印刷された糖鎖の配列: 小動物対策炭水化物抗体のレパートリーの分析のための高感度な技術
February 14th, 2019
この作品は、小動物の反炭水化物抗体の解析のための印刷された糖鎖アレイ (PGA) 技術の可能性を示しています。
このプロトコルの全体的な目標は、印刷されたグリカンアレイベースの技術を用いて、小動物の血清中の循環抗グリカン抗体のプロファイルを研究することです。このアプローチは、早期診断と、グリカン構造に対する抗体が重要な役割を果たすいくつかの病理学的条件における適切な治療に可能性を有する。この技術を用いた主な利点は、最小量のサンプルを用いて非常に高感度の数百のグリカンターゲットを同じ実験設定で測定する可能性である。
マイクロアレイを準備するには、非接触ロボットアレイを使用します。50ミリモルグリカンと1ミリリットル多糖10マイクログラムの6つの複製と300ミリモルPBS、pH 8.5をn-ヒドロキシ6シナミック誘導体化ガラススライドに印刷します。各スライドには、6回繰り返される4つの異なるサブ配列ブロックが含まれています。
すべての単一のサブ配列は、コントロールを含む112の異なるグリカンスポットによって形成される。スライドを室温の湿気箱に1時間インキュベートします。マイクロアレイをブロックするには、室温でブロッキングバッファーを使用してスライドを1時間半インキュベートします。
その後、グリコールチップを超純水で洗い、空気で乾燥させます。テキスト プロトコルで説明されているように、バッファー 1 からバッファー 4 までを準備します。グリコールチップとサンプルを準備するには、スライドを付けて保管ボックスをテーブルの上に置き、室温に達します。
箱を開け、グリコールチップをインキュベーションチャンバーに移し、すでに湿式フィルターペーパーで調整して、室内の湿度を一定に保ちます。一方、1.5ミリリットルチューブに1つの緩衝液でマウス血清を希釈する。渦ミキサーで血清溶液を5秒間均質化します。
均質化後、免疫グロブリン凝集を避けるために、希釈した血清を水浴中で摂氏37度で10分間インキュベートします。その後、チューブを10,000倍Gと摂氏25度で3分間遠心分離します。上清を収集し、任意の沈殿物を捨てます。
グリコールチップをインキュベーションチャンバーに慎重に置きます。1ミリリットルのバッファー3でそれをインキュベートして、グリコールチップの表面上の残留材料を排除します。摂氏25度で15分間。
グリコールチップを垂直位置に保持し、プラスチック製のパスツールピペットを使用してバッファ3の滴で再洗浄します。次に、フィルターペーパーを用いてグリコールチップ表面から緩衝液を慎重に除去する。グリコールチップをインキュベーションチャンバーに戻します。
マイクロピペットを使用して、希釈した血清サンプルをグリコールチップ表面に広げます。グリコールチップ表面の乾燥した部分がピペットの先端を使用して希釈された血清サンプルで覆われていることを確認します。摂氏37度で1時間半の軌道攪拌でインキュベートする。
インキュベーションに続いて、余分なサンプルを取り除き、25°Cのバッファ3に5分間グリコールチップを浸します。グリコールチップをバッファー4の容器に渡し、最後にグリコールチップを超純水で洗浄します。グリコールチップを175倍Gで1分間、摂氏25度で遠心分離して液体を取り除きます。
グリコールチップをインキュベーションチャンバーに戻した後、グリコールチップ表面上にヤギ抗マウスコンジュゲートの溶液をビオチンに広げる。摂氏37度で1時間の軌道攪拌でインキュベートする。非結合分数を削除し、洗浄手順を繰り返します。
遠心分離後、グリコライクチップを摂氏25度で45分間、フルオロクロム標識ストレプトアビジン溶液のミリリットル当たり2マイクログラムで45分間インキュベートします。暗闇の中で非結合分を除去し、洗浄工程を繰り返した後、グリコールチップを空気で乾燥させます。アレイをスキャンするには、グリコールチップを暗い温度に達するまでテーブルの上に置いておきます。
同時に、スライドスキャナーとレーザーをオンにします。マイクロアレイを保持し、グリコールチップをスロットにスライドさせて背面に触れます。EasyScanを実行してグリコールチップをスキャンし、tifファイルとしてスキャンを保存します。
ScanArray 解析システムを使用して配列を定量化します。メイン ウィンドウの構成とファイル グループのファイルをクリックして、以前にスキャンしたイメージを開きます。ガラススライド上の印刷されたグリカンの性質を表すGAL形式で対応する配列ファイルテンプレートをロードします。
配列を画像内のスポットに慎重に合わせて調整し、定量を開始して、GAL テンプレートを調整します。定量タイプが簡単に定量化および定量方法固定円として定量化の周長を選択します。自動検索スポットのすべてのオプションをオフにし、正規化方法の安値を選択します。
定量化されたデータを csv ファイルとして保存します。Microsoft Excel または別の適切なアプリケーションを使用して、このデータを共通のスプレッドシート ファイルに転送します。遺伝的に同一のマウスは、天然の抗炭水化物抗体の異なるパターンを開発しているので、免疫学的同等物と考えるべきではありません。
ここに示すように、12個のグリカン特異性のみが保存された。ここに示す、フローレススキャナを用いたマイクロチップスキャンから得られる画像の代表的な例である。グリッドは、すべての単一のサブ配列のスポットに揃えられます。
フロレスはスポットごとに検出され、結果は共通のスプレッドシートファイルに転送されます。マウス血清によるインキュベーションに続いて、糖チップをスキャンアレイリーダーを用いてスキャンした。マイクロアレイ解析システムでデータを解析し、結果は中央値プラスから中央値の絶対偏差を引いたものとしてRFUで表した。
青と白の色は4000 RFUより低いの背景色の結合信号を表す。赤色は、4000 RFU以上の正の結合信号を表します。グリコールチップに露出したグリカン構造のほとんどは、balp Cマウスの循環抗グリカン抗体のレパートリーによって認識されなかった。
このテクニックを習得したら、5時間45分で実行すれば、適切に実行できます。このビデオを見た後、あなたはレパートリーと血清サンプル中の循環抗炭水化物抗体のレベルを調査するためにプリンタグリコールアレイ技術を使用する方法をよく理解している必要があります。この手順を試みる際には、グリコチップはメガネライトの底部で操作する必要があることを覚えておくことが重要です。
バーコードが配置されている場所。印刷されたグリカンとの接触を避けるように。また、グリコチップの乾燥領域はすべて、ピペットの先端を使用して希釈された血清サンプルで覆われていることを確認してください。
