腸幹細胞の隔離とブタモデル分節小さな腸管虚血の文化

この手順の全体的な目標は、腸管上皮幹細胞に対する腸虚血の影響を評価することです。この方法は、幹細胞がどのように損傷に抵抗し、虚血性損傷後の修復に寄与するかなど、幹細胞生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、臨床的な腸疾患と修復の研究に使用できる大型動物モデルであることです。

この手順を実演するのは、大学院生のAmy Stieler Stewartと、私の研究室の研究専門家であるJohn Freundです。メスの刃を使用して、生後8〜10週のヨークシャー交雑豚の臍を中心とした腹部に8〜10センチメートルの腹側正中線切開を行うことから始めます。回盲接合部から約40センチメートルの口腔にある空腸を見つけます。

腸を円周方向に2回結紮して、各結紮糸の間に1センチメートルの空腸の10センチメートルの長さのループを描きます。互いに隣接する虚血の時点ごとに 2 つのループを作成し、1 つは虚血用、もう 1 つは虚血用で、さらに 1 時間の再灌流を行います。可逆的な完全虚血を誘発するには、ブルドッグ血管クランプまたは止血剤を使用して、適切な実験期間、クランプあたり約3つの腸間膜血管を閉塞します。.

虚血期を通して腹部を覆ってください。実験の最後に、メッツェンバウムはさみを使用して、最初に最後の虚血ループの近位に少なくとも5〜10センチメートルの正常な空腸の制御片を収集し、次に残りのループを収集します。各負傷時点からのループは、氷冷したPBSの小さな容器に保管し、陰窩の分離まで保管します。

陰窩幹細胞を単離するには、20ゲージのワイヤーと組織鉗子を使用して小腸の各ループを反転させ、粘膜表面が露出するようにします。各ループの上部と下部をワイヤーにしっかりと縫合し、各逆ループを氷冷PBSですすいでください。すべての管腔破片が除去されたら、直ちにサンプルを氷上の30ミリリットルの解離試薬を含む個々の50ミリリットルの円錐管に30分間入れ、5分ごとに振とうと反転させます。

インキュベーション期間の終わりに、サンプルを30ミリリットルの解離試薬番号2を含む対応する50ミリリットルのチューブに移し、遠心分離によって2〜4時間の虚血ループサンプルをペレット化します。ペレットを5ミリリットルのPBSに再懸濁し、各サンプルから50マイクロリットルのアリコートを使用して、陰窩の会合の程度と破片の量を光学顕微鏡で確認します。次に、サンプルを摂氏37度のウォーターバスに10分間入れ、5分ごとに振とうまたは反転させます。

次に、サンプルを60RPMに設定されたオービタルシェーカーで氷上の25ミリリットルの氷冷PBSに直接移し、2〜5分間の振とうを行い、30秒ごとに追加の手動振とうまたは反転を行います。振とうインキュベーションの最後に、陰窩の会合の程度と破片の量を確認し、サンプルを25ミリリットルの冷たいPBSを含む新しい50ミリリットルの円錐管に移し、無傷の陰窩が最小限の破片と絨毛で分離されるまで振とうします。ループが完全に解離したら、残りの組織を取り出し、遠心分離によってサンプルをペレット化し、残りの陰窩ペレットを5ミリリットルの新鮮なPBSに再懸濁します。

次に、チューブあたり150個のクリプトを個々のマイクロ遠心チューブに分注し、マイクロ遠心分離によってクリプトをペレット化します。予冷したピペットを使用して、ウェルあたり50マイクロリットルのマスターミックスでペレットを静かに再懸濁し、その後15回迅速にピペッティングして混合します。次に、50マイクロリットルの陰窩液滴を、事前にワーム化して格子状にした24ウェルプレートの各ウェルの中央に分注し、プレートを摂氏37度のインキュベーターに置きます。

30分後、各マトリックスパテを腸上皮幹細胞培地のウェルあたり500マイクロリットルで覆い、未使用のウェルに500マイクロリットルの滅菌PBSを追加して湿度を維持し、メッキされたデイゼロクリプトの数をカウントします。48時間ごとに各ウェルに成長因子を追加し、96時間ごとに上清を500マイクロリットルの新鮮な成長因子を補充した培地に交換します。完全な腸虚血は、図のように縫合糸またはクランプによる血管閉塞を利用することにより、小腸ループで作成されます。

正しく行われると、虚血性損傷は腸絨毛の先端から始まり、虚血の持続時間が長くなるにつれて陰窩内に移動します。この外科的技術の一般的な間違いの1つは、血管が結紮またはクランプされていない場合に発生する可能性があり、その結果、薄壁の静脈が動脈の前に崩壊し、追加の血液が組織に浸潤する出血性虚血を引き起こす可能性があります。虚血性腸ループの除去後、腸陰窩は、先ほど示したように解離プロトコルに従って成功裏に分離することができます。

より深刻な被害を受けた時点の陰窩は、損傷を受けていないか軽度のものと比較して、しばしば壊れており、より多くの背景細胞の破片を含んでいます。正常で軽度の損傷を受けた腸の陰窩を培養物に播種すると、腸圏は24〜48時間以内に形成されます。重度の虚血性損傷により、腸の陰窩は生き残りますが、損傷を受け、最初ははるかに小さな球体が形成されます。

72時間から120時間までに、すべての陰窩からのエンテロイドは、明らかな中央内腔と出芽構造でより複雑になり、陰窩の成長効率が全体的に低下し、ひどく損傷した腸組織に由来するエンテロイドのサイズが減少します。一度習得すると、陰窩の分離めっき手順は、適切に実行されれば、約2〜3時間で完了することができます。めっき用に収集された陰窩は、解離画分では培養汚染の可能性が高いため、解離画分からではなく、洗浄から得られることが最善です。

この方法は、虚血プラスまたはマイナス再灌流に起因する上皮損傷を治療するための薬物の有効性をテストするためにも使用できます。その開発後、この技術は、胃腸生物学の分野の研究者が、臨床的に関連性のあるトランスレーショナルな大動物モデルで、虚血が上皮、特に腸幹細胞に与える影響を調査する道を開きました。このビデオを見た後、再灌流の有無にかかわらず腸虚血を作成する方法、およびin vivo損傷後の3D培養のための腸管陰窩の分離方法について十分に理解しているはずです。