Name: 糖尿病マウスの慢性創傷を作成するためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 学ぶ db/dbマウスを用いた糖尿病性慢性創傷モデルの作成プロトコル。抗酸化酵素阻害と酸化ストレス誘導により、バイオフィルム形成と創傷慢性化を再現する方法を解説。

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著者は謝辞を持っていません。

著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。

マウスに慢性創傷が作成されると、このモデルは、慢性の開始に関与する創傷治癒過程の障害を研究するために使用することができる。このモデルはまた、慢性創傷の発達を逆転させ、治癒を損ない、創傷の閉鎖および治癒につながる広範囲の化学物質および薬物の有効性をテストするために使用することができる。慢性の発症後の異なる時間ポイントを研究することができます:例えば、慢性の早期発症のために創傷後1〜5日、および完全な強さの慢性創傷のために20日以降。
慢性創傷モデルはまた、創傷治癒および生体負担および液位症などの合併症の様々な側面を研究するための強力なモデルである。バイオ負担は、人間の慢性創傷にも影響を与えるため、このモデルで研究できる慢性創傷の多くの面の1つに過ぎません。当社の手順と動物使用プロトコルは、定義されたモニタリングスケジュールと共に、監視する症状を明確に識別します。IACUC承認基準に基づいて罹患死と同定された動物は、重大な苦しみを避けるために安楽死させる。また、特定の症状が発生した場合には、キャンパス獣医と動物衛生技術者に相談し、基準の評価に関する支援的なガイダンスを...

