Name: 感染マウス感染モデルにおける髄膜炎の連鎖球菌性バイオ フィルムの役割の調査のための頭蓋内クモ膜下ルート (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学ぶマウス頭蓋内クモ膜下感染法によるStreptococcus suis髄膜炎におけるバイオフィルムの役割と免疫応答への影響。このモデルは細菌性髄膜炎の病態解明と新薬評価に有用です。

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この作品は国立キー研究開発中国プログラム [2017YFD0500102]; からの補助金によって支えられました。[31572544]; 中国の国家自然科学基金[SKLVEB2016KFKT005]; 獣医病因生物学国家重点実験室上海農業技術開発プログラム、中国 [G2016060201] を適用されます。

マウス感染実験研究所動物監視委員会、江蘇省、中国が承認され、研究所動物センター南京農業大学で実行 (許可番号: SYXK (Su) 2017-0007)。
1. 細菌の準備
注:血清血清型 2 型の強毒株 P1/7 だった髄膜炎19罹患豚から分離されました。ひずみ P1/7 トッド ・ ヒューイット ブイヨンで育った (バーツ、1 リットルあたりバーツの数式: 心臓注入、3.1 g neopeptone、20.0 g ブドウ糖、2.0 g; 2.0 g、塩化ナトリウム; リン酸、0.4 g; 2.5 g、炭酸ナトリウム)、トッド ・ ヒューイットの寒天 (THA、1 リットル当たり式メッキター: 心臓注入、3.1 g;neopeptone、20.0 g;ブドウ糖、2.0 g;ナトリウム塩化物、2.0 g;リン酸、0.4 g。炭酸ナトリウム、2.5 g;寒天、15.0 g) 37 ° C および 5% の CO2。
<ol><li>コレクションのひずみ P1/7 浮遊性細胞<ol>
<li>中間ログ相培養から浮遊性細胞の 5 mL を収集 (外径600= 0.6)、8000 × g で 3 分間遠心し、PBS で 3 回を洗浄します。</li>
		<li>バーツ、5 管に分注で 25% グリセリン 5 mL の細胞を再懸濁します、-80 ° C で保存し、</li>
	</ol>
</li>
	<li>コレクションのひずみ P1/7 バイオ フィルム状態細胞<ol>
<li>一晩かけて培養 20 mL を取るし、新鮮なバーツ; 180 mL に追加希薄化後の文化を 10 ラウンド培養皿に均等に分けて 5% CO2の 37 ° C で 24 時間のインキュベーターにプレートを入れる。</li>
		<li>インキュベーション後、 プレート プレート、遵守していない細菌を再懸濁しますを軽く振るし、吸引により上澄みを廃棄します。 注: プレートを軽く振るし、土砂を再を避けるため。</li>
		<li>5 mL の PBS バイオ フィルム状態の細胞を採取し、堆積物を完全に再懸濁します新しいチューブにサンプルを転送を追加します。</li>
		<li>次のパラメーターでの最後のステップからバイオ フィルム状態の細胞を超音波照射: 60 W、4 サイクル、5 s をオフに 10 秒。</li>
		<li>8000 × g で 3 分間遠心し、-80 ° C で上清を保存 注: 清バイオ コンポーネントを格納し、感染動物実験 (ステップ 3) で説明したようの前にバイオ フィルム細菌を再懸濁しますに使用できます。</li>
		<li>バーツで 10 mL 25% グリセロールと土砂を再懸濁します、-80 ° C でバイオ フィルム状態のセルを格納</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 走査電子顕微鏡 (SEM) 分析
<ol><li>収集したバイオ フィルム状態の細胞と浮遊細胞の 4 ° C で 12-24 h の 4% パラホルムアルデヒドを使用して修正します。</li>
	<li>蒸留水を迅速にサンプルをすすぎし、脱水サンプルは順番に各ソリューション内で 30 分間のエタノール (25%、50%、70%、90% と 100%) 濃度が増加。</li>
	<li>両面テープでホルダーを金属、金とパラジウムと蒸発器のそれらを最後にコートに乾きを満たしています。</li>
	<li>次のパラメーターを使用して走査型電子顕微鏡によるサンプルを観察: EHT (余分な高張力) = 10 kV;WD (作動距離) = 7.0 または 8.0 mm;倍率 = 5000 ×;信号 A SE1 を =。</li>
</ol>3. 動物実験します。
<ol><li>SPF 6 週古いを使用して、本研究では女性の BALB/c マウス。感染症の注射部位は前から吻側に位置する 3.5 ミリメートルの頭蓋内クモ膜下ルートを通じてすべてのマウスに感染します。注射部位の定位座標は Chiavoliniら17によって明確に記述されていた。<ol>
<li>病理組織学的解析、マウス (1 グループあたり 5 マウス) の 2 つのグループに感染する状態は、3 × 107コロニー形成単位 (CFU) の用量で細胞浮遊性細胞やバイオ フィルムを使用して、コントロールとして PBS を注入した別 5 マウス。</li>
		<li>状態は TLR2 と脳内では、サイトカインの mRNA 発現の検出感染マウス (グループごと 6 マウス) の 2 つの追加グループの浮遊性細胞やバイオ フィルムを使用してまで 3 × 107 CFU の用量でセルします。</li>
		<li>ターにシリアル希薄をメッキすることによって細菌の数を決定します。</li>
		<li>さらなる研究のため感染 12 時間後にすべてのマウスを安楽死させます。 注: グリセロール ストックの中では感染前に削除する必要があります。浮遊性細胞とバイオ フィルム状態細胞-80 ° C から回復の両方 PBS で 3 回の洗浄は。浮遊性細胞を PBS で再停止され、感染の適切な投与量に希釈する、バイオ フィルム状態の細胞は (ステップ 1.2.5) からストアドの上澄みで再停止される、感染症の適切な投与量に希釈して使用。感染症のためボリュームは以上 50 μ L をしないでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>脳組織における TLR2 およびサイトカインの mRNA の発現を検出<ol>
<li>RNA 抽出キットを用いた脳組織から total RNA を抽出します。<ol>
<li>各マウスの RNA を抽出するため全脳組織を使用します。5 チューブ全脳組織に分割します。100 mg の脳組織にかかるし、キットで提供される lysing のマトリックスを含む各管に溶解溶液 1 mL を追加します。</li>
			<li>40 用ホモジナイザのチューブを処理 6.0、および、遠心管 12000 × g、4 ° C で 5 分間の設定で s。</li>
			<li>遠心分離の後新しい微量遠心チューブに上部の段階を転送します。</li>
			<li>部屋の温度で 5 分間転送のサンプルをインキュベートします。クロロホルム、10 の渦を 300 μ l 添加 s とし、室温で 5 分間インキュベートします。</li>
			<li>12000 × チューブを遠心g と 4 ° C、5 分転送新しい管への上部の段階。</li>
			<li>5 回も反転する前にチューブに冷たいエタノール 500 μ L を追加し、少なくとも 1 時間-20 ° C でサンプルを格納します。</li>
