Name: 効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hPSCs から (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 学ぶ、hPSCからPDX1+膵前駆細胞を効率的に誘導する接着培養法。均一な単層培養により遺伝子操作とスクリーニングを容易にし、膵臓発生の研究と再生医療への応用を促進します。

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この仕事はから資金援助によって日本社会のための科学振興) Scientific Research (C) (日本学術振興会科研費補助金 Number15K09385 と 18 K 08510) を通じてに科研費と技術移転、日本学術振興会研究員 (日本学術振興会科研費助成番号の部分で支えられました17J07622) A.K.、および医学研究開発 (アメッド) その研究を通じて機構に k. o. に「iPS 細胞研究、再生医療実現に向けた研究センター ネットワークの中核拠点」を付与著者が原稿を読んで博士ピーター Karagiannis をありがちましょう。

HPSCs を用いた実験は、医学科と京都大学大学院医学研究倫理委員会で承認されました。
1 材料の準備
注:無菌環境で細胞培養のため、すべてのメディアと試薬を準備します。ウォーム アップを使用する前に室温 (RT) 基本培地。媒体の差別化は試薬のルート詳細を 6 時間以内に使用される材料のテーブルに表示されます。
<ol><li>
分化 (図 1 a)
	<ol>
<li>ステージ 1 a 媒体: 転送ピペットを使用してチューブに RPMI 1640 媒体。無血清サプリメント、アクチビン A、CHIR99021、および Y-27632 を 1 倍、100 ng/mL、3 μ M と 10 μ M の濃度にそれぞれ追加します。</li>
		<li>ステージ 1 b 中: 転送ピペットを使用してチューブに RPMI 1640 媒体。無血清サプリメント、アクチビン A と 1 x、100 ng/mL、1 μ M の濃度 CHIR99021 をそれぞれ追加します。 注: CHIR99021 の濃度は、ステージ 1 a の中でより低いべきと添加が不要で、細胞数は大きくなります。</li>
		<li>ステージ 2 メディア: ピペットを使用してチューブに転送改善 MEM (iMEM) 媒体。無血清サプリメントとケラチノ サイト成長因子 (KGF) を 0.5 倍と 50 ng/mL の濃度にそれぞれ追加します。</li>
		<li>ステージ 3 媒体: ピペットを使用してチューブに iMEM 媒体。無血清サプリメント、KGF、酒を飲むこと、3-ケト-N-アミノエチル-N'を追加 - aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC)、ピペットによる 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic 酸 (TTNPB)濃度 0.5 x 50 ng/mL、100 ng/mL、0.5 μ M と 10 nM、それぞれ。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
フローサイトメトリー (FCM)
	<ol>
<li>透過/洗浄バッファー x 1: 管にピペットで水を転送します。1 x の濃度にピペットで透過/洗浄バッファーを追加します。</li>
		<li>FCM ソリューションをブロック: 管にピペットで透過/洗浄バッファー x 1 を転送します。ロバ血清ピペット濃度 2% (巻/巻) に追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
免疫染色
	<ol>
<li>ソリューションをブロック: 転送ダルベッコ Phosphate-Buffered 生理食塩水 (DPBS) ピペットによって管に。ロバ血清およびトリトン X ピペットで 5% (巻/巻)、0.4% (巻/巻) の濃度をそれぞれ追加します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hPSC 後部前腸細胞/膵前駆細胞への分化 (PDX1 細胞の+ )
注:生殖不能の技術を使用してすべての手順を実施します。hPSCs は、製造元の指示17,26によると hPSC 培地と hPSCs の合成表面素材を施した 6 ウェル プレートで保持されます。細胞に達する 50-80% の confluency (ステージ 0) は差別化のためそれらを使用します。
<ol><li>
基底膜マトリックス コーティング プレートを準備します。
	<ol>
<li>転送管に RPMI 1640 (4 °C) の 6 mL は 4 °C 氷の上に冷却されます。基底膜マトリックス (4 °C) 冷却 1 mL ピペット チップで 2 mg を追加し、0.33 mg/mL 基底膜マトリックスに穏やかなピペッティングでよく混ぜます。</li>
		<li>ピペットで 6 も細胞培養プレートの各ウェルに希薄化後の基底膜マトリックスの 2 mL を転送します。37 °C の定温器で 60-90 分でプレートを配置します。その後、(3 h) 内で使用するまで RT でプレートを保ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
シード、hPSCs、(ステージ 1 a) 決定的な内胚葉への分化を開始します。
	<ol>
