Name: 効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hPSCs から (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 学ぶ、hPSCからPDX1+膵前駆細胞を効率的に誘導する接着培養法。均一な単層培養により遺伝子操作とスクリーニングを容易にし、膵臓発生の研究と再生医療への応用を促進します。

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この仕事はから資金援助によって日本社会のための科学振興) Scientific Research (C) (日本学術振興会科研費補助金 Number15K09385 と 18 K 08510) を通じてに科研費と技術移転、日本学術振興会研究員 (日本学術振興会科研費助成番号の部分で支えられました17J07622) A.K.、および医学研究開発 (アメッド) その研究を通じて機構に k. o. に「iPS 細胞研究、再生医療実現に向けた研究センター ネットワークの中核拠点」を付与著者が原稿を読んで博士ピーター Karagiannis をありがちましょう。

HPSCs を用いた実験は、医学科と京都大学大学院医学研究倫理委員会で承認されました。
1 材料の準備
注:無菌環境で細胞培養のため、すべてのメディアと試薬を準備します。ウォーム アップを使用する前に室温 (RT) 基本培地。媒体の差別化は試薬のルート詳細を 6 時間以内に使用される材料のテーブルに表示されます。
<ol><li>
分化 (図 1 a)
	<ol>
<li>ステージ 1 a 媒体: 転送ピペットを使用してチューブに RPMI 1640 媒体。無血清サプリメント、アクチビン A、CHIR99021、および Y-27632 を 1 倍、100 ng/mL、3 μ M と 10 μ M の濃度にそれぞれ追加します。</li>
		<li>ステージ 1 b 中: 転送ピペットを使用してチューブに RPMI 1640 媒体。無血清サプリメント、アクチビン A と 1 x、100 ng/mL、1 μ M の濃度 CHIR99021 をそれぞれ追加します。 注: CHIR99021 の濃度は、ステージ 1 a の中でより低いべきと添加が不要で、細胞数は大きくなります。</li>
		<li>ステージ 2 メディア: ピペットを使用してチューブに転送改善 MEM (iMEM) 媒体。無血清サプリメントとケラチノ サイト成長因子 (KGF) を 0.5 倍と 50 ng/mL の濃度にそれぞれ追加します。</li>
		<li>ステージ 3 媒体: ピペットを使用してチューブに iMEM 媒体。無血清サプリメント、KGF、酒を飲むこと、3-ケト-N-アミノエチル-N'を追加 - aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC)、ピペットによる 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic 酸 (TTNPB)濃度 0.5 x 50 ng/mL、100 ng/mL、0.5 μ M と 10 nM、それぞれ。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
フローサイトメトリー (FCM)
	<ol>
<li>透過/洗浄バッファー x 1: 管にピペットで水を転送します。1 x の濃度にピペットで透過/洗浄バッファーを追加します。</li>
		<li>FCM ソリューションをブロック: 管にピペットで透過/洗浄バッファー x 1 を転送します。ロバ血清ピペット濃度 2% (巻/巻) に追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
免疫染色
	<ol>
<li>ソリューションをブロック: 転送ダルベッコ Phosphate-Buffered 生理食塩水 (DPBS) ピペットによって管に。ロバ血清およびトリトン X ピペットで 5% (巻/巻)、0.4% (巻/巻) の濃度をそれぞれ追加します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hPSC 後部前腸細胞/膵前駆細胞への分化 (PDX1 細胞の+ )
注:生殖不能の技術を使用してすべての手順を実施します。hPSCs は、製造元の指示17,26によると hPSC 培地と hPSCs の合成表面素材を施した 6 ウェル プレートで保持されます。細胞に達する 50-80% の confluency (ステージ 0) は差別化のためそれらを使用します。
<ol><li>
基底膜マトリックス コーティング プレートを準備します。
	<ol>
<li>転送管に RPMI 1640 (4 °C) の 6 mL は 4 °C 氷の上に冷却されます。基底膜マトリックス (4 °C) 冷却 1 mL ピペット チップで 2 mg を追加し、0.33 mg/mL 基底膜マトリックスに穏やかなピペッティングでよく混ぜます。</li>
		<li>ピペットで 6 も細胞培養プレートの各ウェルに希薄化後の基底膜マトリックスの 2 mL を転送します。37 °C の定温器で 60-90 分でプレートを配置します。その後、(3 h) 内で使用するまで RT でプレートを保ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
シード、hPSCs、(ステージ 1 a) 決定的な内胚葉への分化を開始します。
	<ol>
<li>使用される媒体を吸引し、6 ウェル プレートで培養した hPSCs を洗浄するピペットによってウェルあたり 0.5 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) (RT) 2 mL を追加します。</li>
		<li>0.5 mM EDTA を吸引し、ピペットでよく当り 0.5 mM EDTA の 2 mL を追加します。37 °C で 5 分で版を孵化させなさい。</li>