創傷治癒は、時間的および空間的に調節される複雑な細胞および分子プロセスを含み、免疫応答および血管に限定されない多くの異なる細胞タイプを含む多くの異なる細胞タイプを含む連続的かつ重なり合う段階で組織されるシステム1.皮膚が傷害を持続した直後に、因子および血液細胞は創傷部位に凝集し、凝固カスケードを開始して血栓を形成する。恒常性が達成された後、血管は、異物の創傷床をクリアし、プロテオ分解酵素を分泌するために多形態性細胞を化学的に引き付ける創傷部位酸素、栄養素、酵素、抗体および化学的要因に入るように拡張する。2.活性化血小板は、傷部のケラチノサイトを刺激するために様々な成長因子を分泌し、傷部を再上皮化させる。創傷部位に募集された単球は、食細胞細胞細菌と死んだ好中球を循環させるマクロファージに分化し、ケラチノサイト増殖およびプロ渡虫シグナルを維持するための追加因子を分泌する。増殖段階では、再上皮化が続く間、線維芽細胞、単球/マクロファージ、リンパ球、および内皮細胞からなる新しい造粒組織が再建プロセス2を継続する。血管新生は、内皮細胞の増殖および移動を促進することによって刺激され、新しい血管発達をもたらす。細胞外マトリックスの上皮化および改造は、環境に対する障壁を構築する。創傷が治癒し、造粒組織が瘢痕に進化するにつれて、アポトーシスは、追加の組織損傷を引き起こすことなく、炎症細胞、線維芽細胞、および内皮細胞を排除する。組織の引張強度は、コラーゲンのような細胞外マトリックスの様々な成分を改造する線維芽細胞によって増強され、新たに形成された組織が傷ついていない皮膚2とほぼ同じくらい強く、柔軟であるようにする。
創傷閉鎖に向かうこの高度に協調した進行からの逸脱は、障害および/または慢性創傷3につながる。慢性創傷は、酸化ストレスの増加、慢性炎症、損傷した微小血管系、および創傷4における異常なコラーゲンマトリックスによって特徴付けられる。酸化ストレスは、特に創傷において、創傷閉鎖2、5を遅らせることができる。創傷治癒の第1段階において、炎症期が調節されなくなると、宿主組織は細胞傷害性酵素を放出する炎症細胞5の連続的な流入による広範な損傷を想定し、フリー酸素ラジカルの増加、無秩序な炎症メディエーターは、細胞死6、7をもたらす。
この破壊的な微小環境では、バイオフィルム形成細菌は宿主栄養素を利用し、宿主組織2の損傷に寄与する。これらのバイオフィルムは、タンパク質、DNA、RNA、および多糖類からなる水和された細胞外高分子物質が、従来の抗生物質療法に耐性を有し、回避できるため、制御および除去が困難である。ホストの生来性および適応免疫応答2、8、9。
慢性創傷の研究は、米国だけで年間650万人に影響を与え、年間400億ドルの費用がかかるため、非常に重要です。糖尿病患者は、感染の広がりを抑えるために切断を必要とする慢性創傷を発症するリスクが高まっている。これらの患者は、糖尿病11の病態生理学メカニズムに起因する切断の5年以内に50%の死亡リスクを有する。創傷治癒における宿主の免疫系とマイクロバイオームとの関係は、慢性創傷の結果が未解決の場合、切断および死亡12を含むため、進行中の研究の重要なトピックである。
ヒトにおける慢性創傷がどのように発症するかを理解するために多大な努力がなされているが、慢性創傷がどのように形成されるのか、またその理由は依然として不明である。障害のある治癒のメカニズムを研究する実験はヒトでは行うことが困難であり、創傷治癒の専門家は、すでに数週間から数ヶ月間慢性に達している慢性創傷を有する患者だけを見る。したがって、専門家は、慢性2になるために創傷を開発するために導くプロセスが間違っていたかを研究することができません。ヒトの慢性創傷の複雑さを要約する動物モデルの欠如がある。我々のモデルが開発されるまで、慢性創傷研究のためのモデルは存在しなかった。
慢性創傷モデルは、レプチン受容体(db/db-/--)13に変異を有するマウスで開発された。これらのマウスは肥満、糖尿病、治癒を損なっているが、慢性創傷14を発症しない。血糖値は平均約200 mg/dL, しかし、400 mg/dL15と高くすることができます.創傷組織中の高レベルの酸化ストレス(OS)が創傷直後に誘発されると、創傷は慢性16になる。db//-創傷は20日までに慢性と見なされ、60日以上開いたままである。細菌によって産生されるバイオフィルムは、創傷の3日後に発症するのを見ることができる。成熟したバイオフィルムは、創傷後20日後に見ることができ、どちらかの創傷閉鎖まで持続する。これらのマウスで見つかったバイオフィルム形成細菌は、ヒト糖尿病性慢性創傷にも見られる。
酸化ストレスは、抗酸化酵素、カタラゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼの2つの阻害剤、過酸化水素を分解する能力を有する2つの酵素で創傷を治療することによって誘導される。過酸化水素は活性酸素種であり、タンパク質、脂質、DNAの酸化を通じて細胞損傷を引き起こす可能性があります。カタラゼは、過酸化水素の分解を有害性の低い化学物質に触媒酸素と水にします。3-アミノ-1,2,4-トリアゾール(ATZ)は、酵素の活性中心に特異的かつ共生的に結合することによってカタラーゼを阻害し、それを不活性化する17、18、19。ATZは、カタラゼ20、21、22、23、24の阻害を通じてインビトロとインビボの両方の酸化ストレスの効果を研究するために使用されています。グルタチオンペルオキシダーゼは、抗酸化剤、グルタチオンを介した過酸化水素の還元を触媒し、酸化ストレスから細胞を保護する重要な酵素である25。メルカプトスチシン酸(MSA)は、チオールと酵素のセレノシステイン活性部位に結合することによりグルタチオンペルオキシダーゼを阻害し、それを不活性化する26。MSAは、インビトロおよびインビボにおける酸化ストレスの影響を研究するために使用されてきただけでなく、20 、27、28.
慢性創傷のこの新しいモデルは、増加したOSからの長期炎症や皮膚微生物叢からの自然なバイオフィルム形成を含む、ヒト糖尿病性慢性創傷で観察される同じ特徴の多くを共有するので、研究する強力なモデルです。創傷は、真皮表皮相互作用、異常なマトリックス沈着、血管新生の不良および血管系の損傷を損なった。慢性創傷は、男性と女性の両方のマウスで発症するので、両方の男女が慢性創傷を研究するために使用することができます。したがって、慢性創傷モデルは、そのような創傷がどのように始まるかの基本的な理解を進めるのに大きく寄与することができる。この慢性創傷モデルを使用すると、創傷治癒障害の生理学と宿主のマイクロバイオームからの寄与を通じて、慢性がどのように開始/達成されるかについての基本的な質問に対する答えを提供できる。