<li>使用される媒体を吸引し、6 ウェル プレートで培養した hPSCs を洗浄するピペットによってウェルあたり 0.5 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) (RT) 2 mL を追加します。</li>
		<li>0.5 mM EDTA を吸引し、ピペットでよく当り 0.5 mM EDTA の 2 mL を追加します。37 °C で 5 分で版を孵化させなさい。</li>
		<li>0.5 mM EDTA を吸引し、10 μ M を添加した常温 hPSC 培地 1 mL を追加あたりピペットによってよく Y-27632。ピペットの優しく、迅速を吹き飛ばすセルおよび単一セル周辺固定支持細胞を分離するに皿の上を添付します。ピペッティング時に細胞懸濁液をバブルアップしません。</li>
		<li>HPSC 常温 10 μ M を添加した培地 4 mL を含む 50 mL 遠心チューブに細胞懸濁液を転送 Y-27632。細胞懸濁液をピペット優しく。</li>
		<li>トリパン ブルー染色除外手順を使用して細胞懸濁液の細胞数をカウントします。<ol>
<li>細胞懸濁液の管内トリパン ブルーの 15 μ L ミックス 15 μ L。</li>
			<li>複製内のスライドをカウントするセルに 10 μ L ピペットでトリパン ブルーで希釈細胞懸濁液の 10 μ L を転送します。</li>
			<li>セルの自動カウンター番号セルをカウントし、細胞懸濁液の細胞密度を計算します。生存率は、通常 > 98%。</li>
		</ol>
</li>
		<li>6 ウェル プレート (1 〜 1.5 × 105セル/cm2) の井戸あたり 10 の6セル × 1 1.5 で 50 mL の遠心管の細胞懸濁液の約数。</li>
		<li>200 x gで RT 5 分で 50 mL のチューブを遠心します。</li>
		<li>ピペットを使用して上清を吸引し、ウェルあたり 1 ml のステージ 1 a 媒体 (RT) の細胞を再懸濁します。優しく細胞懸濁液をピペット、ステージ 1 a 媒体 (ウェルあたりの合計、2 mL) の別の 1 mL を追加します。</li>
		<li>2.1.2 の手順で 1,000 μ L ピペットにより作製した細胞培養皿の井戸で希薄化後の基底膜マトリックスを吸い出しなさい。すぐに次のステップに進みます。</li>
		<li>もう一度ステップ 2.2.8 に細胞懸濁液をピペット優しく。混合直後後 6 ウェル プレートの各ウェルに、細胞懸濁液 (2 mL) を転送します。カバー プレートを光から保護するためにアルミ箔をプレート。RT で 10-15 分のためのクリーン ベンチでプレートを配置します。 注:播種後プレートを移動しないでください。</li>
		<li>37 °C、5% CO2インキュベーター (加湿雰囲気)、24 h の文化にプレートをそっと置きます。 注:播種後プレートを振るか。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
決定的な内胚葉 (ステージ 1 b) への分化を誘導します。
	<ol>
<li>使用される媒体を吸引し、ピペットによって井戸に DPBS 2 mL を追加します。吸引と DPBS 添加 1 回繰り返します。 注:単層から任意の死んだ細胞を削除するには、各吸引前にプレートを軽く振る。</li>
		<li>使用 DPBS をピペットで吸引し、ステージ 1 b 中 (37 °C) ウェルあたり 4 mL を追加します。48 h の 37 °C の定温器 (5% CO2の加湿雰囲気) 文化にプレートをそっと置きます。</li>
		<li>使用される媒体を吸引し、井戸の中にピペットで DPBS 2 mL を追加します。吸引と DPBS 添加 1 回繰り返します。 注:各吸引前に穏やかな揺れで単層から死んだ細胞を削除します。</li>
		<li>使用 DPBS をピペットで吸引し、ステージ 1 b 中 (37 °C) ウェルあたり 4 mL を追加します。インキュベーター (37 °C、5% CO2の加湿雰囲気) と 24 h の文化にプレートをそっと置きます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
原始腸チューブ (ステージ 2) への分化を誘導します。
	<ol>
<li>使用される媒体を吸引し、井戸の中にピペットで DPBS 2 mL を追加します。 注: 各吸引前に穏やかな揺れで単層から死んだ細胞を削除します。</li>
		<li>使用 DPBS をピペットで吸引し、ステージ 2 メディア (37 °C) ウェルあたりの 4 つの mL を追加します。4 日間のインキュベーター (37 °C、5% CO2の加湿雰囲気) と文化にプレートを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PDX1 への分化を誘導する+細胞 (ステージ 3)。
	<ol>
<li>使用される媒体を吸引し、井戸の中にピペットで DPBS 2 mL を追加します。吸引と DPBS 添加 1 回繰り返します。</li>
		<li>使用の DPBS をピペットで吸引し、ステージ 3 媒体 (37 °C) ウェルあたりの 4 mL を追加します。3 日間のインキュベーター (37 °C、5% CO2の加湿雰囲気) と文化にプレートを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
膵内分泌細胞への分化を誘導します。
	<ol>
