Name: フローサイトメトリーによる水生バイオ フィルムの特性 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学ぶフローサイトメトリーと視覚的クラスタリングを用いた水生バイオフィルムの特性評価法。環境科学や水生生態学の研究で、微生物群集の構造変化や微細プラスチックなどの粒子性汚染物質の検出に応用できます。

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提示された作品は、SNF Ambizione 親睦 (PZ00P2_142533) とベルックス研究助成 (Amplebig) によって支えられました。については実験的な作品をベティーナ ワーグナーに感謝したいと思います。

1. 生態系の選択とバイオ フィルム サンプリング
<ol><li>興味の水圏生態系を選択し、バイオ フィルムが成長サンプリング サイトを検索します。中の水の流れが遅いとストリームの浅い部分、石河床のバイオ フィルムの添付ファイルの適切な17,18。</li>
	<li>オプション: サイトにバイオ フィルムの添付ファイル、またはサイト内のバイオ フィルムのバラツキを減らすこと十分なサーフェスがあるない場合人工バイオ フィルム添付ファイル (例えばスライド ガラス、セラミック タイル) 基板に配置サイトことを確認しながら彼らは水の流れについては、同じような深さと光強度19で同じ方向に配置されます。</li>
	<li>サンプリングのサイト、光の強度を測定する携帯用装置を使用で環境条件を決定する水の温度、電気伝導度、酸素、表面のバイオ フィルムの真上の pH をからサンプリングすることです。サンプリングのコースで、平均値を計算するために繰り返し測定 (3-5) を取る。</li>
	<li>オプション: 関連する決定するために取る水試料水化学パラメーター (溶存有機炭素 (DOC)、K+、ナ+、Ca2 +Mg2 +、Cl-、F - その4-2、PO42-、3-2、SiO44 -)。</li>
	<li>保護手袋を使用して、各サイト (または人工基) から (サイズ、形状、および種類) に匹敵する石を収集します。石は、同様の流れと光条件18にさらされる必要があります。</li>
	<li>0.22 μ m フィルターをサイトから十分な河川水をフィルター (例えば、 1 サンプルあたり 15 mL) すべての収集のサンプルの準備ができます。</li>
	<li>柔らかい歯ブラシを使用して、フィルター選択されたストリーム水20の 15 ml フラスコ (ブラシすべてバイオ フィルムが除去されるまで) に基板からバイオを削除します。</li>
	<li>0.01% パラホルムアルデヒドと 0.1% グルタルアルデヒド21のサンプルを修正します。</li>
</ol>2. 最適な流れ-フローサイトメトリー (FC) パラメーターの決定
<ol><li>光顕微鏡とサブサンプルを転送 (X/0.75 40 を使用して目的; 必要な場合 100 × 1.3 油目的) サンプル22,23の種を識別し、。</li>
	<li>識別される注文適切なカルチャのコレクションから単一の種 (例えば実験的藻類やゲッティンゲン大学 [EPSAG] で藻類の文化コレクション [CCAC] ケルン大学で藻類の文化コレクション場合監視される中央ヨーロッパの生態系における)。</li>
	<li>同様の環境条件 (例えば光、温度、pH) で継続的に単一の種をバイオ フィルムがから採取された環境に育ちます。1 ° C と 0.5 内滞在環境試料から pH ポイントをお勧めします。</li>
	<li>デタッチ/細胞の分散、遠沈管に単一種のサンプルの 15 mL を入れて水お風呂の中央にチューブを入れし、水没、試料の液体の表面がお風呂の表面と同じレベルでされるように。超音波照射 45 kHz24,25で 1 分のサンプル</li>
	<li>プレート リーダーを使用して単一種の吸収及び蛍光スペクトルを記録します。プレート リーダーの指示のための選択を参照してください。この例では、200 μ L のサンプル量で読み込まれた 96 ウェル平底透明ポリスチ板と吸光度を測定しました。(使用する設定: (a) 蛍光スキャン モード; 発光波長ステップ サイズを 10 nm、発光スキャン数 30、帯域幅 20 nm、100 を得る 25 点滅、20 米国統合時間または (b) 吸光度スキャン モード; 25 が点滅し、帯域幅 9 nm)。</li>
	<li>レーザー、ダイクロイック スプリッター フィルターの組み合わせで異なる種が特定のプロパティをあるすべてのそれらの蛍光の範囲をカバーすると流れの cytometer を設定します。中央ヨーロッパのストリームで、405 nm、488 nm と 638 nm レーザー役に立つ結果を生成します。</li>
	<li>サンプルのすべてのイベントの少なくとも 99% を含める (すべての流れの cytometers は適用されません) のフォトマルの電圧設定と測定された蛍光の範囲を調整します。</li>