			<li>12000 × チューブを遠心g と 4 ° C、15 分および削除上清。RNase フリー H2o. で冷たい 75% エタノール 500 μ L でペレットを洗う</li>
			<li>削除エタノール、空気乾燥室内の温度、および無料の RNase H2o. の 100 μ L の RNA を再懸濁しますで 5 分のペレット</li>
			<li>室温で 5 分の RNA をインキュベートし、RNA バイオアナライザーを用いた RNA 濃度を決定します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>たちの逆のトランスクリプション (RT) 試薬キットを用いたゲノム DNA (gDNA) の除去を含む cDNA 合成を実行します。<ol>
<li>ボリュームに達する 10 μ L. 42 ° C で 2 分間インキュベートまでの 5 x gDNA の除去バッファー管含む 2 μ L、gDNA 除去酵素 RNase フリー H2O の 1 μ L に RNA の 1 μ g を追加します。</li>
			<li>マスター ミックスの 10 μ L を追加 (RT 酵素の 1 μ L ミックス, RT プライマー ミックスの 1 μ L, 5 バッファー 2 倍の 4 μ L と RNase フリー H2O の 4 μ L) 最後から反応液にステップし、優しく混ぜます。RT の反作用をすぐに続行: 37 ° C 15 分してから 85 ° C、5 s。</li>
			<li>SYBR Rt-qpcr キット リアルタイム PCR 装置を用いた定量的リアルタイム PCR (RT qPCR) の解析を実行します。20 μ L の総ボリュームまで 10 μ L の酵素 x 2、前方のプライマー、逆プライマーの 0.8 μ L、ロックス参照色素 II x 50 0.4 μ、cDNA テンプレートと無料の RNase H2O 2 μ L の 0.8 μ L を追加します。</li>
			<li>3 通次熱パラメーターを使用して各サンプルを実行: 30 94 ° c、s に続いて 5 の 40 のサイクル 95 ° c、s、34 60 ° C、15 の最終段階で s 95 ° C、60 ° C で 1 分で s、15 95 ° C で sRT qPCR 用プライマーは、表 1に示します。ハウスキーピング遺伝子B2mと18 s rRNA内部統制として使われていた。</li>
		</ol>
</li>
		<li>2-ΔΔCt法に基づく相対フォールドの変更を計算します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
組織切片の観察
	<ol>
<li>24 h 10% ホルマリンで固定後 2 〜 3 mm でティッシュ部分の適切なサイズに固定脳組織を再構築します。</li>
		<li>埋め込みカセットで組織のピースを置くし、自動真空脱水機で脱水の新しい定着性の溶液に浸します。</li>
		<li>固定ティッシュを取り出して、順番に各ソリューションの 30 分 (70%、80%、95%、95%、100%) エタノール濃度の増加で脱水します。</li>
		<li>15 分のキシレンのサンプルを transparentize、90 分の 60 ° C で液体パラフィンに浸し、埋め込む埋め込みのマシンを使用します。</li>
		<li>パラフィン埋め込まれたブロック組織を 3 μ m のスライスにカット、45 ° c の水にスライスをタイルし、空気で乾かします。</li>
		<li>60 ° C で 3 時間セクションを孵化させなさい、ヘマトキシリンとエオシン (HE) を使用して、メソッドを染色、中立的なガムとシールします。</li>
		<li>脳の病理組織学的変化を光学顕微鏡で観察します。4 ポイントの格付けシステムは、組織学的変化を評価するために使用されました。統計分析のため、対になっていないt検定を使用します。 渋滞/出血:欠席、スコア 0;焦点距離渋滞/出血の小さな領域スコア 1;焦点渋滞/出血の大面積または焦点渋滞/出血の小さい区域の複数のサイトのスコア 2;3 つの大きな焦点渋滞/出血サイトまでスコア 3;渋滞/出血を拡散、4 のスコアします。 壊死:欠席、スコア 0;壊死、スコア 1;1-10 壊死細胞を拡散、スコア 2;合流の壊死巣スコア 3;合流壊死 4 を獲得します。 炎症性細胞浸潤:欠席、スコア 0;数と焦点浸潤、得点 1。多発性浸潤または凝集体の形成を伴う浸潤スコア 2;最大 3 つの集計スコア 3;4 つ以上の集計、スコア 4。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis%3A+a+new+emerging+or+an+old+neglected+zoonotic+pathogen%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen?</a> Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).</li>
<li>Goyette-Desjardins, G., Auger, J. P., Xu, J., Segura, M., Gottschalk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis%2C+an+important+pig+pathogen+and+emerging+zoonotic+agent-an+update+on+the+worldwide+distribution+based+on+serotyping+and+sequence+typing%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing.</a> Emerging Microbes & Infections. 3 (6), e45(2014).</li>
<li>Kerdsin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+Streptococcus+suis+serotype+9+infection+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Immunology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Emergence of Streptococcus suis serotype 9 infection in humans.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 50 (4), 545-546 (2017).</li>
<li>Hatrongjit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+human+case+report+of+sepsis+due+to+infection+with+Streptococcus+suis+serotype+31+in+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect+Diseases%22%5BJournal%5D)">First human case report of sepsis due to infection with Streptococcus suis serotype 31 in Thailand.</a> BMC Infect Diseases. 15, 392(2015).</li>