<li>前述のプロトコル3,16,26NKX6.1+細胞誘導 (8 日間のステージ 4) 内分泌細胞誘導 (ステージ 5、12 日間) 続くを実行します。特徴および免疫染色と定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT PCR) 解析による内分泌細胞の分化を検証します。 注:豊田ら16木村ら26実験手順の詳細についてを参照してください。QRT pcr 用プライマー シーケンスの表 1を参照してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3 フローサイトメトリー (FCM)
<ol><li>使用される媒体を吸引し、井戸の中にピペットで 0.5 ミリメートルの EDTA の 2 mL を追加します。吸引と 0.5 mM EDTA 添加 1 回繰り返します。 注:優しく単層細胞ごと吸引する前にから任意の死んだ細胞を削除するプレートを振る。</li>
	<li>(約 3-6 × 106ウェルあたりの細胞) の細胞を分離、0.25% の 2 mL を加えてトリプシン ウェルあたり 0.5 mM EDTA を含みます。37 °C で 5-10 分で版を孵化させなさい。</li>
	<li>単一セル周辺固定支持細胞を分離、すばやく、やさしくピペットします。ピペッティング時に細胞懸濁液をバブルアップしません。</li>
	<li>基本媒体 (RPMI 1640 または RT iMEM) の 8-10 mL を追加 0.5 x 無血清サプリメントと 10 μ M を含む Y-27632 あたりも、細胞懸濁液をミックスします。遠心チューブに細胞懸濁液を転送します。</li>
	<li>300 x gで RT 5 分でチューブを遠心します。</li>
	<li>上清を吸引し、2 ml の 0.5 mM EDTA (RT) の細胞を再懸濁します。細胞懸濁液をピペット優しく。</li>
	<li>300 x gで RT 5 分でチューブを遠心します。</li>
	<li>上清を吸引し、フードの下で 10 の6セルごとを固定・透過バッファー 100 μ l 細胞を再懸濁します。優しく、フードの下に細胞懸濁液をピペットします。常温 30 分の管を保ちます。</li>
	<li>400 x gで RT 5 分でチューブを遠心します。</li>
	<li>フードの下で上清を吸引し、10 の6セルごと 500 μ L FCM 遮断ソリューションと細胞を再懸濁します。細胞懸濁液をピペット優しく。常温 30 分の管を保ちます。</li>
	<li>50 μ L の細胞懸濁液をチューブ (約 1 x 10 の5セル) に転送します。400 x g常温で 5 分間削除でチューブに上清を遠心しを希釈した一次抗体 100 μ l 細胞を再懸濁します (材料の表を参照してください) FCM の解決を妨げる、4 °C の孵化させなさい > 16 h。</li>
	<li>400 x g常温で管を遠心分離機 5 分、上清を除去し、パーマ/洗浄バッファー x 1 の 180 μ L と細胞を再懸濁します。</li>
	<li>400 x g常温で 5 分間削除でチューブに上清を遠心しを希釈した二次抗体 100 μ l 細胞を再懸濁します (材料表参照) FCM ソリューションをブロックで。4 °C のまたは 60 分のための RT で細胞をインキュベート > 16 h 光からの保護。</li>
	<li>400 x g常温で管を遠心分離機 5 分、上清を除去し、パーマ/洗浄バッファー x 1 の 180 μ L と細胞を再懸濁します。</li>
	<li>上澄み 400 x gで 5 分間削除常温で管を遠心し、2% ロバ血清 DPBS 180 μ L と細胞を再懸濁します。</li>
	<li>細胞懸濁液をフィルターするには、分析までの光からセル ストレーナー (35 μ m ナイロン メッシュ) と 4 °C の保護と維持底部ポリスチレン チューブ ラウンド 5 mL に転送します。</li>
	<li>流れの cytometer27によって積極的に陽性細胞の割合を分析します。</li>
</ol>4. 染色
<ol><li>使用される媒体を吸引し、井戸の中にピペットで DPBS 2 mL を追加します。吸引と DPBS 添加 1 回繰り返します。 注:各吸引前に単層細胞から任意の死んだ細胞を削除するプレートを軽く振る。</li>
	<li>4% パラホルムアルデヒド (PFA) 2 mL を追加 (4 °C)、フードの下でピペットによってウェルあたり。4 °C 20 分間プレートを維持します。</li>
	<li>フードの下のピペット、PFA を削除します。フードの下のピペットで RT にも DPBS 2 mL を追加します。吸引と DPBS 添加 1 回繰り返します。</li>
	<li>ウェルあたりブロッキング溶液 2 mL を追加し、常温で 30 分間プレートを維持します。</li>
	<li>使用されるソリューションを吸引し、一次抗体の 1 つの mL を追加 (材料の表を参照してください) ウェルあたり解決を妨げるのです。4 °C のため、60 分間室温でインキュベート > 16 h。</li>
	<li>使用されるソリューションを吸引、DPBS 0.4% を含む 2 mL を加えるトリトン X-100 10 分繰り返す誤嚥、ソリューションと 1 つの時間の追加 RT でインキュベートし、。</li>
	<li>使用されるソリューションを吸引し、二次抗体の 1 つの mL を追加 (材料の表を参照してください) ウェルあたり解決を妨げるのです。RT で光からの保護と 60 分間インキュベートします。</li>
	<li>使用されるソリューションを吸引、DPBS 0.4% を含む 2 mL を加えるトリトン X-100 (RT) と RT で光からの保護で 5 分間インキュベートします。吸引、ソリューションとインキュベーションの追加を 2 回繰り返します。</li>
	<li>28蛍光顕微鏡下で分化効率を調べる顕微鏡写真を取る。</li>
</ol>

