Name: サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: 学ぶin vitroキナーゼアッセイを用いてCdk1特異的リン酸化サイトを同定する方法。精製タンパク質を使用し、細胞周期制御のメカニズム解明とがん研究への応用が可能です。

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博士デビッド王、ハワード ヒューズ医学研究所、カリフォルニア大学バークレーは、質量分析および有用なコメントを感謝いたします。Xuelian 朱先生、上海、研究所生物科学、中国科学院、フルレングス CENP F 構造を提供するため、中国上海に感謝いたします。最後に、博士スーザンの命とり、博士ブライアン キャラハン博士クリストフ Grewer アット ビンガムトン ユニバーシティは、機器へのアクセスを感謝いたします。この研究は、ニューヨーク州立大学、ニューヨーク州立大学ビンガムトン校化学科研究財団によって賄われていた。

著者が明らかに何もありません。

私たちの in vitroのキナーゼ試金は、細胞周期のマスター コント ローラーであり多くの重要な細胞プロセスを調整するキナーゼ Cdk1 のための分子ターゲットを識別するために非常に強力な方法です。浄化された蛋白質が Cdk1 の基板は、でき特定のリン酸化部位の同定であるかどうか、方法が決まります。Cdk1 による燐酸化によってこれを容易に解明の細胞プロセスの規則のため。
質量分析法によるリン酸化のサイトの成功の識別のための最も重要な要因は、キナーゼ試金のリン酸化効率です。個々 のサイトのリン酸化効率化する必要があります、できるだけ高くできれば 100%。これは Cdk1/サイクリン B の量を増やすと 16 時間インキュベーション時間を増やすことによって達成することができます。Cdk1/サイクリン B の量を計算する必要なとき、蛋白質のリン酸化サイトを考慮すべき数モル濃度。これは複数のリン酸化サイトにターゲット蛋白質に存在する場合に特に重要です。商業 Cdk1/サイクリン B の活動が、バッチを変わることができるし、キナーゼは活動を急速に失うことができますは、...