	<li>また、種バイオ フィルムの存在に関する知識を使用できる場合は、手順 2.2 から始めます。蛍光特性がわかっている場合は、ステップ 2.6 開始します。</li>
</ol>3. オプション: 準備流れフローサイトメトリーによるリファレンス ・ データベースの
注: FC にはバイオ フィルム中の現在のセルの分類同定はできません。FC として、バイオ フィルムと同様の条件で栽培、バイオ フィルムに存在する知られている単一種の測定の参照データベースは、データの解釈を助けることができます。
<ol><li>
参照: 単一種
	<ol>
<li>最適化された FC パラメーターを使用して 2.5-7 で設定、単一の種 (パラホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドで固定し、流れの cytometer の適切なサイズのフィルターで濾過) の光と蛍光特性を測定します。</li>
		<li>バイオ フィルム (ステップ 6.1.2 を参照) からのデータと同じ方法で単一種からデータを正規化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
破損や腐食セルを参照する: バイオ健康の最も重要な指標の一つは、破損している死んでいる細胞バイオ フィルム中に存在の一部です。これらの細胞を定量化するには、腐食のセル参照を作成できます。<ol>
<li>希釈したバイオ フィルムの 1 mL のサブサンプルを取り出して卓上遠心分離機で 10 分間室温 8,000 × gで遠心分離機のそれら。1 mL 90% エタノールで結果として得られるペレットを中断し、4 ° C で一晩懸濁液を保存次の日を繰り返します。</li>
		<li>FC に最適化された設定を使用すると、破損や腐食セル (固定およびフィルター処理) の光と蛍光特性を測定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
参照: microplastics メモ:バイオ フィルムにおける塑性粒子を監視に興味がある場合、彼らが十分に異なるかどうか確認光生物粒子および識別のため蛍光特性から。<ol>
<li>Microplastics プロデューサーの指示に従って塑性粒子を中断し、(2.7 から FC パラメーターを使用して) その光と蛍光特性を測定します。</li>
		<li>バイオ フィルムのサンプルに塑性粒子を追加し、4 ° C で 1 泊以上を残す</li>
		<li>サスペンションと上記と同じ FC パラメーターでメジャーをフィルターします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 試料の調製及び保管
<ol><li>設定されている FC と FC リファレンス ・ データベースが準備ができて、1 つは 1.1-7 の手順に従って採取した新鮮なバイオ フィルム試料の評価を続行できます。デタッチ/分散バイオを遠沈管に (ステップ 1.7 参照) フラスコからサンプル 15 mL を転送します。</li>
	<li>水槽の中央に各チューブを入れて、水没して試料の液体の表面がお風呂の表面と同じレベルで。超音波照射 45 kHz で 1 分のサンプル</li>
	<li>0.01% パラホルムアルデヒドと 0.1% グルタルアルデヒド (nanopure 水の株式) のサンプルを修正します。解析の準備ができるまで 4 ° C で保存します。</li>
	<li>重要: フローサイトメトリー分析用サンプルの半分を使用してストレージの安全のため、蛍光活性化細胞ソーティングや光学顕微鏡 (セクション 6 を参照) を持つ省略可能な検証のために半分。 :に注意してください、冷蔵庫に保管、固定バイオ フィルム サンプル保つ必要がありますその光と蛍光特性まで 3 週間。</li>
</ol>5. FC を通してサンプルの実行
<ol><li>サンプルが冷蔵庫の中に格納されていた場合、それらをすばやく超音波または粒子を分離する数回をピペットします。計測する前に 50 μ m フィルター (フィルター サイズは FC 毛細血管の幅によって異なります) と、サブサンプルをフィルターします。</li>
	<li>個々 のサンプルを読み込む (これは使用される流れの cytometer で依存 1-2 mL) 流れの cytometer に各粒子の光と蛍光特性を測定し、。各生物の複製 (3 つの技術的なレプリケートします) 3 回測定を繰り返します。</li>
	<li>.Csv 形式で FC からデータをエクスポートします。</li>
</ol>6. データの準備・相関分析
FC は、各測定の光学特性および蛍光範囲のいくつかのパラメーター (例えば、信号領域、高さ、幅) を分析できます。測定された変数の相関分析を実行して高い相関されていないこれらの測定のみ。これは通常 (例えば、信号領域) 1 つの FC パラメーターがすべて削除され、関連付けることがまた削除高い蛍光測定 (通常同じレーザーを発すると隣接するフィルター)。
<ol><li>