<ol><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li>
<li>Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC+technology-based+regenerative+therapy+for+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Investigation%22%5BJournal%5D)">iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes.</a> Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).</li>
<li>Millman, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stem+cell-derived+beta-cells+from+patients+with+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes.</a> Nature Communications. 7, 11463(2016).</li>
<li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Isogenic+Human+ESC+Platform+for+Functional+Evaluation+of+Genome-wide-Association-Study-Identified+Diabetes+Genes+and+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).</li>
<li>Hosokawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-producing+cells+derived+from+%27induced+pluripotent+stem+cells%27+of+patients+with+fulminant+type+1+diabetes%3A+Vulnerability+to+cytokine+insults+and+increased+expression+of+apoptosis-related+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Investigation%22%5BJournal%5D)">Insulin-producing cells derived from 'induced pluripotent stem cells' of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes.</a> Journal of Diabetes Investigation. , (2017).</li>
<li>Jennings, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+human+pancreas+from+foregut+to+endocrine+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment.</a> Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).</li>
<li>Jorgensen, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+illustrated+review+of+early+pancreas+development+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">An illustrated review of early pancreas development in the mouse.</a> Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).</li>
<li>Jensen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+factors+in+pancreatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory factors in pancreatic development.</a> Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).</li>
<li>Hald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+Ptf1a+antiserum+and+localization+of+Ptf1a+in+relation+to+Nkx6.1+and+Pdx1+during+the+earliest+stages+of+mouse+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).</li>
<li>Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+dynamics+of+pancreatic+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis.</a> Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).</li>
<li>Serup, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeodomain+protein+IPF-1%2FSTF-1+is+expressed+in+a+subset+of+islet+cells+and+promotes+rat+insulin+1+gene+expression+dependent+on+an+intact+E1+helix-loop-helix+factor+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site.</a> Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).</li>
<li>Riedel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+characterisation+of+cells+co-producing+insulin+and+glucagon+in+the+developing+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas.</a> Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).</li>
<li>Mae, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+robust+induction+of+nephrogenic+intermediate+mesoderm+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells.</a> Nature Communications. 4, 1367(2013).</li>
<li>Toyoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+aggregation+optimizes+the+differentiation+of+human+ESCs+and+iPSCs+into+pancreatic+bud-like+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells.</a> Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).</li>
<li>Toyoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-Associated+Kinases+and+Non-muscle+Myosin+IIs+Inhibit+the+Differentiation+of+Human+iPSCs+to+Pancreatic+Endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).</li>
<li>Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell+culture%3A+considerations+for+maintenance%2C+expansion%2C+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).</li>
<li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+human+embryonic+stem+cell+colony+and+aggregate+size+heterogeneity+influences+differentiation+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li>
<li>Nguyen, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+reveals+cellular+heterogeneity+and+cell+state+transitions+between+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations.</a> Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).</li>
<li>Narsinh, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).</li>
<li>Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edges+of+human+embryonic+stem+cell+colonies+display+distinct+mechanical+properties+and+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential.</a> Scientific Reports. 5, 14218(2015).</li>
<li>Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+heterogeneity+in+pluripotent+stem+cells%3A+a+stochastic+advantage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage.</a> Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).</li>
<li>Cahan, P., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+implications+of+pluripotent+stem+cell+variability+and+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity.</a> Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).</li>
<li>Chetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+tool+to+improve+pluripotent+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation.</a> Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).</li>
<li>Kimura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+AT7867+proliferates+PDX1-expressing+pancreatic+progenitor+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).</li>
<li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52010(2014).</li>
<li>Honvo-Houeto, E., Truchet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+Immunofluorescence+on+Frozen+Sections+of+Mouse+Mammary+Gland%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Kajiwara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-dependent+variations+in+hepatic+differentiation+from+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).</li>
<li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-derived+dopaminergic+neurons+function+in+a+primate+Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model.</a> Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).</li>
<li>Suemori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+establishment+of+human+embryonic+stem+cell+lines+and+long-term+maintenance+with+stable+karyotype+by+enzymatic+bulk+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communication%22%5BJournal%5D)">Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).</li>
<li>Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+cell+seeding+density+influences+pancreatic+endocrine+development+during+in+vitro+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 8 (12), e82076(2013).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+NKX6-1%2B+pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li>
<li>Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-promoter-factor+1+is+required+for+pancreas+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice.</a> Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).</li>
<li>Kelly, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+markers+for+the+isolation+of+pancreatic+cell+types+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).</li>
<li>Hohwieler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+acinar%2Fductal+organoids+generate+human+pancreas+upon+orthotopic+transplantation+and+allow+disease+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling.</a> Gut. 66 (3), 473-486 (2017).</li>
<li>Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endodermal+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+insulin-producing+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture.</a> Scientific Reports. 4, 4488(2014).</li>
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PDX1 の世代+のセルが複数の手順で構成されていますしたがって、適切な時期に細胞を治療するために重要です。手順の中で決定的な内胚葉の誘導効率主最終誘導効率に影響を与える、おそらく他汚染系統の細胞 (すなわち、中胚葉と外胚葉) 増殖または分泌することができるからの干渉によって要因特定の分化を混乱させます。場合 SOX17 の割合+ 80% 未満の細胞は日 4 (ステージ 1 b)、PDX1 への効率的な誘導に+細胞が危険にさらされる可能性があります。
HPSCs の未分化状態は植民地または最適化された細胞の集合体として維持されます。ただし、コロニーまたは集計から分化を開始するメソッド苦しむことがありますの不均一性の異なる細胞接着とコロニーの密度のためこのような細胞のさまざまな段階では、中心と周縁22のように細胞周期の25。その一方で、私たちのメソッドは、単一のセルまたはすべての単一細胞での細胞密度の細胞接着の比較的均質な状...