<li>Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D., Gottschalk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+factors+involved+in+the+pathogenesis+of+the+infection+caused+by+the+swine+pathogen+and+zoonotic+agent+Streptococcus+suis%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis.</a> Future Microbiology. 7 (2), 259-279 (2012).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+DNA%3A+a+major+proinflammatory+component+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Extracellular DNA: a major proinflammatory component of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Immunology. 184 (11), 6386-6395 (2010).</li>
<li>Isiaku, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+is+associated+with+chronic+streptococcal+meningoencephalitis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Biofilm is associated with chronic streptococcal meningoencephalitis in fish.</a> Microbial Pathogenesis. 102, 59-68 (2017).</li>
<li>Oggioni, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switch+from+planktonic+to+sessile+life%3A+a+major+event+in+pneumococcal+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Switch from planktonic to sessile life: a major event in pneumococcal pathogenesis.</a> Molecular Microbiology. 61 (5), 1196-1210 (2006).</li>
<li>Xiao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis+small+RNA+rss04+contributes+to+the+induction+of+meningitis+by+regulating+capsule+synthesis+and+by+inducing+biofilm+formation+in+a+mouse+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model.</a> Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).</li>
<li>Dominguez-Punaro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis+serotype+2%2C+an+important+swine+and+human+pathogen%2C+induces+strong+systemic+and+cerebral+inflammatory+responses+in+a+mouse+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).</li>
<li>Seitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+intranasal+mouse+model+for+mucosal+colonization+by+Streptococcus+suis+serotype+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel intranasal mouse model for mucosal colonization by Streptococcus suis serotype 2.</a> Journal of Medical Microbiology. 61 (Pt 9), 1311-1318 (2012).</li>
<li>Busque, P., Higgins, R., Caya, F., Quessy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+of+pigs+against+Streptococcus+suis+serotype+2+infection+using+a+live+avirulent+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Immunization of pigs against Streptococcus suis serotype 2 infection using a live avirulent strain.</a> Canadian Journal of Veterinary Research. 61 (4), 275-279 (1997).</li>
<li>Williams, A. E., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+Streptococcal+meningitis+following+intravenous+intracisternal+and+natural+routes+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Pathology of Streptococcal meningitis following intravenous intracisternal and natural routes of infection.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (4), 345-356 (1990).</li>
<li>Dominguez-Punaro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+cochlear+inflammation+and+vestibular+syndrome+in+an+experimental+model+of+Streptococcus+suis+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Severe cochlear inflammation and vestibular syndrome in an experimental model of Streptococcus suis infection in mice.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (9), 2391-2400 (2012).</li>