<table><tbody><tr><td>B6.BKS(D)-Leprdb/J&nbsp;</td><td>ジャクソン研究所&nbsp;</td><td>00697</td>ホ<td>モ接合体とヘテロ接合体が利用可能&nbsp;</td></tr><tr><td>なだめるようなアロエとラノリンを含むNair脱毛ローション</td><td>Nair</td><td></td>化学<td>脱毛剤</td></tr><tr><td>ブプレネックス(ブプレノルフィンHCl)</td>ヘ<td>ンリースタインアニマルヘルス</td><td>059122</td><td>0.3 mg / ml、クラス3</td></tr><tr><td>3-アミノ-1,2,4-トリアゾール(ATZ)TCI</td><td></td> <td>A0432</td><td></td></tr>メル<tr><td>カプトコハク酸(MSA)</td><td>アルドリッチ</td><td>88460</td><td></td></tr>リン<tr><td>酸緩衝液(PBS)</td><td></td><td></td><td>オートクレーブ滅菌</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>029405</td><td>NDC 11695-6776-2</td></tr><tr><td>酸素</td><td></td><td></td><td>タンクは気化システムと互換性がある必要があります</td></tr> イ<tr><td>ソフルラン気化器</td><td>JA Baulch &アソシエイト&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wahl バリカン</td><td>Wahl</td><td></td><td>リチウムイオン プロ</td></tr><tr><td>Acu パンチ 7mm 皮膚生検パンチ</td><td>Acuderm Inc.</td><td>P750</td><td></td></tr>テ<tr><td>ガダーム&nbsp;</td><td>3M</td><td>Ref: 1624W</td><td>透明フィルムドレッシング (6 cm x 7 cm)</td></tr> <tr><td>加熱パッド</td><td>Conair</td><td></td><td>モイスト ドライ ヒーティング パッド</td></tr><tr><td>インスリン注射器</td><td>BD</td><td>329461</td><td>0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2 インチ)</td></tr> <tr><td>70% エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鋭利な手術用ハサミ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>薄い金属ヘラ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>チューブマウス</td><td></td><td></td><td></td></tr>ノー<tr><td>ズコーン</td><td></td><td></td><td></td></tr>手<tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>袋小さな<td>プラスチック容器</td></tr></tbody></table>

糖尿病マウスの慢性創傷を作成するためのプロトコル

Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

慢性創傷は、適切な治癒に関与する1つ以上の複雑な細胞および分子プロセスにおける不完全な調節の結果として発症する。彼らは約6.5Mの人々に影響を与え、米国だけで〜$40B/年の費用がかかります。ヒトにおける慢性創傷の発症方法を理解するために多大な努力がなされているが、根本的な疑問は未解決のままである。最近では、ヒト慢性創傷の多くの特徴を持つ糖尿病性慢性創傷の新しいマウスモデルを開発した。db/--マウスを用いて、創傷直後に創傷組織に高レベルの酸化ストレス(OS)を誘導し、抗酸化酵素に特異的な阻害剤を用いた1回限りの治療を用いて、慢性創傷を生成することができる。グルタチオンペルオキシダーゼ。これらの創傷は、高レベルのOSを持ち、バイオフィルムを自然に開発し、治療後20日以内に完全に慢性になり、60日以上開いたままにすることができます。この新しいモデルは、ヒトにおける糖尿病性慢性創傷の多くの特徴を有し、したがって、創傷が慢性になる方法の基本的な理解を進めることに大きく貢献できる。これは、ヒトの慢性創傷が患者に重大な痛みや苦痛を引き起こし、未解決の場合は切断をもたらすため、大きなブレークスルーです。さらに、これらの創傷は治療に非常に高価で時間がかかり、患者の個人所得の大幅な損失につながります。私たちの慢性創傷モデルの使用を通じて研究のこの分野の進歩は、この衰弱状態の下で苦しむ何百万人もの医療を大幅に改善することができます。このプロトコルでは、急性創傷を慢性化させる手順を詳細に説明しますが、これはこれまで行われていません。

図5は、創傷閉鎖に向かって進行する阻害剤の治療を伴う創傷および慢性に向かって進行する阻害剤の治療を伴う創傷の例を示す。透明なドレッシングは、バイオフィルムと流体の蓄積が見られるように、慢性創傷に所定の位置に残されています。
慢性創傷開始は6時間未満で行われ、創傷マージンは酸化ストレスから目に見えて変化する。この創傷マージンの組織学的証拠は、組織が壊死であり、創傷治癒に関与しないことを明らかにする。創傷中のバイオフィルム形成細菌は、後でこの壊死組織を栄養素および構造成分の供給源として使用してバイオフィルムを製造することができる。慢性創傷は、最初の創傷と比較して拡大されたままの創傷であり、バイオフィルム(EPS+ヒト慢性創傷に見られる病原性細菌)を含み、予防するバイオフィルムの量と含有量に応じて治癒するのに1ヶ月または数年かかる。正常に解決する傷。慢性創傷モデルでは、阻害剤で治療されていない創傷は...

慢性創傷は、全厚の皮下創傷の後に高レベルの酸化ストレスを誘発することによって、糖尿病マウスモデルの急性創傷から発症する。創傷は、カタラゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼの阻害剤で治療され、皮膚微生物叢に存在する細菌による治癒およびバイオフィルムの発達を損なう結果生じる。