膵臓は外分泌と内分泌の細胞の主し、その機能不全またはオーバー ロードを引き起こすいくつかの疾患、膵炎、糖尿病、膵臓癌など。Pancreatopathy の病因を解明するには、発達過程と膵臓の細胞の機能を分析する必要は。また、細胞・組織の補充療法を確立する堅牢な品質と安定した供給が必要です。ひと多能性幹細胞 (hPSC)-派生膵臓細胞は、これらの目的の有望な細胞ソースと膵臓細胞へ分化プロトコルは集中的に調査1,2,3をされています。 4。膵 β 細胞の in vitro 生成における最近の進歩は、人間、大人の糖尿病モデル マウス2,3への注入時にこれらの細胞の治療効果 β 細胞の生成を模倣します。さらに、健康の誘導多能性幹細胞 (Ips) と 1 型糖尿病患者のドナーから生成された β 細胞の解析はストレス5のとき下を含む機能の相違を認めなかった。さらに、疾患表現型が部分的に患者由来の Ips または hPSCs 患者6,7と同じサイトで遺伝子変異を遺伝的に膵細胞の再現します。
膵臓の細胞を生成すると、hPSCs から、発達過程を繰り返す段階的分化を使用します。膵臓は地域 Y ボックス 17 (SOX17) を決定性を表現する初期胚の内胚葉層から派生した、フォーク ヘッド ボックス A2 (FOXA2)8。マウス研究に基づいて、内皮層は肝細胞核因子 1-β (Hnf1β) と肝細胞核因子 4 アルファ (Hnf4α) の式によってマークされている原始腸の管を形成します。原始腸の管を延長し、呼吸器、消化管や臓器に成長します。伸び後、臼歯前腸地域なる推定膵領域 1 (PDX1)8,9,10転写因子膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質の表現によって示されるように。背側と腹側部、PDX1+ 1 (NKX6.1)8,11膵臓転写因子 1 サブユニット α (PTF1A) および NK6 ホメオ ボックスの共発現によってマークされているフォーム膵芽腸チューブが厚きます。この式は、膵の器官の形態の開始をマークします。膵臓の芽のコンポーネントである膵臓内胚葉細胞上皮構造12分岐管ネットワークを形成し、最終的にインスリン分泌 β 細胞を含む、外分泌と内分泌の細胞に分化し、グルカゴン分泌 α-細胞。PDX1 の式は全体の膵開発全体を通して観察し、β、δ 細胞9,13,14にローカリゼーションを示します推定の膵領域で最初に検出されました。ただし、Pdx1+ Ptf1a または Nkx6.1 を表現していないセル領域を胃幽門部、十二指腸、胆管、マウス9、PDX1 開発の後期段階にいくつかの腸の細胞に区別する+細胞は、人間の初期の発達段階では膵前駆細胞と見なされます。
PDX1 に hPSCs を区別するために詳細なプロトコルを提案するここでは、+細胞膵臓系譜の生成のため。播種によるプロトコル開始分化には、単一細胞15,16,17が分離されます。一般的に、画一的な hPSCs、植民地または懸濁液、接着性細胞集塊として維持されます。その結果、ほとんどのプロトコルは、通過直後に分化を開始します。しかし、植民地または集計の状態でセルが空間と転写不均質18,19,20,21,22を妨げる可能性がありますになりやすい、決定的な内胚葉の分化第一歩は PDX1 に非効率的な分化に続く+細胞。この議定書の分化効率を安定させるために改善し扱いやすさを提供するかもしれない以前発見されたいくつかの hPSC ライン内胚葉系統および PDX1 に効率的に区別するために+細胞23,24,25。