Matlab のツールボックスとしてチトクロームを実行します。
	<ol>
<li>CYT ソフトウェア16などすべての技術と生物学的に分析することをすべてのサンプルから .csv 形式でインポート削減 FC データをレプリケートします。([+、ファイル フィルター *.csv、インポート ファイルを選択) します。</li>
		<li>逆双曲線正弦変換を使用してすべてのサンプルの蛍光のチャンネルを変換します。補因子の値は、選択する必要があります。最も光合成バイオ フィルムと流れの cytometers が最適化の 150 作品特定の実験のセットアップと従属栄養性バイオ フィルムの必要があります。(右-クリック/変換/入力因子 150)</li>
		<li>品質管理、視覚的に、(CYT) で個々 のサンプルとレプリケーションの技術および生物学的レベルで異常値がないかどうかを確認する個々 の光や蛍光灯チャンネルのヒストグラムを比較します。外れ値は、複製間大幅シフト蛍光/光分布で現れます。(チャンネル] を選択 [データ プロット)<ol>
<li>代替方法: は蛍光分布の平均値を主成分分析 (PCA) を実行し、技術、生物学的複製クラスター一緒にかどうかを確認します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>差し込み印刷技術は各生物の複製で複製し、それぞれ同じ数のパーティクル (セル、セル フラグメントおよび非生物的微粒子) で表現されます、ので、粒子の総数によって分析、生物の複製をサブサンプリング埋め込み (bh SNE) バーンズ小屋確率隣人は、約 150,000 (最高の可視化結果の26) のためです。(データを右クリックし、マージ/サブサンプルを選択)</li>
		<li>サンプルの比較は、比較されるべきサンプルのみを選択することが重要です。サンプルを選択し、bh SNE27を実行します。アルゴリズムが完了、新しいチャンネルと、名前付きの bh SNE1 と bh SNE2 が表示されます。これらは、散布 (viSNE マップ) のデータの視覚化に使用できるすべての分析された粒子の SNE 座標です。(データを選択、チャンネル、右クリック、bh SNE を選択、正規化されたデータをはい)</li>
		<li>ViSNE マップで粒子の類似性に従って配置や視覚的に分離可能なクラスターにグループ化されます。それらはよく分かれている、CYT 用意されている描画ツールを使用して、異なる光/蛍光特性クラスターとマークと名前の光/蛍光プロパティの検査します。(選択チャネル bh SNE1、bh SNE2)</li>
		<li>オプション: 単一微生物種 (と同じフローサイトメトリー測定し、同様の条件で成長した!) のリファレンス ・ データベースを使用する場合は、Matlab に viSNE マップをエクスポートし、マップ上にリファレンス ・ データベースをプロジェクトします。このように、特定のクラスターは、特定種/分類学的グループ (https://github.com/anzezupanic/FC_analysis でダウンロード可能なスクリプト) に接続できます。(セッション/保存)</li>
		<li>トラブルシューティング: bh SNE 解析に視覚的に分離可能なクラスターが単一の大きなものを返さない場合に多くのパーティクルで使用された bh SNE。サンプルごとのパーティクル量を減らして再度実行してください。クラスターがスパースではなく個々 のポイントがない場合は、使用される粒子の数を増やします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>オプション: bh-SNE のクラスタ リングに依存せず、他のクラスタ リング手法 (例えば、階層、重心ベースまたはクラスタ リングに基づく密度) 正規化されたデータで使用でき (https://github.com/ viSNE 地図上に重ねられますanzezupanic/FC_analysis)。</li>
	<li>クラスターを特定したら、各サンプルの各生物の複製に属する各クラスター内のパーティクルの数をカウントします。適切な (例えばホームズ) と ANOVA および Tukey のテストを使用して、サンプル間の違いを評価する多重比較補正。</li>
</ol>7. オプション: 検証蛍光活性化細胞ソーティングを使用してクラスターの解釈
<ol><li>クラスターを特定したら、FACS がレーザーと蛍光フィルターの類似 (または同一) 構成サンプル必要な場合それらをソートするのに蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えを使用します。</li>
	<li>それぞれの特定されたクラスターの CYT クラスターを定義する光と蛍光のゲートがあります。各クラスター、FACS で粒子を整理し、光学顕微鏡を使用して並べ替えられた細胞を識別するこれらのゲートを使用します。</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

