蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性

この方法は、DNA修復複合体の形成、局在化、および分解能がどのように制御されるかなど、DNA修復分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、変化を明確に検出し、複雑な局在化と動力学を修復できることです。私の研究室の学部生の研究者に加えて、3人の大学院生が実験を行います。

それは、Changkun Hu、Dalton Dacus、Stephen Walterhouseです。まず、U2OS/DR-GFP 細胞を 10 cm の組織培養プレート上で 85 から 90% のコンフルエントになるまで増殖させます。次に、培地を取り出し、3ミリリットルのEDTAを加え、細胞を室温で3分間インキュベートします。

EDTAを1ミリリットルのトリプシンに交換し、細胞を摂氏37度で5分間インキュベートします。次に、トリプシンを中和するために5ミリリットルのDMEMを追加します。細胞を計数した後、ガラス底96ウェルプレートに200マイクロリットルの培地に1ウェルあたり10〜3の細胞を6回播種する。

あるいは、10センチメートルのプレートに置いた12ミリメートルのカバースリップに8ミリリットルの培地で6つのウェルに10の4倍を播種し、摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩で細胞を成長させます。二本鎖切断(DSB)を誘発するには、培地をDMEMと10%FBSで25マイクロモルの濃度に希釈した過酸化水素に交換し、プレートを摂氏37度で1時間インキュベートします。細胞を1x PBSで3回洗浄し、新しいDMEMを添加します。

細胞をインキュベートした後に固定するには、PBSを使用してプレートを3回洗浄します。次に、針と鉗子を使用して、各時点の10センチメートルプレートからカバースリップを慎重に取り除き、24ウェルプレートの1つのウェルに入れます。4%PFAを添加し、細胞を15分間インキュベートします。

その後、PBSでカバースリップを3回洗います。細胞を透過化するには、0.5%非イオン性界面活性剤とPBSを添加します。細胞を室温で15分間インキュベートします。

その後、細胞をPBSで再度3回洗浄します。次に、PBSで希釈した3%BSAおよび0.1%非イオン性界面活性剤を24ウェルプレートのカバースリップに加え、プレートを室温で1時間インキュベートします。次に、目的の修復タンパク質を標的とする一次抗体を添加し、サンプルを室温で1時間インキュベートします。

細胞をPBSで3回洗浄した後、DAPIを添加し、プレートを室温で5分間インキュベートします。次に、サンプルを二次抗体とインキュベートします。細胞を洗浄した後、前回と同様に埋込試薬を使用して、カバーをスライド上に貼り付けます。

カバースリップを慎重に押し、ワイプを使用して余分な取り付け試薬を吸収します。速乾性の透明なマニキュアでカバースリップを密封し、スライドでカバースリップが完全に密封されるようにします。DAPIチャンネルに焦点を合わせて共焦点顕微鏡画像を撮影します。

免疫蛍光画像で核を定義するには、画像ファイルをImageJウィンドウにドラッグするか、ImageJのプラグインツールバーからバイオフォーマットインポーターを選択して、共焦点画像を開きます。次に、チャンネルの分割を選択します。[カラーオプション]で、ドロップダウンメニューから[カラーライズ]を選択します。

[OK] を 選択して DAPI イメージと histone H2AX イメージを別々のウィンドウとして開き、DAPI イメージを選択します。次に、しきい値の調整オプションで画像ツールバーを選択して、原子核を選択します。次に、しきい値ウィンドウの下部のバーを完全に右にスライドさせて、画像のしきい値を調整します。

原子核が完全に赤く表示され、輪郭がはっきりし、背景が黒くなるまで、トップバーを調整します。次に、解析ツールバーと粒子の分析オプションを選択します。原子核の最小サイズを入力します。

[表示]ドロップダウンメニューから[アウトライン]を選択し、[マネージャーに追加]オプションを選択します。「OK」をクリックして、ROI マネージャー・ウィンドウを開きます。ROIマネージャーウィンドウから、選択によって核に番号を割り当てます。

ImageJを使用してH2AX病巣および免疫蛍光顕微鏡画像を定量するには、H2AX病巣ウィンドウを選択します。次に、プロセスツールバーを選択し、最大値を見つけるを選択して、原子核内の焦点を見つけます。出力タイプのドロップダウンメニューから、単一ポイントオプションを選択し、プレビューポイント選択を選択して最大焦点を視覚化します。

次に、画像の蛍光強度に応じたノイズ許容値を入力します。ROI マネージャー ウィンドウから、H2AX 病巣を定量化する必要がある核を選択します。選択した核内の最大焦点の数を測定するには、測定値を選択します。

未加工の強度値をコピーして、データ分析用のソフトウェアに貼り付けます。このビデオで前述したように、カバースリップを装着した96ウェルプレート上に細胞を着座させた後、脂質ベースのトランスフェクショナリーエージェントを使用して細胞にI-SceI発現ベクターをトランスフェクションすることにより、二本鎖切断を誘導します。先に示したように、vixを透過処理およびブロックした細胞を洗浄した後に想像するには、γ H2AXに対する抗体を添加し、目的のタンパク質を修復します。

1x PBS洗浄では、96ウェルプレートカバーを3回洗浄します。次に、96ウェルプレートカバースリップを二次抗体とインキュベートします。最後に、大きな核ガンマH2AXフォーカスを持つ細胞を同定した後、目的の修復タンパク質との共局在も示す細胞を手動でカウントします。

この図は、ノイズ識別が 90 であることを示しており、フォーティカルの正しい数を示しています。エッジ上の核と核の外側の焦点は、定量中にカウントされません。ここに示すパネルは、50 の低ノイズ許容誤差を示しています。

多数の極大体が核の外側と核の内部で識別されます。このセルには220の高いノイズ耐性が見られます。1 つの病巣のみが検出されました。

この図には、ガンマH2AXフォーカスと目的の修復タンパク質の共局在が示されています。ここにはトランスフェクションされていない細胞が示され、右上に非核ガンマH2AXフォーカスを持つ細胞が示されています。高倍率では、真の内部焦点と非核または外部焦点のより鮮明な画像を区別できます。

最後に、修復タンパク質の共局在を伴わない核ガンマH2AXフォーカスの例をここに示します。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば数日で完了できます。この手順に続いて、対象の修復タンパク質間の相互作用を同定するために、共ミューター沈殿などの他の方法を実行できます。

このビデオを見れば、DNAの一過性二本鎖切断を誘導してDNA修復複合体の形成と分解能を観察する方法を十分に理解できるはずです。また、修復因子の誤局在化と、長期にわたる病変を誘発することで加入の遅延を明確に区別する方法も学びます。