		<li>0.5 mM EDTA を吸引し、10 μ M を添加した常温 hPSC 培地 1 mL を追加あたりピペットによってよく Y-27632。ピペットの優しく、迅速を吹き飛ばすセルおよび単一セル周辺固定支持細胞を分離するに皿の上を添付します。ピペッティング時に細胞懸濁液をバブルアップしません。</li>
		<li>HPSC 常温 10 μ M を添加した培地 4 mL を含む 50 mL 遠心チューブに細胞懸濁液を転送 Y-27632。細胞懸濁液をピペット優しく。</li>
		<li>トリパン ブルー染色除外手順を使用して細胞懸濁液の細胞数をカウントします。<ol>
<li>細胞懸濁液の管内トリパン ブルーの 15 μ L ミックス 15 μ L。</li>
			<li>複製内のスライドをカウントするセルに 10 μ L ピペットでトリパン ブルーで希釈細胞懸濁液の 10 μ L を転送します。</li>
			<li>セルの自動カウンター番号セルをカウントし、細胞懸濁液の細胞密度を計算します。生存率は、通常 > 98%。</li>
		</ol>
</li>
		<li>6 ウェル プレート (1 〜 1.5 × 105セル/cm2) の井戸あたり 10 の6セル × 1 1.5 で 50 mL の遠心管の細胞懸濁液の約数。</li>
		<li>200 x gで RT 5 分で 50 mL のチューブを遠心します。</li>
		<li>ピペットを使用して上清を吸引し、ウェルあたり 1 ml のステージ 1 a 媒体 (RT) の細胞を再懸濁します。優しく細胞懸濁液をピペット、ステージ 1 a 媒体 (ウェルあたりの合計、2 mL) の別の 1 mL を追加します。</li>
		<li>2.1.2 の手順で 1,000 μ L ピペットにより作製した細胞培養皿の井戸で希薄化後の基底膜マトリックスを吸い出しなさい。すぐに次のステップに進みます。</li>
		<li>もう一度ステップ 2.2.8 に細胞懸濁液をピペット優しく。混合直後後 6 ウェル プレートの各ウェルに、細胞懸濁液 (2 mL) を転送します。カバー プレートを光から保護するためにアルミ箔をプレート。RT で 10-15 分のためのクリーン ベンチでプレートを配置します。 注:播種後プレートを移動しないでください。</li>
		<li>37 °C、5% CO2インキュベーター (加湿雰囲気)、24 h の文化にプレートをそっと置きます。 注:播種後プレートを振るか。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
決定的な内胚葉 (ステージ 1 b) への分化を誘導します。
	<ol>
<li>使用される媒体を吸引し、ピペットによって井戸に DPBS 2 mL を追加します。吸引と DPBS 添加 1 回繰り返します。 注:単層から任意の死んだ細胞を削除するには、各吸引前にプレートを軽く振る。</li>
		<li>使用 DPBS をピペットで吸引し、ステージ 1 b 中 (37 °C) ウェルあたり 4 mL を追加します。48 h の 37 °C の定温器 (5% CO2の加湿雰囲気) 文化にプレートをそっと置きます。</li>
		<li>使用される媒体を吸引し、井戸の中にピペットで DPBS 2 mL を追加します。吸引と DPBS 添加 1 回繰り返します。 注:各吸引前に穏やかな揺れで単層から死んだ細胞を削除します。</li>
		<li>使用 DPBS をピペットで吸引し、ステージ 1 b 中 (37 °C) ウェルあたり 4 mL を追加します。インキュベーター (37 °C、5% CO2の加湿雰囲気) と 24 h の文化にプレートをそっと置きます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
原始腸チューブ (ステージ 2) への分化を誘導します。
	<ol>
<li>使用される媒体を吸引し、井戸の中にピペットで DPBS 2 mL を追加します。 注: 各吸引前に穏やかな揺れで単層から死んだ細胞を削除します。</li>
		<li>使用 DPBS をピペットで吸引し、ステージ 2 メディア (37 °C) ウェルあたりの 4 つの mL を追加します。4 日間のインキュベーター (37 °C、5% CO2の加湿雰囲気) と文化にプレートを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PDX1 への分化を誘導する+細胞 (ステージ 3)。
	<ol>
<li>使用される媒体を吸引し、井戸の中にピペットで DPBS 2 mL を追加します。吸引と DPBS 添加 1 回繰り返します。</li>
		<li>使用の DPBS をピペットで吸引し、ステージ 3 媒体 (37 °C) ウェルあたりの 4 mL を追加します。3 日間のインキュベーター (37 °C、5% CO2の加湿雰囲気) と文化にプレートを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
膵内分泌細胞への分化を誘導します。
	<ol>
<li>前述のプロトコル3,16,26NKX6.1+細胞誘導 (8 日間のステージ 4) 内分泌細胞誘導 (ステージ 5、12 日間) 続くを実行します。特徴および免疫染色と定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT PCR) 解析による内分泌細胞の分化を検証します。 注:豊田ら16木村ら26実験手順の詳細についてを参照してください。QRT pcr 用プライマー シーケンスの表 1を参照してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3 フローサイトメトリー (FCM)
<ol><li>使用される媒体を吸引し、井戸の中にピペットで 0.5 ミリメートルの EDTA の 2 mL を追加します。吸引と 0.5 mM EDTA 添加 1 回繰り返します。 注:優しく単層細胞ごと吸引する前にから任意の死んだ細胞を削除するプレートを振る。</li>