キナーゼは、ATP からのリン酸基を基板に転送し、多くの細胞プロセスを調整する酵素です。このリン酸化は可逆的で、高速、2 つの負電荷を追加しますと自由エネルギーを格納、セルで使用される最も一般的な修飾の一つです。Cdk1 はまたとして知られている細胞分裂周期蛋白質 2 相同物 (cdc2) マスター コント ローラーではすべて真核生物1,2,3,4、5、細胞周期では、廃止、プロテオーム6、7の推定 8 ~ 13%。
一方、最近のプロテオミクス研究は、タンパク質においてはほとんどの場合、多くのリン酸化サイトを識別したキナーゼのこれらの変更のための責任は不明です。ヒトの細胞、特に、知られている Cdk1 ターゲット数は低7です。Cdk1 が細胞周期を制御する方法を確立する解明が可能、Cdk1 固有のリン酸化部位の同定が重要です。細胞周期制御は忠実な染色体分配と細胞分裂のために重要、無数の細胞プロセスのこの重要な生理機能をサポートするために行う必要があります。これは転写や細胞構造と核膜、染色体凝縮と紡錘アセンブリの分解など、組織における劇的な再編と同様に有糸分裂、発症する前に翻訳を停止含まれています。規制緩和とこれらのプロセスでのエラーは、がん、先天異常、または有糸分裂細胞死を引き起こします。RO 3306 など Cdk1 の特異的阻害剤が開発8、機能研究の強力なツールを提供してこれらの阻害物質は、現在がん治療の臨床試験 (レビューの9を参照してください)。
ここでは、Cdk1 固有のリン酸化部位の同定を可能にする生体外でキナーゼ分析について述べる。このアッセイ市販人間 Cdk1/サイクリン B を使用して体外に精製されたターゲットのタンパク質をリン酸化します。基質のリン酸化その質量を増加され、2 つの負電荷;したがって、成功したリン酸化を SDS-PAGE の蛋白質ゲルのバンドの上方シフトを確認しました。Cdk1 固有のリン酸化サイトその後試験管内でリン酸化蛋白質の質量分析によって識別されます。実験計画を支援するためには、また計算のツールおよび蛋白質シーケンスから Cdk1 固有のリン酸化部位の予測を参照を確認します。さらに、高純度、均一なタンパク質製剤キナーゼのアッセイに最適をもたらすの浄化のプロトコルについても述べる。最後に、特定のリン酸化のサイトの機能の研究によって検証が必要、単純な結合の試金はその目的のためここに記載されています。組み合わせることで、これは Cdk1 のリン酸化サイトを生成して Cdk1 が細胞周期7,10,11を制御する方法に解明をしたりできるように非常に強力なアプローチです。このメソッドは、浄化された蛋白質に依存しているので、モデル有機体および利回り信頼性の高い結果に適用できます。得られるリン酸化サイト、体外の機能検証を推奨するただし、細胞局在や相互作用パートナー翻訳後修飾など、場所に追加的な規制メカニズムを持っていることアクセス可能または Cdk1 による認識のリン酸化サイトをレンダリング可能性があります。
Cdk1 は成っている (Ser/スレオニン-プロ-X-Lys/アルゼンチン)、X は任意の残基、セリンまたはトレオニンのリン酸化のサイトは、コンセンサスのリン酸化部位を認識しています。+1 の位置にプロリンの存在は認識のために特に重要です。また、塩基性残基、+2 や +3 位置に適して、+3 で Lys または Arg を含むほとんどの Cdk1 のリン酸化サイトを6,12の位置します。
Cdk1 活性化が堅く調整され、有糸分裂1,2,3,4、5の発症に 。サイクリン依存性キナーゼの活動は一般に振動する細胞周期13全体レベルで個別のサイクリン (サイクリン A、B、C、D、および E の人間) との関連付けに依存します。Cdk1 式細胞周期で一定であるし、サイクリン A ととして B5,13,14,15をサイクリン調節サブユニットとの関連付けに依存してその活動の規制同様のポスト翻訳の修正。Cdk1/サイクリン B の複合体の形成は、キナーゼ活性化5,14,15,16,17,18に必要です。G2 段階でサイクリン B は細胞質で翻訳され Cdk15,14,15,16,17,18; に結合核にインポートただし、Cdk1/サイクリン B は Myt1 人間 Cdk1 抑制キナーゼによって残基 Thr14 と Tyr15 のリン酸化 (膜準チロシン、スレオニン-固有抑制 cdc2 キナーゼ) と Wee1、それぞれ19、によって不活化保持されます。 20,21。遅い G2 段階で細胞分裂サイクル 25 ホスファターゼ (cdc25) による Thr14 と Tyr15 の脱燐酸化が Cdk1/サイクリン B の複合体のキナーゼ活動をアクティブにし、有糸分裂12,14,の開始をトリガー18,20,22,23. Thr161 リン酸化 Cdk1/サイクリン B の活性化にも必要ですし、Cdk 活性化キナーゼ (CAK)18Cdk7 によって媒介されます。後期ではサイクリン B の分解は、有糸分裂24,25からの出口を許可する Cdk1 を不活性化します。Cdk1/サイクリン B の活性化は、複雑なプロセスである従って。ここで提示されたプロトコルが市販 Cdk1/サイクリン B で実行されます。昆虫細胞で、この複合体の組み換え式の中にそれは活性生体内で内因性キナーゼ14,20清められた状態でアクティブなままになります。結果、組換え人間 Cdk1/サイクリン B キナーゼ試金体外に適しています。
ここでは、ひと動原体タンパク質 F (CENP F)10の Cdk1 固有のリン酸化部位の同定のためのプロトコルについて述べる。CENP F (G1、S 期) 中間期のほとんどの間、核に存在すると Cdk1 依存方法10, G2 の相26,27,28に細胞質にエクスポートは、動原体タンパク質である11. 核局在化二部 cNLS26によって授与されます。cNLSs は、karyopherin β と RanGDP、cNLS 貨物の核29へのインポートを容易にする核輸送因子 karyopherin α によって認識されます。G2 段階で核の輸出は、不明な輸出経路10を介して促進されます。CENP F は、細胞質に存在する、それが核封筒に募集、順番モーター蛋白質ダイニンの複雑な30,31を募集します。この経路は、有糸分裂開始のタイミングが正しいと脳で根本的なプロセスのために重要であるダイニン依存方法で紡錘アセンブリの最初の段階の間に中心体にそれぞれの核を配置することが重要開発30,31,32。G2 段階で開始、CENP F も完成、動原体に忠実な染色体分離27,28,33,34,35 に重要な役割をしています。.これらの経路の重要な規制ステップは Cdk110,11に依存している G2 段階で CENP F の核輸出です。CENP F の cNLS で Cdk1 固有のリン酸化部位の同定のためのプロトコルをご紹介します。これらのサイトの Phosphomimetic 突然変異は Cdk1/サイクリン B は、直接、cNLS10のリン酸化による CENP F の局在を調節することを示唆している CENP-F の核輸入に遅くなります。
全体的にみて、キナーゼ Cdk1。 精製された標的タンパク質リン酸化は体外市販 Cdk1/サイクリン B 複合体とリン酸化のサイトでこの体外のキナーゼ試金の特定の基板の識別を可能します。その後、質量分析によって識別されます。Cdk1 固有のリン酸化部位の同定は、Cdk1 が細胞周期を制御する方法を明らかにする機構の研究をサポートしています。