<table><tbody><tr><td>3-ケト-N-アミノエチル-N&prime;-アミノカプロイルジヒドロシンナモイル シクロパミン</td><td>トロントリサーチケミカル</td>ズ <td>K171000</td><td>CYC</td></tr><tr><td>4-[(E)-2-(5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル-2-ナフタレニル)-1-プロペニル]-安息香酸</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-203303</td><td>TTNPB</td></tr><tr><td>50 mL 円錐形滅菌ポリプロピレン遠心分離管</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック 339652</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗CDX2抗体 [EPR2764Y]</td><td>アブカム</td><td>Ab76541</td><td>抗CDX2, &times; 1/1000</td></tr>希釈 <tr><td>B-27 Supplement (50 回;)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17504-044</td><td>無血清サプリメント</td></tr><tr><td>BD FACSAria II セルソーター</td><td>BD バイオサイエンス</td><td></td><td>フローサイトメトリー用</td></tr><tr><td>バイオメディカルフリーザー</td><td>SANYO</td><td>MDF-U538</td><td>-30 °C;</td></tr><tr><td>TC10/TC20用セルカウンティングスライド セルカウンター、デュアル</td><td>チャンバーBIO-RAD</td><td>1450011</td><td>計数スライドグラス</td></tr><tr><td>細胞培養マルチウェルプレート、6ウェル、PS、クリア</td><td>グライナーバイオワン</td><td>657165</td><td>分化培養用/6ウェルプレート</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>タカラト</td><td>ミーAX-310</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>タカラト</td><td>ミーMX-305</td><td>RT-qPCR用</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon Medchem</td><td>Axon 1386</td><td></td></tr><tr><td>クリーンベンチ</td><td>昭和化学&nbsp;</td><td>S-1601PRV</td><td>クリーンベンチ</td></tr><tr><td>Corning CellBIND 6ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3335</td><td>hPSCs/6ウェルプレートのフィーダーフリー培養用</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Basement membrane matrix</td></tr><tr><td>Corning Synthemax II-SC Substrate</td><td>Corning</td><td>3535</td><td>hPSCs/hPSC用合成表面材料のフィーダーフリー培養用</td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ</td><td>ライカ CM1510 S</td><td>凝集体の免疫染色用。</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Kit</td><td>Becton Dickinson</td><td>554714</td><td>Perm/Wash bufferは&nbsp;透過化/洗浄バッファー。Cytofix/Cytopermバッファーは、固定および透過化バッファーです。</td></tr><tr><td>Dako pen</td><td>Dako</td><td>S2002</td> 凝集体 <td></td></tr><tr><td>dNTP mix (10 mM)</td> の免疫染色用<td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18427-088</td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11055</td><td>Secondary Antibody, &times; 1/500 dilution</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, AlexaFluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10036</td><td>二次抗体 &times; 1/500 希釈</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) 高交差吸着二次抗体 Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10040</td><td>二次抗体 &times; 1/500 希釈</td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Merck Millipore</td><td>S30</td><td>Donkey serum</td></tr><tr><td>D-PBS(-) CaまたはMg</td><td>Nacalai tesque</td> <td>なし14249-95</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>エッセンシャル 8 ミディアム</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>A1517001</td><td>hPSCs/hPSC メンテナンス培地のフィーダーフリー培養用</td></tr><tr><td>ファルコン 5 mL 丸底ポリスチレン試験管、セルストレーナー付き スナップキャップ</td><td>コーニング</td><td>352235</td><td>5 mL 丸底ポリスチレンチューブ、セルストレーナー付き</td></tr><tr><td>フィルターチップ、1,000 & マイクロ;L</td><td>Watoson</td><td>124-1000S</td><td>ピペットと一緒に使用</td></tr><tr><td>フィルターチップ、20 & マイクロ;L</td><td>Watoson</td><td>124-P20S</td><td>ピペットと一緒に使用</td></tr><tr><td>フィルターチップ、200 & マイクロ;L</td><td>Watoson</td><td>124-P200S</td><td>ピペットと一緒に使用</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Keyence</td><td>BZ-X700</td><td>免疫染色用</td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2インキュベータ</td>ー <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>370A</td><td>インキュベータ</td></tr><tr><td>ー HNF-1&beta;抗体 (C-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7411</td><td>Anti-HNF1&beta;, &times; 1/200 dilution</td></tr><tr><td>HNF-4&alpha;抗体 (H-171)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8987</td><td>Anti-HNF4&alpha;, &times; 1/200 dilution</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>For nucleus staining, &times; 1/200 dilution</td></tr><tr><td>Human Pancreas Total RNA</td><td>Ambion</td><td>AM7954</td><td>For RT-qPCR</td></tr><tr><td>Human PDX-1/IPF1 Antibody</td><td>R&D Systems</td><td>AF2419</td><td>Anti-PDX1, goat IgG, &times; 1/200 dilution</td></tr><tr><td>Human SOX17 抗体</td><td>R&Dシステムズ</td><td>AF1924</td><td>アンチSOX17 &times; 1/200</td></tr>希釈 <tr><td>改良型MEM 亜鉛オプション 中</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10373-017</td><td>iMEM</td></tr><tr><td>インキュベーションチャンバー</td><td>コスモバイオ</td><td>10DO</td><td>凝集体の免疫染色用</td></tr><tr><td>ラテックス検査用手袋</td><td>足立</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MASコーティングスライドガラス</td><td>松波ガラス</td><td>83-1881</td><td>凝集体の免疫染色</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 96ウェル反応プレート</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td><td>4346907</td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>顕微鏡</td>用 <td>オリンパス</td><td>CKX41N-31PHP</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>マイクロチューブ</td><td>Watoson</td><td>131-515CS</td><td></td></tr><tr><td>モノクローナル抗抗体--フェトプロテイン</td><td>SIGMA</td><td>A8452</td><td>アンチAFP, &times; 1/200希釈</td></tr><tr><td>Nanodrop 8000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>For RT-qPCR</td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>FASMAC</td><td>カスタムメイドオリゴ&nbsp;</td><td>配列のRT-qPCRの場合、"TTTTTTTTTTTTTTTTTT"です。</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、粉末</td><td>Nacalai tesque</td><td>26126-54</td><td>PFA、固定剤、DPBS</td></tr><tr><td>医薬品冷蔵庫</td><td>で希釈 SANYO</td><td>MPR-514</td><td>For 4 &deg;C</td></tr><tr><td>はPIPETMAN P&nbsp;</td><td>ギルソン</td><td></td><td>ピペット</td></tr><tr><td>組換えヒトKGF / FGF-7</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ251-KGKGF</td><td></td></tr><tr><td>組換え人間Noggin</td><td>PeproTech</td><td>120-10C</td><td>NOGGIN</td></tr><tr><td>組換えヒト/マウス/ラットアクチビンA</td><td>R&D Systems</td><td>338-AC</td><td>アクチビン A</td></tr><tr><td>ReverTra Ace (100 U/&mu;L)</td><td>東洋紡</td><td>TRT-101</td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>RNaseフリーDNaseセット (50)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>RNeasyミニキット</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td>RT-qPCR RPMI</td></tr><tr><td>1640 L-GLN</td><td>Nacalai tesque</td><td>30264-85</td><td>RPMI 1640</td></tr><tr><td>シーリングフィルム リアルタイム用</td><td>タカラ</td><td>NJ500</td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>血清ピペット用 10 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4488</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>セロロジカルピペット 25 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4489</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>セロロジカルピペット 5 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4487</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>3579S</td><td>Anti-SOX2, &times; 1/200 希釈</td></tr><tr><td>StepOnePlus</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher</td><td>RT-qPCRのための</td>科学<td></td></tr>的な<tr><td>スクロース</td><td>Nacalaiのtesque</td><td>30406-25</td><td>凝集体の免疫染色のためにTB</td></tr><tr><td>の緑 プレミックスEx Taq II&nbsp;</td><td>タカラ</td><td>RR820B</td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>TC20自動セルカウンター</td>用 <td>BIO-RAD</td><td>1450101J1</td><td>自動セルカウンター</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT化合物 4583&nbsp;</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4583</td><td>骨材の免疫染色用</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4566</td><td>骨材の免疫染色用</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>BIO-RAD</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>超低温冷凍庫</td><td>SANYO</td><td>MDF-U33V</td><td>-80°C;C UltraPure</td></tr><tr><td>0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td><td>DPBSで希釈して0.5 mM EDTA</td></tr><tr><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>For RT-qPCR</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>和光</td><td>251-00514</td><td></td></tr></tbody></table>を調製