	<li>(約 3-6 × 106ウェルあたりの細胞) の細胞を分離、0.25% の 2 mL を加えてトリプシン ウェルあたり 0.5 mM EDTA を含みます。37 °C で 5-10 分で版を孵化させなさい。</li>
	<li>単一セル周辺固定支持細胞を分離、すばやく、やさしくピペットします。ピペッティング時に細胞懸濁液をバブルアップしません。</li>
	<li>基本媒体 (RPMI 1640 または RT iMEM) の 8-10 mL を追加 0.5 x 無血清サプリメントと 10 μ M を含む Y-27632 あたりも、細胞懸濁液をミックスします。遠心チューブに細胞懸濁液を転送します。</li>
	<li>300 x gで RT 5 分でチューブを遠心します。</li>
	<li>上清を吸引し、2 ml の 0.5 mM EDTA (RT) の細胞を再懸濁します。細胞懸濁液をピペット優しく。</li>
	<li>300 x gで RT 5 分でチューブを遠心します。</li>
	<li>上清を吸引し、フードの下で 10 の6セルごとを固定・透過バッファー 100 μ l 細胞を再懸濁します。優しく、フードの下に細胞懸濁液をピペットします。常温 30 分の管を保ちます。</li>
	<li>400 x gで RT 5 分でチューブを遠心します。</li>
	<li>フードの下で上清を吸引し、10 の6セルごと 500 μ L FCM 遮断ソリューションと細胞を再懸濁します。細胞懸濁液をピペット優しく。常温 30 分の管を保ちます。</li>
	<li>50 μ L の細胞懸濁液をチューブ (約 1 x 10 の5セル) に転送します。400 x g常温で 5 分間削除でチューブに上清を遠心しを希釈した一次抗体 100 μ l 細胞を再懸濁します (材料の表を参照してください) FCM の解決を妨げる、4 °C の孵化させなさい > 16 h。</li>
	<li>400 x g常温で管を遠心分離機 5 分、上清を除去し、パーマ/洗浄バッファー x 1 の 180 μ L と細胞を再懸濁します。</li>
	<li>400 x g常温で 5 分間削除でチューブに上清を遠心しを希釈した二次抗体 100 μ l 細胞を再懸濁します (材料表参照) FCM ソリューションをブロックで。4 °C のまたは 60 分のための RT で細胞をインキュベート > 16 h 光からの保護。</li>
	<li>400 x g常温で管を遠心分離機 5 分、上清を除去し、パーマ/洗浄バッファー x 1 の 180 μ L と細胞を再懸濁します。</li>
	<li>上澄み 400 x gで 5 分間削除常温で管を遠心し、2% ロバ血清 DPBS 180 μ L と細胞を再懸濁します。</li>
	<li>細胞懸濁液をフィルターするには、分析までの光からセル ストレーナー (35 μ m ナイロン メッシュ) と 4 °C の保護と維持底部ポリスチレン チューブ ラウンド 5 mL に転送します。</li>
	<li>流れの cytometer27によって積極的に陽性細胞の割合を分析します。</li>
</ol>4. 染色
<ol><li>使用される媒体を吸引し、井戸の中にピペットで DPBS 2 mL を追加します。吸引と DPBS 添加 1 回繰り返します。 注:各吸引前に単層細胞から任意の死んだ細胞を削除するプレートを軽く振る。</li>
	<li>4% パラホルムアルデヒド (PFA) 2 mL を追加 (4 °C)、フードの下でピペットによってウェルあたり。4 °C 20 分間プレートを維持します。</li>
	<li>フードの下のピペット、PFA を削除します。フードの下のピペットで RT にも DPBS 2 mL を追加します。吸引と DPBS 添加 1 回繰り返します。</li>
	<li>ウェルあたりブロッキング溶液 2 mL を追加し、常温で 30 分間プレートを維持します。</li>
	<li>使用されるソリューションを吸引し、一次抗体の 1 つの mL を追加 (材料の表を参照してください) ウェルあたり解決を妨げるのです。4 °C のため、60 分間室温でインキュベート > 16 h。</li>
	<li>使用されるソリューションを吸引、DPBS 0.4% を含む 2 mL を加えるトリトン X-100 10 分繰り返す誤嚥、ソリューションと 1 つの時間の追加 RT でインキュベートし、。</li>
	<li>使用されるソリューションを吸引し、二次抗体の 1 つの mL を追加 (材料の表を参照してください) ウェルあたり解決を妨げるのです。RT で光からの保護と 60 分間インキュベートします。</li>
	<li>使用されるソリューションを吸引、DPBS 0.4% を含む 2 mL を加えるトリトン X-100 (RT) と RT で光からの保護で 5 分間インキュベートします。吸引、ソリューションとインキュベーションの追加を 2 回繰り返します。</li>
	<li>28蛍光顕微鏡下で分化効率を調べる顕微鏡写真を取る。</li>
</ol>

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PDX1 の世代+のセルが複数の手順で構成されていますしたがって、適切な時期に細胞を治療するために重要です。手順の中で決定的な内胚葉の誘導効率主最終誘導効率に影響を与える、おそらく他汚染系統の細胞 (すなわち、中胚葉と外胚葉) 増殖または分泌することができるからの干渉によって要因特定の分化を混乱させます。場合 SOX17 の割合+ 80% 未満の細胞は日 4 (ステージ 1 b)、PDX1 への効率的な誘導に+細胞が危険にさらされる可能性があります。
HPSCs の未分化状態は植民地または最適化された細胞の集合体として維持されます。ただし、コロニーまたは集計から分化を開始するメソッド苦しむことがありますの不均一性の異なる細胞接着とコロニーの密度のためこのような細胞のさまざまな段階では、中心と周縁22のように細胞周期の25。その一方で、私たちのメソッドは、単一のセルまたはすべての単一細胞での細胞密度の細胞接着の比較的均質な状...