上記で説明したプロトコルは比較的簡単に実装です。しかし、提示された既定の設定がすべて光合成バイオ フィルムはこれまでテストに適していることが示されている、(プロトコルで説明) の最適化はメソッドから得られる情報を最大限に必要です。確かに、バイオ フィルムの光と蛍光特性環境条件 (季節、温度、水の化学組成)1によって異なることができます。そのため、FC 分析を設定するとき、この変動を考慮取ることが重要です。1 つの方法これはサンプリング サイトからバイオ フィルムの代表的なサンプルを取って、単一の種を取ってやさまざまな条件と測定のそれらの成長によっては異なる設定を使用しています。単一種の成長も FC の結果を解釈するために使用できる蛍光特性のデータベースの構築に便利です。ただし、これを行うには、単一の種が、バイオ フィルムはサンプリングするつもりされるそれらと同様の条件で測定されていることが重要です。たとえば、25 ° C で成長している単一種の FC 測定のデータベースは 15 ° c. で成長しているバイオ フィルムの組成についての少しを教えてくれますしかし、それはこのメソッドを効果的に...

バイオ フィルムは微生物や生態系における生物多様性の分布に影響を与える第一次生産、栄養循環や水の浄化に至る、淡水の生態系で重要な役割を再生する微生物の動的コンソーシアム1。 彼らのコミュニティの構造がより寛容種2,3に向けて迅速にシフト バイオ フィルムは化学薬品、ストレス、環境の変化にさらされているとき。感度が高くは、しかし、現在の方法のどれも実際に迅速かつ簡単な方法でバイオ フィルムのコミュニティのダイナミックをトレースに最適です環境監視4、魅力的なモデル システムにバイオ フィルムを回します。
一般的に使用される一連のバイオ フィルムを特徴付けるメソッドは機能的及び構造的エンドポイントの測定から成っています。社会全体のレベルで細胞外酵素の活動と同様、光合成と呼吸の活動情報を提供バイオ5,6,7,8 の機能の状態に ,9。バイオマスの発生は全体的なバイオ フィルムの成長の指標として使用されます。構造変更現在測定顕微鏡またはヌクレオチド ベースの技術 (例えば、勾配ゲル電気泳動法 (dgge 法)、自動化されたリボソーム遺伝子間スペーサーを変化させる伝統的な種の同定を使用してのいずれかメタゲノム解析 (アリサ))10、11,12。これらのメソッドは、情報を提供するが、特定の知識を必要とする、または実行に時間がかかり、またはまだ開発中でいます。最後に、新しい細胞外高分子物質 (EPS)13,14とバイオ アーキテクチャの1、敏感な中評価法低スループットし、に向かって開発されていません。監視の目的。
淡水のバイオ フィルムの完全な特性評価、それはバイオ フィルムの機能、構成とアーキテクチャに洞察力を提供するいくつかの異なる方法を組み合わせる必要は明らかです。環境モニタリングのため、他の一方で、バイオ フィルムの変化を検出し、機能と構造のレベルでシフトの基本的な生物学的解釈を有効にすることができる高速で機密性の高いメソッドが必要です。
監視目的のため、十分に高速であり同時にバイオ フィルムのコミュニティのための十分な情報を提供します。 ストリームのバイオ フィルム (河床) の光合成のコンポーネントの微生物群集特性に対する新しい方法を開発しています。15生物学的解釈を許容する構造。それは単一セル フローサイトメトリー (FC) バイオ フィルムのサンプルに基づいており、計算可視化と相まって単一セルのレベルのバイオ フィルムの光や蛍光灯の特性に関する情報を提供します。
バイオ フィルムのサンプリング後のワークフローは、超音波処理、固定とフローサイトメトリーによるサンプルを評価することによって続いてサンプルのサイズに基づくフィルタ リングの形態の試料で構成されます。取得したデータは、1 回の測定で複数の細胞特性の情報: 粒子サイズ、密度、色素含有量バイオ フィルム中の非生物的コンテンツ (例: microplastics)。このデータ セットは埋め込み (viSNE)16データの高速かつ簡単な解釈を可能にする視覚的確率的近傍を用いた計算可視化分析よりも。設定し、メソッドを最適化する数週間が必要ですセットアップ後、結果の解釈にバイオ フィルム サンプルを収集からほんの数時間がかかります。
他のものより本手法の主な利点は、解析と高情報内容の速度です。また、数週間後にその光の損失と蛍光特性なしコレクション サンプルを保存ことができます。これは、サンプル数が多いが大規模なサンプリング研究やバイオモニタ リングなど、必要なが大量の探索的研究小規模で情報を提供することも非常に便利です。
提案するプロトコルは、ストリームのさまざまな場所から収集された光合成バイオ フィルム (河床) の流れフローサイトメトリー分析に基づいています。プロトコル、例えば監視目的のため、適切なサイトの選択の多くの手順は、研究の目標に依存し、処方することが。その他はより少ない自由を許可する、プロトコルが密接に続いているこれは詳細なプロトコルの下で明らかにされてする必要が。
プロトコルは、バイオ フィルムを用いた環境モニタリングのためのサイトの選択から始まります。次のステップは、その測定監視環境でバイオ フィルムに住んでいる異なった光合成有機体の識別を有効にするを設定する流れの cytometer (FC) です。これは種バイオ フィルムと流れの cytometer レーザーと光で測定を有効にするとフィルター設定に存在の蛍光特性を識別するサイトからバイオ フィルムのサンプルを収集することにより実行されます。波長です。バイオ フィルムができる FC をセットアップした後、定期的に、フローサイトメトリーを用いてバイオ フィルムと視覚的クラスタ リングによって分析されたデータに存在する単一粒子の光と蛍光特性のサイトから収集します。結果の解釈、FC のリファレンス ・ データベースはローカルのバイオ生物種とその表現を構築し、FC データで別の分類を識別するためにデータベースを使用可能です。検証は、FACS、本種の分類同定を顕微鏡ベースを使用して単一セルの特定のクラスターの蛍光ベースの並べ替えを介して可能です。プロトコルの概略は、図 1で与えられます。

