、胞子の発芽における重要な遷移を特定できるため、病原体の拡散の制御に影響を及ぼします。これにより、変更すれば病気の蔓延を阻止できる可能性があります。この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、トウモロコシの穂軸感染、テリオスポアの収穫、およびテリオスポアの生存率と発芽試験から開始します。

発芽を誘導するには、まず、各呼吸実験で同量のテリオスポアを計量します。バイオセーフティキャビネットで、テリオスポアをオートクレーブ滅菌された呼吸チャンバーに追加します。チャンバーをジャガイモのデキストロースブロスで満たし、硫酸ストレプトマイシンと硫酸カナマイシンを補給します。

ピペットを上下に動かして、テリオスポア懸濁液を作成します。チャンバーの蓋をチャンバーに配置して、気密シールを作成します。OCR測定値を取得するには、まずチャンバーをウォーターバス内のチャンバーラックに置きます。

次に、酸素プローブをチャンバーの開口部内に配置します。センサートレースレートプログラムにリアルタイムで表示されるデータポイントを監視します。プローブをチャンバーに入れた後、約3分間プローブを安定させます。

「測定」をクリックすると、酸素レベルが 6 時間連続して測定され、測定値は 2 秒間隔で記録されます。測定を停止し、分析するサンプルごとにこれらの手順を繰り返してから、データをMicrosoft Excelにエクスポートし、テキストプロトコルで説明されているようにデータ分析を実行します。約10ミリグラムのウマトゥステリオスポアを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れます。.

ステリオスポアを500マイクロリットルのPDBに懸濁し、硫酸ストレプトマイシンを補給します。培地にテリオスポアの塊がなくなるまで、静かにピペットで混ぜます。テリオスポア懸濁液を、PDBを含み、硫酸ストレプトマイシンを添加したオートクレーブ処理した250ミリリットルのErlin Meyerフラスコに移します。

フラスコを摂氏28度で一晩インキュベートし、90RPMで振とうします。ペトリ皿の上部に5マイクロリットルの蒸留水を4〜5滴ピペッティングして、ペトリ皿を準備します。次に、サンプル収集に使用するRNA安定化溶液の2マイクロリットルの液滴を3つペトリ皿にピペットで移します。

また、ペトリ皿に発芽するテロスポアの5マイクロリットルの液滴30個をピペットで固定します。ペトリ皿に15ミリリットルの鉱油を加えます。続行する前に、すべての液滴がオイルで覆われていることを確認してください。

次に、間径15ミクロン、フランジ1mm、長さ55ミリリットル、先端角20度のマイクロキャピラリーを作製します。それをマイクロキャピラリーホルダーに入れ、鉱物油に沈めると、毛細管現象により鉱物油がマイクロキャピラリーに入ることができます。マイクロキャピラリー内の圧力を逃がしてから、水滴に持っていきます。

水で微小毛細管を調製するために吸引します。マイクロマニピュレータの制御を使用して、準備したマイクロキャピラリーを発芽液滴の1つに移動し、液滴を貫通させます。マイクロキャピラリーを下げ、目的の発芽の段階でマイクロキャピラリーの口を発芽するテリオスポアまで持ってきます。

発芽するテリオスポアを捕らえるためにゆっくりと吸引します。テリオスポアが微小毛細血管に入ったら、吸引を停止します。マイクロキャピラリーに約5つのテリオスポアができるまで繰り返します。

マイクロマニピュレーターでマイクロキャピラリーを浮き上がらせ、RNA安定化液の採取液滴に持っていきます。液滴を貫通し、液滴にテリオスポアを注入します。これらの手順を繰り返して、約1,000個のテリオスポアを捕捉します。

採取液滴を回収するには、採取液滴をピペットで持ち上げ、RNAのDNAの遊離2.0ミリリットルmicrocenterfugeチューブの蓋に移します。ピペットで鉱物油を慎重に、収集液滴を乱さないようにします。テリオスポアは、RNA単離などのダウンストリームアプリケーションに使用できるようになりました。

このプロットは、発芽を誘導されたテリオスポアの懸濁液の酸素レベル変化を評価した典型的な結果を示しています。誘発されていないテリオスポアと比較して、呼吸の開始を示す分離は約30分で発生します。サンプルをセットアップして酸素プローブに輸送するのに約15分かかることを考えると、この時間は実際には45分です。

ここに示されているのは、テリオスポアの発芽の5つの段階です。ステージ1では、テリオスポアは発芽するように誘導されますが、発芽の形態学的徴候は示されません。第2段階のテロスポアは、テリオスポアの直径よりも短い長さの現れた前菌糸体を示しています。

ステージ3では、前菌糸体の長さはテリオスポアの直径よりも大きくなります。ステージ4は、担子胞子が付着した前菌糸体を特徴としています。そして第5段階では、担子胞子が芽生えています。

ここでは、非同期に発芽するテリオスポアが示され、マイクロキャピラリーがステージ3のテリオスポアの近くに配置されています。次に、ステージ3のテリオスポアをマイクロキャピラリーに吸引し、一滴の収集溶液に移します。習得すると、このマイクロダイセクション技術は、6〜7時間で1, 000のステージ特異的なテリオスポアを分離するために使用できます。

この手順を試みるときは、頻繁に休憩を取ることを忘れないでください。このビデオを見た後、形態学的に異なる発芽段階で胞子を物理的に分離する方法を十分に理解しているはずです。そして、呼吸開始のタイミングを特定します。

一般的に、この方法に不慣れな人は、無菌性を維持する必要があるため、苦労します。そして、忍耐力とマイクロダイセクションによる細胞タイプの分離の必要性。この技術の開発は、真菌植物病理学者が、世界の食料安全保障を脅かす壊滅的なスマットやさび病菌の発芽の形態学的および分子的側面を探求する道を開くものです。

この手法は私たちリゴマティストにも当てはまりますが、年間数十億ドルの損失をもたらす他の多くの壊滅的な農作物病原体にも使用される可能性があります。この手順に続いて、RNA単離などの他の方法を実行して、転写産物レベルの変化のプロファイルとタイミングなどの追加の質問に答えることができますか?