グリコチップの単一の表面を完全に覆うために必要な体積はおよそ1ミリリットルです。この手順に従って、マイクロスフィアベースサスペンションアレイのような他の方法は、抗グリカン抗体プロファイルの柔軟な多重検出に関連する追加の質問に答えるために行うことができます。導入後、この技術は、バイオマカラ分子と免疫学の分野の研究者が小動物のセット中の非タンパク質グリコール相互作用を探求する道を開いた。
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概要
この研究は、印刷されたグリカンアレイ（PGA）技術が小動物の循環性抗糖鎖抗体分析に持つ可能性を示しています。この手法により、最小限のサンプル量で複数のグリカン標的の高感度測定が可能になります。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 免疫学
- バイオテクノロジー
背景
- 循環する抗グリカン抗体は様々な病理学的状態で重要な役割を果たしています。
- これらの抗体を理解することで、早期診断と適切な治療が可能になります。
- 印刷されたグリカンアレイ技術により、多数のグリカン構造の同時分析が可能になります。
- この方法は特に小動物モデルで有用です。
研究の目的
- 小動物の循環する抗グリカン抗体のプロファイルを分析すること。
- グリカン抗体に関連する状態を診断するPGA技術の可能性を探ること。
- 研究環境でこの方法の感度と効率を実証すること。
使用された方法
- マイクロアレイ調製のための非接触型ロボティックアレーヤーの利用。
- ガラススライドにグリカンと多糖類の6回の複製を印刷。
- アッセイ中の最適条件のためのPBSバッファーの使用。
- 印刷されたグリカンアレイを用いた抗体応答の分析。
主な結果
- グリカン標的抗体測定の高感度を実証。
- 数百のグリカン標的を同時に分析する能力を示しました。
- 小動物血清の抗体プロファイルに関する洞察を提供。
- 免疫学研究におけるPGA技術の利点を強調。
結論
- PGA技術は抗グリカン抗体を研究するための有望なツールです。
- この方法はグリカン構造に関連する疾患の早期診断を支援できます。
- さらなる研究により様々な生物医学分野での応用が拡大する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Printed glycan array (PGA) technology enables high-sensitivity profiling of circulating anti-carbohydrate antibodies from minimal serum volumes, addressing a critical constraint in small animal model studies. This capability supports early biomarker discovery and mechanistic de-risking in immunology and infectious disease research by linking glycan-specific antibody repertoires to pathological conditions. The method enhances predictive confidence in target validation by providing quantitative, reproducible readouts of humoral immune responses against diverse glycan structures.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping natural anti-glycan antibody repertoires in genetically identical models, revealing individual immunological variation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through high-sensitivity detection of hundreds of glycan targets using minimal sample input, conserving precious preclinical specimens.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying conserved and variable glycan specificities that may correlate with disease susceptibility or resistance.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, reproducible fluorescent signals (RFU) normalized via Lowess method, enabling reliable comparison across samples and experimental conditions.
- Scalability: Each slide contains four blocks of subarrays with six replicates, allowing high-throughput screening of glycan-specific antibody binding patterns.
- Workflow Integration: Outputs quantified data in CSV format compatible with spreadsheet analysis, streamlining downstream data handling in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Links circulating anti-glycan antibody profiles to immunological status, offering a potential biomarker pathway for early detection of pathological conditions in small animal models.