<table><tbody><tr><td>マルチメーター</td><td>WTW</td><td>MultiLine 3620 IDS</td><td>温度、pH、溶存酸素の測定用</td></tr><tr><td>超音波洗浄機</td><td>VWR International</td><td>97043-986</td><td>タンク寸法:15*14*10 cm</td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>Gallios</td><td>レーザー:405、488、638 nm。補足表11のバンドをフィルタリングします。Sgier et, Nat Comm, 2016.&nbsp;</td></tr><tr><td>プレート</td><td>リーダーTecan</td><td>Infinite M200</td>は、<td></td></tr><tr>補足表12のFC<td>セルソー</td><td>ターBeckman Coulter</td><td>MoFlo Astrios</td>設定の適切な設定を選択するために使用されます<td>。Sgier et, Nat Comm, 2016.&nbsp;</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 135</td><td>Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective</td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>R2013a</td><td>数値計算用ソフトウェア</td></tr><tr><td>CYT</td><td>Dana Pe'er Lab</td><td>サイト</td><td>メトリーデータの解析のための無料インタラクティブ可視化ツール</td></tr></tbody></table>

フローサイトメトリーによる水生バイオ フィルムの特性

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

バイオ フィルムは、淡水の生態系で重要な役割を再生する微生物の動的のコンソーシアムです。彼らのコミュニティの構造を変更すると、バイオ フィルムは環境の変化に迅速に対応、水質の指標としてこうして使用することができます。現在、バイオ フィルムの評価はほとんど統合的で機能的なエンドポイントに基づいて、光合成や呼吸の活動などバイオ フィルムのコミュニティの構造に関する情報を提供していません。フローサイトメトリーと計算可視化、淡水のバイオ フィルムの培養部で特に、群集組成の評価のための代替、機密性の高い、使いやすいメソッドを提供しています。流れの cytometer を介して全体のサンプルを実行する後にのみ基本的なサンプル準備が必要です。単一セルの光と蛍光の情報は、計算可視化と生物学的解釈のため使用されます。他の方法でその主な利点は、解析と高情報内容自然の速度です。フローサイトメトリーは 1 回の測定で複数の細胞とバイオ フィルム特性に関する情報を提供します: 粒子サイズ、密度、色素含有量、バイオ フィルム、および粗い分類情報の非生物的コンテンツ。ただし、種レベルでのバイオ フィルム構成の情報は提供しません。水生生物の生態系の環境を監視するためのメソッドの使用方法の可能性が高いと下流に通知手順初期バイオ フィルム評価として補完的でより詳細な方法で調査の詳細についています。