<li>Auger, J. P., Fittipaldi, N., Benoit-Biancamano, M. O., Segura, M., Gottschalk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+Studies+of+Different+Sequence+Types+and+Geographical+Origins+of+Streptococcus+suis+Serotype+2+in+a+Mouse+Model+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Virulence Studies of Different Sequence Types and Geographical Origins of Streptococcus suis Serotype 2 in a Mouse Model of Infection.</a> Pathogens. 5 (3), (2016).</li>
<li>Chiavolini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+inducing+experimental+pneumococcal+meningitis+in+outbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice.</a> BMC Microbiology. 4, 36(2004).</li>
<li>Madsen, L. W., Svensmark, B., Elvestad, K., Jensen, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otitis+interna+is+a+frequent+sequela+to+Streptococcus+suis+meningitis+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Otitis interna is a frequent sequela to Streptococcus suis meningitis in pigs.</a> Veterinary Pathology. 38 (2), 190-195 (2001).</li>
<li>Holden, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+virulence+and+drug+resistance+in+the+emerging+zoonotic+pathogen+Streptococcus+suis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of virulence and drug resistance in the emerging zoonotic pathogen Streptococcus suis.</a> PLoS One. 4 (7), e6072(2009).</li>
<li>Dominguez-Punaro Mde, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+the+microglial+inflammatory+response+to+Streptococcus+suis%2C+an+important+emerging+zoonotic+agent+of+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of the microglial inflammatory response to Streptococcus suis, an important emerging zoonotic agent of meningitis.</a> Infection and Immunity. 78 (12), 5074-5085 (2010).</li>
<li>Hassan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+different+detection+methods+of+biofilm+formation+in+the+clinical+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates.</a> Brazilian Journal of Infectious Diseases. 15 (4), 305-311 (2011).</li>
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<li>Takeuchi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+suilysin+to+the+pathogenesis+of+Streptococcus+suis+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">The contribution of suilysin to the pathogenesis of Streptococcus suis meningitis.</a> Journal of Infectious Diseases. 209 (10), 1509-1519 (2014).</li>
<li>Tenenbaum, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+bacterial+invasion+and+translocation+of+Streptococcus+suis+across+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro.</a> Cellular Microbiology. 11 (2), 323-336 (2009).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで説明した感染症の頭蓋内クモ膜下ルート感染の他のルートに比べて明らかな利点があります。ホスト細菌相互作用や中枢神経に細菌の入口を模倣、直接脳内の宿主の免疫応答におよぼす細菌成分を研究する研究者をことができます。したがって、感染症のこのルートは他の細菌によって引き起こされる髄膜炎のメカニズムを調査するため拡張できます。さらに、細菌性髄膜炎の治療薬の有効性をテストも使用することができます。
このモデルを使用して良い結果を得るために次の重要な手順が明確であります。バイオ フィルム形成は、実験条件下で検査する必要があります。現在の研究では、走査型電子顕微鏡を用いたそれを調べた。組織培養プレート法、チューブ法21など、バイオ フィルム形成を調べる他の方法を使用もできます。感染、前日浮遊性細胞とバイオ フィルム状態細胞の両方の因数 CFU を決定する-80 ° C から解凍する必要があります。次の日、細菌は感染 CFU によると適切な投与量を希釈する必要があります。モック感染の群に含まれる PBS ニーズとモック感染制御グループからマウスに注...