<table><tbody><tr><td>2800 mLの困惑したFernbachのフラスコ</td><td>のコーニング</td><td>44232XL</td><td></td></tr><tr><td>のアンピシリン</td><td>の金の</td><td>バイオテクノロジーA-301-25</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>のフィッシャーの科学者</td><td>BP413-25</td><td></td></tr><tr><td>ベンザミジンの塩酸塩ミリ</td><td>ポアのシグマ</td><td>B6506-25</td><td></td></tr><tr><td>のボトルトップ</td><td>フィルターCorning</td><td>の431161</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin Bの組換え体、ヒト 20,000 U/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B (代替供給源)</td><td>EMD Millipore</td><td>14-450</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B (代替供給源)</td><td>Invitrogen</td><td>PV3292</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>CENP-F (残基 2987 &ndash; 3065) pGEX6P1 プラスミド</td><td>ご要望に応じてご利用いただけます。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機:ヘレウスマルチフュージX3R、冷却、TX-1000スイングアウトローター付き</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr><tr><td>遠心フィルターユニット:Amicon Ultra-15遠心フィルターユニット、3 kDaカットオフ、Ultracel-PLメンブレン</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>chlorampenicol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-105-100</td><td></td></tr><tr><td>D/L メチオニン</td><td>Agros Organics / Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>125650010脱塩ピペットチップ: ジップチップ</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZTC18S008</td><td></td></tr><tr><td>ディスポーザブルクロマトグラフィーカラム、Econo-Pac 1.5 x 12 cm</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain</td><td>EMD Millipore</td><td>71403</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロスプレーイオン化フーリエ変換イオン</td><td>ブルカー Amazon</td><td>Apex III</td><td></td></tr><tr><td>サイクロトロン共鳴質量分析計</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エレクトロスプレーイオン化イオントラップ質量分析計</td><td>ブルカー アマゾン</td><td>カスタム</td><td></td></tr><tr><td>固定角ローター:Fiberlite F15-8x-50cy</td><td>Thermo Scientific</td><td>97040-276</td><td></td></tr><tr><td>FPLCシステム:&Auml;kta Pure FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>29032697</td><td></td></tr><tr><td>Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>glutathione agarose</td><td>Pierce</td><td>16101</td><td></td></tr><tr><td>glutathione, reduced</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>incubation shaker: multitron shaker</td><td></td><td>Infors I10102</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル &beta;-D-1-チオガラクトピラノシド</td><td>ゴールドバイオテクノロジー</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>ゴールドバイオテクノロジー</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>カリオフェリン & α; pet-28a pres プラスミド</td><td>ご要望に応じてご利用いただけます。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani medium</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心分離機 5418R、冷蔵</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ (0.5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ (1.5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>ニッケルアフィニティーゲル: His-Select ニッケルアフィニティーゲル</td><td>Millipore Sigma</td><td>P6611-100ml</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-6P-1 プラスミド</td><td>ミリポアシグマ</td><td>GE28-9546-48</td><td></td></tr><tr><td>フェニルメチルスルホニルフッ化物</td><td>ゴールドバイオテクノロジー</td><td>P470-10</td><td></td></tr><tr><td>PS プロテアーゼ PreScission プロテアーゼ</td><td>GE ヘルスケア</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>ホスタグアクリルアミド</td><td>和光ピュアケム Ind.</td><td>304-93521</td><td></td></tr><tr><td>還元型グルタチオン</td><td>ミリポア シグマ</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>丸底遠心分離管 (オークリッジ管)</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>055291D</td><td></td></tr><tr><td>サイト指向型突然変異誘発キット: QuikChange ライトニング</td><td>アジレント</td><td>210518</td><td></td></tr><tr><td>サイト指向型変異誘発キット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソニファイア: ブランソン S-250D ソニファイア</td><td>Branson</td><td>15 338 125</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1RC 透析メンブレン (6-8 kDa カットオフ)</td><td>Spectrum Labs</td><td>08 670B</td><td></td></tr><tr><td>スイングアウトローター TX-1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr></tbody></table>