膵臓は外分泌と内分泌の細胞の主し、その機能不全またはオーバー ロードを引き起こすいくつかの疾患、膵炎、糖尿病、膵臓癌など。Pancreatopathy の病因を解明するには、発達過程と膵臓の細胞の機能を分析する必要は。また、細胞・組織の補充療法を確立する堅牢な品質と安定した供給が必要です。ひと多能性幹細胞 (hPSC)-派生膵臓細胞は、これらの目的の有望な細胞ソースと膵臓細胞へ分化プロトコルは集中的に調査1,2,3をされています。 4。膵 β 細胞の in vitro 生成における最近の進歩は、人間、大人の糖尿病モデル マウス2,3への注入時にこれらの細胞の治療効果 β 細胞の生成を模倣します。さらに、健康の誘導多能性幹細胞 (Ips) と 1 型糖尿病患者のドナーから生成された β 細胞の解析はストレス5のとき下を含む機能の相違を認めなかった。さらに、疾患表現型が部分的に患者由来の Ips または hPSCs 患者6,7と同じサイトで遺伝子変異を遺伝的に膵細胞の再現します。
膵臓の細胞を生成すると、hPSCs から、発達過程を繰り返す段階的分化を使用します。膵臓は地域 Y ボックス 17 (SOX17) を決定性を表現する初期胚の内胚葉層から派生した、フォーク ヘッド ボックス A2 (FOXA2)8。マウス研究に基づいて、内皮層は肝細胞核因子 1-β (Hnf1β) と肝細胞核因子 4 アルファ (Hnf4α) の式によってマークされている原始腸の管を形成します。原始腸の管を延長し、呼吸器、消化管や臓器に成長します。伸び後、臼歯前腸地域なる推定膵領域 1 (PDX1)8,9,10転写因子膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質の表現によって示されるように。背側と腹側部、PDX1+ 1 (NKX6.1)8,11膵臓転写因子 1 サブユニット α (PTF1A) および NK6 ホメオ ボックスの共発現によってマークされているフォーム膵芽腸チューブが厚きます。この式は、膵の器官の形態の開始をマークします。膵臓の芽のコンポーネントである膵臓内胚葉細胞上皮構造12分岐管ネットワークを形成し、最終的にインスリン分泌 β 細胞を含む、外分泌と内分泌の細胞に分化し、グルカゴン分泌 α-細胞。PDX1 の式は全体の膵開発全体を通して観察し、β、δ 細胞9,13,14にローカリゼーションを示します推定の膵領域で最初に検出されました。ただし、Pdx1+ Ptf1a または Nkx6.1 を表現していないセル領域を胃幽門部、十二指腸、胆管、マウス9、PDX1 開発の後期段階にいくつかの腸の細胞に区別する+細胞は、人間の初期の発達段階では膵前駆細胞と見なされます。
PDX1 に hPSCs を区別するために詳細なプロトコルを提案するここでは、+細胞膵臓系譜の生成のため。播種によるプロトコル開始分化には、単一細胞15,16,17が分離されます。一般的に、画一的な hPSCs、植民地または懸濁液、接着性細胞集塊として維持されます。その結果、ほとんどのプロトコルは、通過直後に分化を開始します。しかし、植民地または集計の状態でセルが空間と転写不均質18,19,20,21,22を妨げる可能性がありますになりやすい、決定的な内胚葉の分化第一歩は PDX1 に非効率的な分化に続く+細胞。この議定書の分化効率を安定させるために改善し扱いやすさを提供するかもしれない以前発見されたいくつかの hPSC ライン内胚葉系統および PDX1 に効率的に区別するために+細胞23,24,25。

<table><tbody><tr><td>3-ケト-N-アミノエチル-N&prime;-アミノカプロイルジヒドロシンナモイル シクロパミン</td><td>トロントリサーチケミカル</td>ズ <td>K171000</td><td>CYC</td></tr><tr><td>4-[(E)-2-(5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル-2-ナフタレニル)-1-プロペニル]-安息香酸</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-203303</td><td>TTNPB</td></tr><tr><td>50 mL 円錐形滅菌ポリプロピレン遠心分離管</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック 339652</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗CDX2抗体 [EPR2764Y]</td><td>アブカム</td><td>Ab76541</td><td>抗CDX2, &times; 1/1000</td></tr>希釈 <tr><td>B-27 Supplement (50 回;)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17504-044</td><td>無血清サプリメント</td></tr><tr><td>BD FACSAria II セルソーター</td><td>BD バイオサイエンス</td><td></td><td>フローサイトメトリー用</td></tr><tr><td>バイオメディカルフリーザー</td><td>SANYO</td><td>MDF-U538</td><td>-30 °C;</td></tr><tr><td>TC10/TC20用セルカウンティングスライド セルカウンター、デュアル</td><td>チャンバーBIO-RAD</td><td>1450011</td><td>計数スライドグラス</td></tr><tr><td>細胞培養マルチウェルプレート、6ウェル、PS、クリア</td><td>グライナーバイオワン</td><td>657165</td><td>分化培養用/6ウェルプレート</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>タカラト</td><td>ミーAX-310</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>タカラト</td><td>ミーMX-305</td><td>RT-qPCR用</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon Medchem</td><td>Axon 1386</td><td></td></tr><tr><td>クリーンベンチ</td><td>昭和化学&nbsp;</td><td>S-1601PRV</td><td>クリーンベンチ</td></tr><tr><td>Corning CellBIND 6ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3335</td><td>hPSCs/6ウェルプレートのフィーダーフリー培養用</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Basement membrane matrix</td></tr><tr><td>Corning Synthemax II-SC Substrate</td><td>Corning</td><td>3535</td><td>hPSCs/hPSC用合成表面材料のフィーダーフリー培養用</td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ</td><td>ライカ CM1510 S</td><td>凝集体の免疫染色用。</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Kit</td><td>Becton Dickinson</td><td>554714</td><td>Perm/Wash bufferは&nbsp;透過化/洗浄バッファー。Cytofix/Cytopermバッファーは、固定および透過化バッファーです。</td></tr><tr><td>Dako pen</td><td>Dako</td><td>S2002</td> 凝集体 <td></td></tr><tr><td>dNTP mix (10 mM)</td> の免疫染色用<td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18427-088</td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11055</td><td>Secondary Antibody, &times; 1/500 dilution</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, AlexaFluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10036</td><td>二次抗体 &times; 1/500 希釈</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) 高交差吸着二次抗体 Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10040</td><td>二次抗体 &times; 1/500 希釈</td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Merck Millipore</td><td>S30</td><td>Donkey serum</td></tr><tr><td>D-PBS(-) CaまたはMg</td><td>Nacalai tesque</td> <td>なし14249-95</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>エッセンシャル 8 ミディアム</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>A1517001</td><td>hPSCs/hPSC メンテナンス培地のフィーダーフリー培養用</td></tr><tr><td>ファルコン 5 mL 丸底ポリスチレン試験管、セルストレーナー付き スナップキャップ</td><td>コーニング</td><td>352235</td><td>5 mL 丸底ポリスチレンチューブ、セルストレーナー付き</td></tr><tr><td>フィルターチップ、1,000 & マイクロ;L</td><td>Watoson</td><td>124-1000S</td><td>ピペットと一緒に使用</td></tr><tr><td>フィルターチップ、20 & マイクロ;L</td><td>Watoson</td><td>124-P20S</td><td>ピペットと一緒に使用</td></tr><tr><td>フィルターチップ、200 & マイクロ;L</td><td>Watoson</td><td>124-P200S</td><td>ピペットと一緒に使用</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Keyence</td><td>BZ-X700</td><td>免疫染色用</td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2インキュベータ</td>ー <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>370A</td><td>インキュベータ</td></tr><tr><td>ー HNF-1&beta;抗体 (C-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7411</td><td>Anti-HNF1&beta;, &times; 1/200 dilution</td></tr><tr><td>HNF-4&alpha;抗体 (H-171)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8987</td><td>Anti-HNF4&alpha;, &times; 1/200 dilution</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>For nucleus staining, &times; 1/200 dilution</td></tr><tr><td>Human Pancreas Total RNA</td><td>Ambion</td><td>AM7954</td><td>For RT-qPCR</td></tr><tr><td>Human PDX-1/IPF1 Antibody</td><td>R&D Systems</td><td>AF2419</td><td>Anti-PDX1, goat IgG, &times; 1/200 dilution</td></tr><tr><td>Human SOX17 抗体</td><td>R&Dシステムズ</td><td>AF1924</td><td>アンチSOX17 &times; 1/200</td></tr>希釈 <tr><td>改良型MEM 亜鉛オプション 中</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10373-017</td><td>iMEM</td></tr><tr><td>インキュベーションチャンバー</td><td>コスモバイオ</td><td>10DO</td><td>凝集体の免疫染色用</td></tr><tr><td>ラテックス検査用手袋</td><td>足立</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MASコーティングスライドガラス</td><td>松波ガラス</td><td>83-1881</td><td>凝集体の免疫染色</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 96ウェル反応プレート</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td><td>4346907</td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>顕微鏡</td>用 <td>オリンパス</td><td>CKX41N-31PHP</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>マイクロチューブ</td><td>Watoson</td><td>131-515CS</td><td></td></tr><tr><td>モノクローナル抗抗体--フェトプロテイン</td><td>SIGMA</td><td>A8452</td><td>アンチAFP, &times; 1/200希釈</td></tr><tr><td>Nanodrop 8000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>For RT-qPCR</td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>FASMAC</td><td>カスタムメイドオリゴ&nbsp;</td><td>配列のRT-qPCRの場合、"TTTTTTTTTTTTTTTTTT"です。</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、粉末</td><td>Nacalai tesque</td><td>26126-54</td><td>PFA、固定剤、DPBS</td></tr><tr><td>医薬品冷蔵庫</td><td>で希釈 SANYO</td><td>MPR-514</td><td>For 4 &deg;C</td></tr><tr><td>はPIPETMAN P&nbsp;</td><td>ギルソン</td><td></td><td>ピペット</td></tr><tr><td>組換えヒトKGF / FGF-7</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ251-KGKGF</td><td></td></tr><tr><td>組換え人間Noggin</td><td>PeproTech</td><td>120-10C</td><td>NOGGIN</td></tr><tr><td>組換えヒト/マウス/ラットアクチビンA</td><td>R&D Systems</td><td>338-AC</td><td>アクチビン A</td></tr><tr><td>ReverTra Ace (100 U/&mu;L)</td><td>東洋紡</td><td>TRT-101</td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>RNaseフリーDNaseセット (50)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>RNeasyミニキット</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td>RT-qPCR RPMI</td></tr><tr><td>1640 L-GLN</td><td>Nacalai tesque</td><td>30264-85</td><td>RPMI 1640</td></tr><tr><td>シーリングフィルム リアルタイム用</td><td>タカラ</td><td>NJ500</td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>血清ピペット用 10 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4488</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>セロロジカルピペット 