- Translational Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by correlating glycan antibody repertoires with disease onset and progression, as noted in the study’s implications for human disease modeling.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in immune mechanism studies by providing direct, glycan-specific antibody binding data rather than inferring function from protein-centric assays.
Pipeline & Workflow Integration
PGA technology fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis generation in immunology before lead identification, with outputs informing preclinical validation through biomarker-aligned immune profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing individual-specific anti-glycan antibody patterns in isogenic models, highlighting limitations of assuming immunological equivalence.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slide preparation, blocking, and incubation steps that ensure consistent glycan presentation and antibody detection.
- Analytics: Generates quantitative RFU measurements with median absolute deviation, enabling statistical comparison of antibody binding across glycan targets and samples.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by identifying glycan biomarkers that may reflect disease state, supporting extrapolation to human immunology studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for immunoprofiling, where validated glycan panels can be applied across multiple disease models and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in humoral immune responses to carbohydrates.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through replicate printing, normalized quantification, and defined signal thresholds (e.g., 4000 RFU for positive binding).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of immunological biomarkers, reducing late-stage failure risk due to unanticipated immune mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying glycan-specific antibody signatures that may indicate differential disease progression or treatment response.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microarray handling, fluorescence detection, and data normalization using tools like ScanArray and EasyQuant.
- Depends on non-contact robotic arrayers, fluorescence scanners, and buffer preparation infrastructure for glycan printing and assay execution.
- Necessitates cross-team standardization of sample dilution, incubation conditions, and washing protocols to minimize variability in antibody binding readings.
- Involves adaptation considerations when extending to different species or sample types, particularly regarding serum dilution factors and blocking efficiency.
- Includes practical limitations such as the need to avoid contact with printed glycan spots during handling and ensuring complete surface coverage of samples during incubation.