ここ (図 1) に示す手順を使用して、スイス連邦共和国のローカル ストリームのいくつかのサイトから採取したサンプルを分析しました。各サイトで 3 つの類似大きさで分類された石 (10-12 cm) が撮影された、バイオ フィルムは石をはらっていた。サンプルだったし、超音波処理、修正、フィルターおよびフローサイトメトリーで分析した後。流れの cytometer と使用されるリファレンス ・ データベースのセットアップされた前紙15に記載と同じ: 3 つのレーザーが使用された (405、488、638 nm)、7 ダイクロイック スプリッター、フィルター カバーに 425 から蛍光排出量を 10 個 &gt; 755 nm、参照データベースを含む &gt; 30 種をカバーするシアノ バクテリア、緑の藻、珪藻、紅藻スイス ストリームのバイオ フィルム内で見つかった。ViSNE マップの作成に使用される粒子数は約 150,000 (<strong class="xfig...

視覚的クラスタ リングと組み合わせてフローサイトメトリー水生バイオ フィルムを研究するための使いやすい高速メソッドを提供しています。バイオ フィルムの特性評価、バイオ フィルムのコミュニティ構造の変化の検出とバイオ フィルムに埋め込まれた非生物的微粒子の検出に使用できます。

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

この方法は、化学汚染の影響や水生生態系の気候変動など、環境科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、すべての個々のステップがシンプルで高速に実行できることです。この手順の焦点は独立栄養性バイオフィルムの特性評価ですが、従属栄養性バイオフィルムの特性評価やマイクロプラスチックなどの粒子状汚染物質の検出にも使用できます。まず、バイオフィルムが成長する水生サンプリングサイトを選択しますが、これらは通常、水の流れが遅く、中程度に水流が緩やかで、石の多い川床を持つ小川の浅い部分です。バイオフィルムを付着させるのに十分な表面がサイトにない場合は、バイオフィルムが成長できる人工基材を使用できます。ポータブル機器を使用して、サンプリングするバイオフィルムの表面のすぐ上の導電率、pH、水温、光強度を測定することで、サンプリング現場の環境条件を測定します。保護手袋を使用して、各サイトからサイズ、形状、種類が類似した石を収集します。石は、同様の流れと光の条件にさらされる領域から収集する必要があります。バイオフィルムサンプルの収集と現場での成長条件の測定に加えて、水サンプルを取得して水化学パラメータを測定します。バイオフィルムサンプルを処理するには、まず、0.22マイクロメートルのフィルターを介してサイトからの15ミリリットルの小川水をろ過します。次に、柔らかい歯ブラシを使用して、バイオフィルムがフラスコに完全に懸濁するまで、基材からバイオフィルムを取り除きます。0.01%パラホルムアルデヒドと0.1%グルタルアルデヒドを使用してバイオフィルムサンプルを固定します。バイオフィルムのサブサンプルを光学顕微鏡に移します。サンプルに適した倍率で、バイオフィルムサンプルに存在する種を特定します。個々の種の培養物を準備します。バイオフィルムサンプルが採取された環境と同様の環境条件を使用して、それらを連続的に成長させます。増殖したら、細胞を45キロヘルツで5〜10秒間超音波処理することにより、細胞を分散させます。分散させた細胞を96ウェルプレートに入れます。分散したら、プレートリーダーを使用して単一種の吸光度と蛍光スペクトルを記録します。次に、ダイクロイックスプリッターとフィルターを使用してフローサイトメーターをセットアップし、さまざまな分子種が特定の特性を持つことがわかった蛍光範囲をカバーします。単一種のリファレンスを調製するには、最適化されたフローサイトメトリーパラメータを使用して、単一種の光学特性と蛍光特性を測定します。次に、希釈したバイオフィルムの1ミリリットルのサブサンプルを採取し、それを8, 000gで10分間遠心分離し、次いでペレットを1ミリリットルの90%エタノールに再懸濁することにより、損傷した腐敗した細胞を調製する。懸濁液を摂氏4度で一晩保管し、翌日もこのプロセスを繰り返します。同じ最適化されたフローサイトメトリー設定を使用して、損傷した細胞と崩壊した細胞の光学的および蛍光的特性を測定します。