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

このマウスモデルは、創傷の慢性の医療分野における質問に答えるのに役立ちます。このモデルの主な利点は、マウスの慢性創傷がヒトの慢性創傷の多くの側面を模倣していることである。まず、きれいな表面にマウスを置き、尾のベースをつまんで所定の位置に保持します。その後、毛髪のバリカンを準備し、マウスが突然動いた場合はすぐにそれらを引き離す準備ができています。首から尾の周りを含む尾まで背中全体を剃ります。最も効率的なカットのために、髪の成長の方向に対して軽く刃を実行します。これは傷ついたり切ったりする可能性がありますので、皮膚の奥深くにバリカンを押し込みないでください。次に、脱毛ローションの塗布用に皮膚を準備する。化学的な火傷を防ぐために水浸しペーパータオルで皮膚を湿らせます。カットした髪を皮膚に濡らすのに十分な圧力で軽く押します。その後、皮膚が濡れている間に、脱毛ローションの小さな人形を剃った領域に15〜20秒間こすります。塗布後、20~45秒間、ローションを肌と反応させます。ローションを洗い流す前に、様々な場所でローションを軽く拭き取り、反応を確認します。肌がピンクで毛のない場合は、反応が完了します。次に、マウスを握って洗い流します。親指で非支配的な手を使用して、手のひらに対して尾のベースを押し下げ、他の指を閉じます。その後、マウスの鼻を上にして水から離して、水を動物の背中の上に流します。その後、すぐに、しかし穏やかに、ローションを洗い流すためにもう一方の手でマウスの後ろをこすります。脱毛クリームをすべて取り除いた後、ペーパータオルで肌を乾かします。顔の近くや耳、尾、またはどこにもローションを塗らないようにすることが重要です。このような場合は、すぐに濡れたタオルでローションを拭き取り、これらの領域への損傷を防ぐためにマウスの上に水を実行します。クリームを使用した後に暗い斑点が気づいた場合は、それらの領域にクリームを再適用します。皮膚の暗い斑点は、実験の期間中、より速く髪を成長させます。だから、必要に応じて3〜5日ごとに短い髪をクリップします。傷の部位の上にない1つまたは2つのパッチは許容されますが、マウスの背面に暗い斑点が多い場合は、慢性創傷モデルに使用しないでください。髪を取り除いた後、皮膚が脱毛ローションから敏感になりすぎるので、傷つく前に少なくとも1日は一人でマウスを入れておきなさい。手術の30分前に、無菌PBSで腹腔内に120マイクロリットルのブプレノルフィンをマウスに注入する。この手順のすべてのボリュームは、60グラムのマウスを想定しています。手術の20分前に、無菌PBSで480マイクロリットルのATZ腹腔内にマウスを注入する。腹部の両側のボリュームを分割します。ATZを投与した後、手術が始まるまで、温かい加熱パッドの上に小さなプラスチック容器にマウスを置きます。小さな容器にペーパータオルをかぶり、熱を封じ込めます。マウスは暖かくなるにつれて落ち着くはずです。麻酔状態を確認した後、傷を続ける。創傷手順を開始するには、70%エタノールでケムワイプをスプレーしてマウスの背面を拭き取り、創傷部位と皮膚表面を清掃します。過度に拭かないか、皮膚に存在する細菌を殺す危険性があります。慢性創傷モデルの成功は非無菌状態に依存する。これらのマウスは生殖を含まないものではなく、従来のビバリウムに収容されている。皮膚に存在する細菌微生物叢は、抗酸化酵素の阻害剤による治療時の慢性創傷の開始と開発に不可欠である。次に、傷の場所を考えてみましょう。理想的には、マウスの後側を中心にして皮膚の暗い斑点から離して使用します。今度は30〜45秒でドレッシング処置に傷を行う。まず、7ミリメートルの皮膚生検パンチを目的の創傷部位に軽く押し付け、パンチの印象を残すのに十分な深さの周りにパンチをねじります。その後、ピンセットでパンチの中心を引き上げ、外科用ハサミで輪郭に沿って切断することによって、輪郭の皮膚を切除します。完成したら、透明なフィルムドレッシングの半分で傷をしっかりと覆います。創傷の10分以内に、無菌PBSにMSAの60マイクロリットルのアリコートを適用し、MSAを創傷に局所的に沈着させる。その後、手術の6時間後に、ブプレノルフィンの別の行を投与する。余分な用量は、必要に応じて与えられてもよいです.慢性創傷開始は6時間以内に起こり、創傷のマージンは酸化ストレスから目に見えて変化する。慢性創傷は開いたままの創傷であり、最初の創傷と比較して拡大し、バイオフィルムを含む。20日後、創傷は完全な慢性である。創傷部位を支配するバイオフィルム形成細菌には、緑膿菌、エンテロバクター・クロアカエ、および様々なブドウ球菌およびコリネバクテリウム種が含まれる。これらの細菌は、人間の慢性創傷にも見られる。このビデオを見た後、あなたはマウスに慢性的な創傷を作成する方法をよく理解している必要があります。これらの慢性創傷を確立したら、それらを使用して、創傷の慢性の開始に関与する細胞分子メカニズムの多くを調査することができます。

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医学

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