レンサ球菌性(血清) は、髄膜炎、肺炎、敗血症、心内膜炎、関節炎1を含む深刻な病気を引き起こし豚、世界中の主要な細菌の病原体です。また、新興人獣共通感染エージェントです。これまでのところ、9 つの血清型が 2、4、5、9、14、16、21、24、および 31 は血清型2,3、4を含む人間の感染症を引き起こすことができますが報告されています。人間と豚、髄膜炎はs ・性感染症の主な臨床症状であります。ベトナムやタイの血清は大人5で髄膜炎の主要な原因です。微生物バイオ フィルムは、微生物を互いに遵守し、インターフェイスに集中しています。彼らは細菌の病原性、多様な環境および抗生物質耐性5の生存に不可欠です。バイオ フィルムは、一般的に多糖類、蛋白質および DNA の6を含む細胞外マトリックスによって通常囲まれています。後者は、宿主の炎症性反応とサイトカイン生産7を引き出すことができます。バイオ フィルム形成は、先行研究のレンサ球菌性髄膜炎に関与する報告されています。ティラピア魚モデルにおけるシアリルラクトサミン連鎖球菌髄膜炎に貢献するバイオ フィルムとバイオ フィルム形成脳組織内で明らかにされているし体内から腹腔内接種8表面の硬膜のまわり。中に髄膜炎、肺炎連鎖球菌は、バイオ フィルムのような状態と細菌バイオ フィルムのような状態でマウス感染モデル9で髄膜炎を誘発するのに効果的であった。さらに、私たちの以前の研究は、生存分析10細菌の病原性に貢献するバイオ フィルム状態がマウス脳における血清に関連付けられています。ただし、血清性髄膜炎におけるバイオ フィルム関与の直接的な証拠はさらに調査が必要です。
S ・性感染症の動物モデルをマウス腹腔11、鼻腔内 (i.n と)12、静脈13、および感染症14,の大槽内ステロイド (i.c.) ルートを使用して開発されています。15,16します。 ただし、i. p.、i.n と、静脈感染経路、直接脳内性髄膜炎における血清表面部品の役割を勉強に適しています。バイオ フィルムからの細胞外マトリックスが含まれます。I.c. 接種は感染症血清使用、正確な注射部位はないこれらの論文で記載されています。対照的に、頭蓋内クモ膜下接種の注射部位の定位座標は以前研究17で明確に記載されています。これは接種のポイントとより多くの単純な実験的プロトコルの簡単な認識を許可しました。さらに、感染症の頭蓋内クモ膜下ルートは、副鼻腔や中耳の17中間耳および血清によって引き起こされる髄膜炎の関係から中枢神経系に細菌の入り口を模倣します。マドセンら18によって実証されています。また、感染マウスの脳クモ膜下ルートを適用すると、我々 は血清小さな RNA rss04 が私たちの以前の研究10で髄膜炎に寄与することを実証しました。
本研究で、感染症の頭蓋内クモ膜下ルートは血清性髄膜炎におけるバイオ フィルムの役割を調査するためマウスで使用されました。マウスは、この感染経路による浮遊性細胞や血清のバイオ フィルム状態の細胞に感染していた。病理組織学的解析と TLR2 とバイオ フィルム状態の細胞を注入したマウスの脳組織からのサイトカインの mRNA 発現の増加、血清バイオ フィルムが髄膜炎に貢献することに明示します。