効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hpscs から

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

ひと多能性幹細胞 (hPSC)-派生膵臓細胞は、再生医療と人間の発達過程を研究するためのプラットフォームのための有望な細胞ソース。段階的発達過程を繰り返す分化、膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+を含む膵細胞を生成する主要な方法の 1 つを監督 (PDX1+) 膵前駆細胞。従来のプロトコルは、通過後すぐの小さいコロニーと分化を開始します。しかし、植民地または集計の状態で細胞が不均一性は、PDX1 への分化を妨げる可能性がありますになりやすい+細胞。PDX1 に hPSCs を区別するために詳細なプロトコルを提案するここでは、+のセル。プロトコルは 4 つのステップで構成されています、シード解離単一細胞で分化を開始します。SOX17 の誘導+ PDX1 に決定的な内胚葉細胞 2 つの原始腸チューブ マーカー、HNF1β、HNF4α、および最終的な分化の式が続いた+細胞。議定書簡単処理を提供しますと改善や内胚葉系統または PDX1 に効率的に区別するために以前に発見されたいくつかの hPSC ラインの分化効率を安定させる+細胞。

伝搬 hiPSCs (585A129,30) 凝縮と分化に適した均質な膜 (図 1 b)。画一的な hiPSCs (ステージ 0) 解離、低細胞密度 (1 〜 1.5 × 105セル/cm2) にある単一セルとして再シードします。1 h 内のセルは、プレートに取り付け、突起を表示を開始します。1 日目、セルを増殖して表面積の 80-90% をカバーする分散も。ステージ 1 b の中にメディアが死んだ細胞により曇り表示します。死んだ細胞が邪魔生存と分化細胞の下に横になっているので、非常に効率的な分化の死んだ細胞の除去が欠かせません。日 3-4 細胞はコブルス トーン外観と称される均質膜シートを形成します。この時点で、ほとんどの細胞は領域 Y ボックス 2 (SOX2)、未分化細胞のマーカーを特定するセックスを表現するを停止し、代わりに決定的な内胚葉マーカー SOX17、(図 2 ...

ここでは、膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+にひと多能性幹細胞 (hPSCs) を区別するために詳細なプロトコルを提案 (PDX1+) の非植民地型単層成長に基づいて膵臓系譜の生成のためのセル単一細胞を分離しました。このメソッドは、同種 hPSC 由来細胞、遺伝子操作、スクリーニングに適しています。