フローサイトメーターのパラメータを設定し、リファレンスデータベースを構築したら、モニタリングキャンペーンのためのサンプルの収集を開始します。サンプルは、前のステップで示されたように収集および処理する必要がありますが、超音波処理は45キロヘルツで1分かかる必要があります。分析の準備ができたら、保管場所からサンプルを採取します。フローサイトメーターの詰まりを防ぐには、50μmの細孔フィルターでサブサンプルをろ過し、個々のサンプルの1〜2ミリリットルをフローサイトメーターにロードして、各粒子の光学的および蛍光特性を測定します。各サンプルについて測定を3回繰り返します。MATLAB を開き、CYT をツールボックスとして実行します。次に、リダクションフローサイトメトリーデータをcsvファイルとしてCYTソフトウェアにインポートします。次に、双曲線アークサイン変換を使用して、すべてのサンプルの蛍光チャネルを変換します。co-factor の値として 150 を入力します。この値は、ほとんどの光合成バイオフィルムやフローサイトメーターで機能しますが、最適化が必要な場合があります。品質管理のために、個々のサンプルと個々の光学チャネルおよび蛍光チャネルのヒストグラムをプロットして視覚的に比較し、複製の技術的および生物学的レベルで外れ値がないことを確認します。外れ値は、反復間で蛍光光学分布が大きくシフトして現れます。次に、各生物学的レプリケートのテクニカルレプリケートをマージし、生物学的レプリケートをサブサンプルして、それぞれが同じ数の粒子で表されるようにします。Barnes-Hut Stochastic Neighbor Embeddingによって分析される粒子の理想的な数は、約150, 000です。サンプル間の比較では、比較するサンプルのみを選択し、Barnes-Hut Stochastic Neighbor Embeddingを実行します。アルゴリズムが終了すると、bh-SNE1 および bh-SNE2 という名前の新しいチャネルが表示されます。結果のチャネルからのデータを散布図として視覚化し、解析されたすべての粒子を含むすべての確率的近傍埋め込み座標を表示します。クラスターが視覚的に分離できない場合は、解析に使用された粒子が多すぎるか、または不十分である可能性があります。粒子の数を調整し、解析を繰り返します。viSNEマップでは、粒子は類似性に従って配置され、視覚的に分離可能なクラスターにグループ化されます。クラスターの光学蛍光特性を検査し、描画ツールを使用して、十分に分離され、異なる特性を持つクラスターにマークを付けて名前を付けます。その後の統計解析では、viSNE クラスターを MATLAB にエクスポートします。ここで紹介する手順を使用して、スイスの地元の小川のいくつかのサイトから採取したサンプルを分析しました。viSNEマップを使用すると、異なる環境バイオフィルムを区別することができます。ここでは、viSNEマップのさまざまな部分で6つの異なるサンプルが異なる密度を特徴としています。ここに示すviSNEマップには、さまざまな光学特性と蛍光特性を持つ粒子が入力されており、粒子の生物的/非生物的起源と、生物粒子が属する分類学的グループへの手がかりが得られます。さらに、参照データベースをviSNEマップに投影すると、マップのどの部分にどの分類群や非生物的粒子が入力されているかを解釈するのに役立ちます。また、サンプル間でどの部分母集団が異なるかを確認することもできます。ここでは、各部分集団の粒子の数が、異なる生物学的複製ごとに示されています。この手法を習得すれば、サンプル収集から分析完了まで2時間で完了します。この手順に続いて、蛍光活性化細胞ソーティングなどの他の方法を使用して、視覚的クラスタリングの予測を検証できます。このビデオを見れば、フローサイトメトリーとビジュアルクラスタリングを使用して水生バイオフィルムを解析する方法を十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Environment

環境

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フローサイトメトリーによる水生バイオフィルムの特性

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