<table><tbody><tr><td>トッドヒューイットブロス(THB)</td><td>ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー</td><td>DF0492078</td>粉末<td>30gを1Lの精製水に溶かします。121°のオートクレーブ。15分間</td></tr><tr><td>寒天</td><td>DSBIO</td><td>16C0050</td><td>粉末 15 g を THB 1 L に溶解します。121°のオートクレーブ。15分間</td></tr><tr><td>Milli-Q Reference Water Purification System</td><td>Merck KGaA</td><td>Z00QSVCUS</td><td>Without Dnase/ Rnase</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019318</td> 1 <td>L の精製水に 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.42 g Na2HPO3、0.27 g KH2PO4 を溶解します。121°のオートクレーブ。15分間KOHを使用してpHを7.4に調整します。</td></tr><tr><td>Na2HPO3</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009012-01-09</td> 8 <td>g NaCl、0.2 g KCl、1.42 g Na2HPO3、0.27 g KH2PO4 を 1 L の精製水に溶解します。121°のオートクレーブ。15分間KOHを使用してpHを7.4に調整します。</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009017-01-09</td> 8 <td>g NaCl、0.2 g KCl、1.42 g Na2HPO3、0.27 g KH2PO4 を 1 L の精製水に溶解します。121°のオートクレーブ。15分間KOHを使用してpHを7.4に調整します。</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009019-01-09</td> 8 <td>g NaCl、0.2 g KCl、1.42 g Na2HPO3、0.27 g KH2PO4 を 1 L の精製水に溶解します。121°のオートクレーブ。15分間KOHを使用してpHを7.4に調整します。</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009014-01-09</td> 8 <td>g NaCl、0.2 g KCl、1.42 g Na2HPO3、0.27 g KH2PO4 を 1 L の精製水に溶解します。121°のオートクレーブ。15分間KOHを使用してpHを7.4に調整します。</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sionpharm化学試薬Co.、株式会社</td><td>10010618</td><td>精製水の等容積で希釈し、121°Cでオートクレーブ;15分間</td></tr><tr><td>4%パラホルムアルデヒド</td><td>Sionpharm化学試薬Co.、Ltd</td><td>80096675</td><td></td></tr><tr><td>25%グルタルアルデヒド</td><td>Sionpharm化学試薬Co.、Ltd</td><td>30092436</td><td>10倍に希釈して固定します。</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sionpharm化学試薬Co.、株式会社</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Sionpharm化学試薬Co.、株式会社</td><td>10006818</td><td></td></tr><tr><td>Spctrophotometre</td><td>DeNovix Inc.</td><td>DS-11+</td><td></td></tr><tr><td>超音波セルクラッシャー</td><td>寧波サイエンツバイオテクノロジー株式会社</td><td>JY96-IIN</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>日立工機株式会社</td><td>CT15RE</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵庫</td>オーク<td>マ株式会社</td><td>DW-86L500</td><td></td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>EVO-LS10</td><td></td></tr><tr><td>FastRNA Pro グリーンキット</td><td>MP Biomedicals</td><td>#6045-050</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep-24 装置</td><td>MP Biomedicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>PCR 用装置</td><td>SensoQuest GmbH</td><td>1124310110</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>4485689</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq II</td><td>Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd</td><td>RR820A</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT 試薬キット gDNA Eraser</td> <td>付きTakara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd</td><td>RR047A</td><td></td></tr><tr><td>完全密閉型組織処理装置</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>ASP200S</td><td></td></tr><tr><td>加熱パラフィン包埋モジュール</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>EG1150H</td><td></td></tr><tr><td>半自動回転式ミクロトーム</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>パラフィン切片用ウォーターバス</td><td>ライカBiosystems Nussloch GmbH</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Autostainer XL</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>ST5010</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939A</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr></tbody></table>