効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hPSCs から

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

この技術の主な利点は、刺激の前に、細胞が均等に分散され、次いでタンデム細胞接着で均等に刺激されるということです。この手順のデモンストレーションは、当研究室の大学院生である木村吾美です。この手順を開始するには、RPMI 1640の6ミリリットルを氷の上で摂氏4度に冷却したチューブに移します。冷却された1ミリリットルのピペットチップを使用して、基質膜マトリックスの2ミリグラムを追加します。穏やかなピペットによってよく混ぜて、ミリリットル当たり0.33ミリグラムの濃度の基膜マトリックスにします。次に、ピペットを使用して、希釈した基膜マトリックスの2ミリリットルを6ウェル細胞培養プレートの各ウェルに移す。プレートを摂氏37度で60~90分間インキュベートします。この後、プレートを室温で最大3時間、使用できる状態になるまで保管してください。まず、使用培地を吸引し、ピペットを使用して各ウェルに0.5ミリモルEDTAの2ミリリットルを加え、6ウェルプレートで培養したhPCSを洗浄する。次に、井戸からEDTAを吸引し、各ウェルに新鮮な0.5ミリモルEDTAの2ミリリットルを加えます。プレートを摂氏37度で5分間インキュベートします。この後、各ウェルからEDTAを吸引する。室温で1ミリリットルのhPSC維持培地を加え、各ウェルに10マイクロモルY27632を加えます。ピペットは、プレート上に取り付けられた細胞を吹き飛ばし、塊状の細胞を単一の細胞に解離するために、優しく、しかし迅速に。ウェルあたり10マイクロモルY27632を補充し、ピペットによって混合する4ミリリットルのhPSC維持培地を含む50ミリリットル遠心分離チューブに細胞懸濁液を移す。次に、15マイクロリットルのセル懸濁液を、チューブに15マイクロリットルのトリパンブルーを混ぜます。10マイクロリットルのピペットを使用して、希釈したセル懸濁液の10マイクロリットルを重複するセルカウントスライドに移します。自動セルカウンターを使用して、セル番号をカウントし、セルサスペンション内のセル密度を計算します。使用する各ウェルの密度で50ミリリットルチューブに細胞懸濁液を割り当てます。チューブをGの200倍、室温で5分間遠心する。この後、ピペットを使用して上清を吸引し、ウェルあたり1ミリリットルのステージ1A培地を使用して細胞を再中断します。細胞懸濁液を軽くピペットし、さらに1ミリリットルのステージ1A培地をウェルごとに加えます。1000マイクロリットルピペットを用いて、以前に調製した細胞培養板のウェルから希釈された基質膜マトリックスを吸引する。すぐにチューブ内の懸濁液を穏やかにピペットし、6ウェルプレートの各ウェルに2ミリリットルを移します。プレートをアルミニウム箔で覆い、光から保護し、室温のクリーンベンチに10〜15分間置き

efficient-generation-pancreasduodenum-homeobox-protein-1-posterior

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

ここでは、マウス胚性膵臓の分離、培養および操作のための方法を説明します。これは、優れたを表し...

のためのシステム<em&gt; ex vivoで</em胚膵臓&gt;培養

このプロトコルで説明した3次元培養法は、分枝状の臓器へのそれらの大幅な拡大、分化および形態形成などの分散したマウス胎児の膵臓前駆細胞から膵臓の発達を再現。この方法は、画像化、ニッチの機能的干渉や操作に適している。...

分散マウス胚性前駆細胞からin vitro膵臓器官形成

ここでは、in vitroで NKX6-1 +膵臓前駆細胞にヒト胚性幹細胞を区別するために4段階のプロトコルを記述します。このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞株の多様に適用することができます。...

NKX6-1への多能性幹細胞の効率的分化<sup&gt; +</sup&gt;膵臓前駆細胞

iCRISPRプラットフォームを使用HPSC変異株を作製し、グルコース応答性β様細胞にhPSCsを区別するためのプロトコルが記載されています。 HPSC指向分化にゲノム編集技術を組み合わせることにより、人間開発と疾患の進行中の系譜決定因子の役割の体系的な分析のための強力なプラットフォームを提供します。...

ヒト膵臓の開発にリネージュの決定要因を問い合わせるためのゲノム編集とhPSCsの指向性分化

分離したフローティング e10.5 膵前駆細胞と関連付けられて間充織から 3 D マウス pancreatoids...

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

このプロトコルは、ヒト歯髄幹細胞(hDpSC)を...

インビトロ 膵臓系統に向けたヒト歯髄幹細胞の誘導

本プロトコルは、平面単層におけるヒト多能性幹細胞(hPSC)に由来する膵臓前駆細胞におけるPDX1およびNKX6.1転写因子の共発現を増加させるための増強された方法を記載する。これは、新鮮なマトリックスを補充し、細胞密度を操作し、内胚葉細胞を解離することによって達成される。...

2D培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化

幹細胞の膵島細胞への分化は、従来の糖尿病治療や疾患モデリングに代わるソリューションを提供します。市販の分化キットと以前に検証された方法を組み合わせて、インスリン分泌性幹細胞由来の膵島を皿で産生するのに役立つ詳細な幹細胞培養プロトコルについて説明します。...

ヒト多能性幹細胞のインスリン産生膵島クラスターへの分化

この記事はセルのようなβ細胞の指示された微分そして機能分析のためのプロトコルを示す。インスリン産生膵細胞を作製する前のヒト多能性幹細胞の最適な培養条件と継代について記述します。6段階の分化は、決定的な内胚葉の形成から、グルコースに反応してインスリンを分泌する機能的なβ細胞様細胞へと進行します。...

ヒト多能性幹細胞から機能的な膵臓インシュリン分泌細胞を生成するための最適化されたプロトコル

幹細胞由来の網膜色素上皮(RPE)細胞は、網膜変性のための細胞ベースの治療、疾患モデリング、薬物研究など、複数の用途に使用することができます。ここでは、幹細胞からRPEを再現性よく導出するための簡単なプロトコールを紹介します。...

幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出

学ぶ、hPSCからPDX1+膵前駆細胞を効率的に誘導する接着培養法。均一な単層培養により遺伝子操作とスクリーニングを容易にし、膵臓発生の研究と再生医療への応用を促進します。

効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1⁺後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hPSCs から

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