25 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4489</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>セロロジカルピペット 5 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4487</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>3579S</td><td>Anti-SOX2, &times; 1/200 希釈</td></tr><tr><td>StepOnePlus</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher</td><td>RT-qPCRのための</td>科学<td></td></tr>的な<tr><td>スクロース</td><td>Nacalaiのtesque</td><td>30406-25</td><td>凝集体の免疫染色のためにTB</td></tr><tr><td>の緑 プレミックスEx Taq II&nbsp;</td><td>タカラ</td><td>RR820B</td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>TC20自動セルカウンター</td>用 <td>BIO-RAD</td><td>1450101J1</td><td>自動セルカウンター</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT化合物 4583&nbsp;</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4583</td><td>骨材の免疫染色用</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4566</td><td>骨材の免疫染色用</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>BIO-RAD</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>超低温冷凍庫</td><td>SANYO</td><td>MDF-U33V</td><td>-80°C;C UltraPure</td></tr><tr><td>0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td><td>DPBSで希釈して0.5 mM EDTA</td></tr><tr><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>For RT-qPCR</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>和光</td><td>251-00514</td><td></td></tr></tbody></table>を調製

効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hpscs から

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

ひと多能性幹細胞 (hPSC)-派生膵臓細胞は、再生医療と人間の発達過程を研究するためのプラットフォームのための有望な細胞ソース。段階的発達過程を繰り返す分化、膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+を含む膵細胞を生成する主要な方法の 1 つを監督 (PDX1+) 膵前駆細胞。従来のプロトコルは、通過後すぐの小さいコロニーと分化を開始します。しかし、植民地または集計の状態で細胞が不均一性は、PDX1 への分化を妨げる可能性がありますになりやすい+細胞。PDX1 に hPSCs を区別するために詳細なプロトコルを提案するここでは、+のセル。プロトコルは 4 つのステップで構成されています、シード解離単一細胞で分化を開始します。SOX17 の誘導+ PDX1 に決定的な内胚葉細胞 2 つの原始腸チューブ マーカー、HNF1β、HNF4α、および最終的な分化の式が続いた+細胞。議定書簡単処理を提供しますと改善や内胚葉系統または PDX1 に効率的に区別するために以前に発見されたいくつかの hPSC ラインの分化効率を安定させる+細胞。

伝搬 hiPSCs (585A129,30) 凝縮と分化に適した均質な膜 (図 1 b)。画一的な hiPSCs (ステージ 0) 解離、低細胞密度 (1 〜 1.5 × 105セル/cm2) にある単一セルとして再シードします。1 h 内のセルは、プレートに取り付け、突起を表示を開始します。1 日目、セルを増殖して表面積の 80-90% をカバーする分散も。ステージ 1 b の中にメディアが死んだ細胞により曇り表示します。死んだ細胞が邪魔生存と分化細胞の下に横になっているので、非常に効率的な分化の死んだ細胞の除去が欠かせません。日 3-4 細胞はコブルス トーン外観と称される均質膜シートを形成します。この時点で、ほとんどの細胞は領域 Y ボックス 2 (SOX2)、未分化細胞のマーカーを特定するセックスを表現するを停止し、代わりに決定的な内胚葉マーカー SOX17、(図 2 ...

ここでは、膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+にひと多能性幹細胞 (hPSCs) を区別するために詳細なプロトコルを提案 (PDX1+) の非植民地型単層成長に基づいて膵臓系譜の生成のためのセル単一細胞を分離しました。このメソッドは、同種 hPSC 由来細胞、遺伝子操作、スクリーニングに適しています。

効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hPSCs から