感染マウス感染モデルにおける髄膜炎の連鎖球菌性バイオ フィルムの役割の調査のための頭蓋内クモ膜下ルート

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

連鎖球菌性は、豚の世界の主要な細菌の病原体だけでなく、新興の人獣共通感染エージェントです。人間と豚は、髄膜炎がs ・性感染症の主な症状です。適切な感染症モデルは、病原体によって引き起こされる病気のメカニズムを理解するために不可欠なツールです。感染マウスのいくつかのルートは、 s ・性感染症の病因を研究して開発されています。ただし、感染症、鼻腔内、腹腔内、静脈内のルートは、バイオ フィルムから細胞外のマトリックスのような頭脳に直接性髄膜炎における血清表面部材における役割を研究するため適していません。S ・性感染症の大槽内ステロイド接種が使用されているが正確な注射部位が記載されていません。ここでは、感染症の頭蓋内クモ膜下ルートは、血清性髄膜炎におけるバイオ フィルムの役割を調査するためマウス モデルで記述されていた。血清浮遊性細胞やバイオ フィルム状態細胞直接 3.5 mm 前から吻側に位置する注射部位を介してマウスのくも膜下腔に注入されました。病理組織学的解析とバイオ フィルム状態の細胞を注入したマウス脳組織のサイトカインと TLR2 の mRNA 発現の増加、血清バイオ フィルムが血清髄膜炎に決定的な役割を果たしていることに明示します。この感染経路がホスト細菌の相互作用の研究をできるように、感染症の他のルートに比べて明らかな利点です。さらに、それはできます、評価される脳で直接ホスト免疫反応におよぼす細菌成分と中枢神経に細菌の入口を模倣します。この感染経路は、他の細菌によって引き起こされる髄膜炎のメカニズムを調査するために拡張できます。さらに、細菌性髄膜炎の治療薬の有効性をテストも使用することができます。

実験条件下でのバイオ フィルム形成を検討する SEM 分析を行った。図 1のように、浮遊性細胞 (図 1A) とバイオ フィルム状態 (図 1B) のバイオ フィルム形成に重要な違いがあります。SEM 分析はバイオ フィルム形成細菌の塊、浮遊性バクテリアが大いにより少なく密で主に分散した個別に、複数のレイヤーとそれら細胞外マトリックスに包まれたことを示した。
バイオ、DNA などの細胞外マトリックスのコンポーネントは、宿主の炎症性反応、サイトカイン産生を誘発することができます。TLR2 とサイトカイン CCL2、以来、il-6, TNF-α は脳炎症反応前研究10</sup...

ここでは、連鎖球菌性髄膜炎でのバイオ フィルムの役割を研究するマウスにおける感染症の頭蓋内クモ膜下ルートをについて説明します。この感染モデルもその他の細菌性髄膜炎の病態と細菌性髄膜炎の新しい治療薬の有効性を研究するために最適です。

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major ...

この方法は、バイオフィルムからの細胞外マトリックスなど、多くの部位における連鎖球菌の成分の役割に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、免疫が脳内で直接応答し、細菌が中枢神経系に侵入する方法に影響を与える細菌成分の調査を可能にすることです。その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるMr. Shouming Zhangです。P1/7株プランクトン細胞を採取するには、まず中期培養液から5ミリリットルの細胞を採取します。細胞をPBSで3回洗浄する前に、Gの8000倍で3分間遠心分離します。THB中の25%グリセロール5ミリリットルで細胞を再懸濁し、5本のチューブに分注します。あるいは、P1/7バイオフィルム状態の細胞株を採取するには、20ミリリットルの一晩培養を行い、180ミリリットルの新鮮なTHBを添加します。希釈した培養物を10枚の丸い培養プレートに均等に分け、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素に24時間インキュベートします。インキュベーション後、プレートを静かに振って、プレートに付着していない細菌を再懸濁し、沈殿物が再懸濁しないようにします。その後、吸引によって上清を捨てます。5ミリリットルのPBSを添加して、バイオフィルム状態の細胞を回収します。沈殿物を完全に再懸濁してから、サンプルを新しいチューブに移します。テキストプロトコルに記載されているように、再懸濁したバイオフィルム状態の細胞を超音波処理します。次に、超音波処理した細胞をGの8000倍で3分間遠心分離し、上清をマイナス80°Cで保存します。上清にはバイオフィルム成分が含まれている可能性があり、感染前にバイオフィルム細菌を再懸濁するために使用できます。10ミリリットルのTHB中の25%グリセロールで沈殿物を再懸濁してから、テキストプロトコルに記載されているように走査型電子顕微鏡でサンプルを観察します。プランクトン細胞またはバイオフィルム状態細胞を使用してすべてのマウスに感染させ、テキストプロトコルに記載されているように安楽死を行います。次に、RNA抽出キットを使用して脳組織から全RNAを抽出します。各マウスについて、全脳組織を使用してRNAを抽出します。全脳組織を5本のチューブに分けます。最大100ミリグラムの脳組織を採取し、キットが提供する溶解マトリックスを含む各チューブに1ミリリットルの溶解液を加えます。テキストプロトコルに記載されている手順に従ってRNAを抽出します。次に、逆転写試薬キットを備えたサーモサイクラーを使用して、ゲノムDNAの除去を含むCDMA合成を行います。2マイクロリットルの5XゲノムDNA除去バッファーと1マイクロリットルのジェネノミクスDNA除去酵素が入ったチューブに1マイクログラムのRNAを加えます。容量が10マイクロリットルに達するまで、

intracranial-subarachnoidal-route-infection-for-investigating-roles

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Zhang, S. ほかマウス感染モデルにおける髄膜炎における 連鎖球菌 スイスバイオフィルムの役割を調査するための頭蓋内くも膜下感染経路。 J. Vis. Exp.

細菌感染マウス脳における標的遺伝子発現の検出

出典: Lenhard, A. ほか。 ウイルス共感染による肺炎連鎖 球 菌の感染者から病原体への移行をマウスモデルで示すものは、加齢による悪化疾患を再現しています。 J. Vis. Exp. (2022年)この動画は、インフルエンザウイルスが 肺炎球菌...

ウイルス共感染後の 肺炎連鎖球菌 の病原性移行を研究するためのマウスモデル

このビデオでは、髄膜炎感染を生成するためのマウスモデルへの髄膜炎の腸内送達を実演します。...

髄膜炎菌性髄膜炎を誘発するためのマウスモデルへの髄膜炎菌の槽内送達

髄膜炎菌は、血管に感染するヒト特異的病原体である。このプロトコルでは、ヒト微小血管は、免疫不全マウスにヒト皮膚を移植することによってマウスに導入される。細菌は、典型的には、ヒトの場合に観察紫斑発疹の血管損傷と発展につながる、人間の血管に広く付着する。...

微小血管系を対象に細菌感染を研究するためのヒト化マウスモデル

動物モデルは、慢性炎症の発展に貢献宿主および病原体特異的なメカニズムを定義する上で非常に貴重なツールであることが分かっている。ここでは、ローカルおよび全身の部位での炎症の進行を評価するために、ヒト病原体ポルフィロモナス·ジンジバリスとディテールの方法論で経口感染のマウスモデルを記述する。...

局所および全身所における病原体により誘導される慢性炎症のためのマウスモデル

ここでは、手順は、 大腸菌 K1の培養新生児ラットにおける全身性感染の確立のために記載されている。この非侵襲的手順は、脈絡叢での胃腸管のコロニー形成、全身循環への病原体の転座、および中枢神経系への侵入を可能にする。...

神経病原の非侵襲的モデルエシェリヒア·コリ新生ラットにおける感染

の可視化<em&gt;肺炎球菌</em&gt;心臓Microlesionsとその後の心臓リモデリングの中

ここでは、成体マウスにおける感染の内因性経路を介して髄膜炎球菌性髄膜炎を誘発する方法について説明する。我々は、接種の調製から内人種差別感染までの髄膜炎球菌感染のステッププロトコルによるステップを提示する。その後、動物の生存を記録し、マウス組織の細菌負荷を評価します。...

インティリカレルナルデリバリーによるマウスにおける髄膜炎球炎血清群Cの誘導

この論文では、ウイルス感染中の無症候性コロニーから病気の原因となる病原体への肺炎球菌の移行に関する新しいマウスモデルについて説明します。このモデルは、疾患進行のさまざまな段階およびさまざまな宿主にわたる多微生物および宿主-病原体の相互作用を研究するために容易に適応できます。...

肺炎 連鎖 球菌のウイルス重感染によるコロニー形成者から病原体への移行に関するマウスモデルが加齢増悪疾患を再現

本プロトコルは、インプラント関連感染症を調査するために皮下背部移植を使用するマウスモデルを記述し、病態生理学的メカニズムの包括的な調査を可能にし、標的治療戦略による診断基準の開発をサポートします。...

マウスにおけるインプラント関連感染症の動物モデル

マウス敗血症誘発免疫抑制モデルの確立

学ぶマウス頭蓋内クモ膜下感染法によるStreptococcus suis髄膜炎におけるバイオフィルムの役割と免疫応答への影響。このモデルは細菌性髄膜炎の病態解明と新薬評価に有用です。

感染マウス感染モデルにおける髄膜炎の連鎖球菌性バイオフィルムの役割の調査のための頭蓋内クモ膜下ルート

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