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

この技術の主な利点は、刺激の前に、細胞が均等に分散され、次いでタンデム細胞接着で均等に刺激されるということです。この手順のデモンストレーションは、当研究室の大学院生である木村吾美です。この手順を開始するには、RPMI 1640の6ミリリットルを氷の上で摂氏4度に冷却したチューブに移します。冷却された1ミリリットルのピペットチップを使用して、基質膜マトリックスの2ミリグラムを追加します。穏やかなピペットによってよく混ぜて、ミリリットル当たり0.33ミリグラムの濃度の基膜マトリックスにします。次に、ピペットを使用して、希釈した基膜マトリックスの2ミリリットルを6ウェル細胞培養プレートの各ウェルに移す。プレートを摂氏37度で60~90分間インキュベートします。この後、プレートを室温で最大3時間、使用できる状態になるまで保管してください。まず、使用培地を吸引し、ピペットを使用して各ウェルに0.5ミリモルEDTAの2ミリリットルを加え、6ウェルプレートで培養したhPCSを洗浄する。次に、井戸からEDTAを吸引し、各ウェルに新鮮な0.5ミリモルEDTAの2ミリリットルを加えます。プレートを摂氏37度で5分間インキュベートします。この後、各ウェルからEDTAを吸引する。室温で1ミリリットルのhPSC維持培地を加え、各ウェルに10マイクロモルY27632を加えます。ピペットは、プレート上に取り付けられた細胞を吹き飛ばし、塊状の細胞を単一の細胞に解離するために、優しく、しかし迅速に。ウェルあたり10マイクロモルY27632を補充し、ピペットによって混合する4ミリリットルのhPSC維持培地を含む50ミリリットル遠心分離チューブに細胞懸濁液を移す。次に、15マイクロリットルのセル懸濁液を、チューブに15マイクロリットルのトリパンブルーを混ぜます。10マイクロリットルのピペットを使用して、希釈したセル懸濁液の10マイクロリットルを重複するセルカウントスライドに移します。自動セルカウンターを使用して、セル番号をカウントし、セルサスペンション内のセル密度を計算します。使用する各ウェルの密度で50ミリリットルチューブに細胞懸濁液を割り当てます。チューブをGの200倍、室温で5分間遠心する。この後、ピペットを使用して上清を吸引し、ウェルあたり1ミリリットルのステージ1A培地を使用して細胞を再中断します。細胞懸濁液を軽くピペットし、さらに1ミリリットルのステージ1A培地をウェルごとに加えます。1000マイクロリットルピペットを用いて、以前に調製した細胞培養板のウェルから希釈された基質膜マトリックスを吸引する。すぐにチューブ内の懸濁液を穏やかにピペットし、6ウェルプレートの各ウェルに2ミリリットルを移します。プレートをアルミニウム箔で覆い、光から保護し、室温のクリーンベンチに10〜15分間置きます。その後、プレートを摂氏37度のインキュベーターに慎重に移し、24時間二酸化炭素と加湿雰囲気を加温します。まず、プレートを軽く振り、ピペットを使用して使用済みの培地を吸引します。その後、各ウェルにDPBSの2ミリリットルを追加します。もう一度そっとプレートを振り、使用したDPBSを吸引します。ステージ1B培地の4ミリリットルを加え、摂氏37度に事前に温め、各井戸に加えます。慎重に5%の二酸化炭素と加湿雰囲気で摂氏37度のインキュベーターにプレートを48時間培養します。この後、プレートを軽く振り、使用済みの培地を吸引します。各井戸にDPBSの2ミリリットルを追加します。この吸引を繰り返し、DPBSを追加して1回繰り返します。プレートを軽く振り、使用済みのDPBSを吸引します。ステージ1B培地の4ミリリットルを加え、摂氏37度に事前に温め、各井戸に加えます。慎重に培養器にプレートを移し、摂氏37度で5%の二酸化炭素と加湿雰囲気を24時間培養します。まず、プレートを軽く振り、使用済みの培地を吸引します。6ウェルプレートの各ウェルにDPBSの2ミリリットルを追加します。その後、プレートを軽く振り、使用したDPBSを吸引します。ステージ2ミディアム4ミリリットルを加え、摂氏37度に事前に温め、各ウェルに加えます。慎重に5%の二酸化炭素と加湿雰囲気で摂氏37度のインキュベーターにプレートを4日間培養します。プレートを軽く振り、使用済みの媒体を吸引します。各井戸にDPBSの2ミリリットルを追加します。DPPS をもう一度吸引し、追加するこのプロセスを繰り返します。この後、プレートを軽く振り、使用したDPBSを吸引します。ステージ3ミディアム4ミリリットルを加え、摂氏37度に事前に温め、各井戸に加えます。慎重に3%の二酸化炭素と加湿雰囲気で摂氏37度のインキュベーターにプレートを3日間培養します。本研究では、hIPを伝播させることは凝縮され、分化に適した均質な単層を形成する。未分化 hIPSE は、低細胞密度で解答し、単一細胞として再シードされます。1時間以内に、細胞はプレートに取り付けられ、突起を示し始める。初日には、細胞が増殖し、表面積の80〜90%をカバーするようによく分布する。3日目および4日目に、細胞は石畳の外観として記述できる均質な単層シートを形成する。この時点で、ほとんどの細胞は未分化細胞のマーカーであるSOX2の発現を停止し、代わりに90%以上の大部分のSOX17陽性細胞で決定的な内胚葉マーカーSOX17を発現し、FOXA2を発現する。その後、細胞は原始的なgoptupeマーカー、HNF1-βおよびHNF4-αを発現し始め、最終的には後部予知性膵臓前駆物質PDX1を90%以上で発現し、PDX1陽性細胞誘導は別のhIPSEライン、1231A3、およびhESEラインで再現可能である。ステージマーカーのMRNA発現のQRTPCR結果は免疫染色と一致しており、PDX1のMRNA発現はステージ3で明らかであり、その後実質的に増加する。未分化ESIPS細胞はコロニーとして増殖するため、個々の細胞は局所的に異なる状態にある。このプロトコルは、選択された分化のために細胞を均等に刺激する方法を提供する。

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