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

サイクリン依存性キナーゼ 1 (Cdk1) は、すべての真核生物の細胞周期のマスター コント ローラー; プロテオームの推定 8 ~ 13% を廃止ただし、ひと細胞で特に Cdk1 の特定のターゲットの数はまだ低いです。Cdk1 固有のリン酸化部位の同定は、機械論的洞察 Cdk1 が細胞周期を制御する方法を提供するように重要です。細胞周期制御は忠実な染色体分配に重要なこの複雑なプロセスの欠陥染色体異常やがんに 。
ここでは、Cdk1 のリン酸化サイトを識別するために使用される生体外でキナーゼ分析について述べる。このアッセイで浄化された蛋白質リン酸化培養では, SDS-PAGE による市販人間 Cdk1/サイクリン b. 成功によってリン酸化を確認し、質量分析法によるリン酸化のサイトの識別後。プローブ間の相互作用特定のリン酸化のサイトの機能の検証のキナーゼ試金および結合の試金の適切な高純度、均一なタンパク質製剤をもたらす浄化のプロトコルについても述べる古典的な核局在化信号 (cNLS) とその核輸送受容体 karyopherin α。実験計画を支援するためには、タンパク質から Cdk1 固有のリン酸化部位の予測のためのアプローチを確認します。一緒にこれらのプロトコルは Cdk1 のリン酸化サイトを生成でき、Cdk1 が細胞周期を制御する方法を解明する非常に強力なアプローチを提示します。このメソッドは浄化された蛋白質、細胞機能の研究と組み合わせる場合は特に任意モデル有機体そして利回り信頼性の高い結果に適用できます。

最近 cNLS10に含まれている CENP F フラグメントの Cdk1 のリン酸化サイトを識別するために、体外のキナーゼ試金 (図 1) を使いました。この信号は、中間期のほとんどの間に CENP F の核局在化を与えます。G2 段階で CENP F が Cdk1 依存的に細胞質、核からエクスポートされます。Cdk1 が CENP F の局在を制御する方法の力学的洞察を得るためには、Igp サーバー36,37を使用して CENP-F Cdk1 のリン酸化サイトを予測するためのシーケンスを分析しました。残留 3,042, 3045、CENP F の cNLS、内予測された 3 Cdk1 固有のリン酸化サイトと 3,048 (表 1)。別 Cdk1 固有のリン酸化サイトも、残渣 3,007 (<str...

サイクリン依存性キナーゼ 1 (Cdk1) 細胞周期 G2 段階で活性化し、多くの細胞経路を調節します。この重要なキナーゼの細胞内標的を確立するため Cdk1 固有のリン酸化部位の同定を可能にする Cdk1 と体外キナーゼ試金のためのプロトコルを紹介します。

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

このin vitroキナーゼアッセイの全体的な目標は、キナーゼサイクリン依存性キナーゼ1に特異的な目的タンパク質のリン酸化部位を同定することです。CDK1特異的なリン酸化部位の同定は、CDK1が細胞周期をどのように制御するかについてのメカニズム的な洞察を提供するため、重要です。細胞周期の調節は、染色体相の完全分配に不可欠であり、欠損は染色体異常やがんにつながります。この技術の主な利点は、精製されたタンパク質に依存しているため、あらゆるモデル生物に適用でき、特に細胞の機能研究と組み合わせた場合に信頼性の高い結果が得られることです。CDK1はプロテウムの推定8〜13%をリン酸化するという事実にもかかわらず、既知のCDK1ターゲットの数はまだ少ないため、この方法は重要です。この方法ではCDK1特異的なリン酸化部位を同定できますが、精製されたキナーゼが利用可能であれば、他のキナーゼのリン酸化部位を同定するように変更することができます。一般に、この分析法を初めて使用する個人は、高いリン酸化効率を得るためには、キナーゼアッセイの条件を各タンパク質ターゲットに対して最適化する必要があるため、苦労するでしょう。できれば100%IGPS 3.0ソフトウェアを使用し、Webサーバーにアクセスして、CENP-F標的タンパク質配列のCDK1特異的リン酸化部位を予測します。CDK1コンセンサス配列に対するリン酸化部位を確認します。タンパク質の発現を開始するには、予備培養液を調製します。製造元の指示に従って、1マイクロリットルの発現プラスミドを50マイクロリットルの大腸菌コンピテントセルに変換します。プラスミドを添加した後、細胞を氷上で30分間インキュベートします。次に、細胞を摂氏42度で45秒間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を氷上に1分間置き、細胞に400マイクロリットルのLBを加え、振とうしながら37°Cで1時間培養物をインキュベートします。次に、LB寒天プレート上に培養物の200マイクロリットルをプレートし、コンストラクトに応じて目的の抗生物質を補充します。次に、プレートを摂氏37度で12〜20時間振とうせずにインキュベートします。次に、LB寒天プレートからコロニーを選び、目的の抗生物質の組み合わせを補充した50ミリリットルのLB培地でコロニーに接種します。37°Cで培養物をインキュベートし、毎分160〜180回転で12〜20時間振とうします。LB媒体の各リットルについて、抗生物質と無菌ろ過グルコース溶液の体積比40%重量の10ミリリットルを追加します。この培地に、密に成長した前培養物の20ミリリットルを追加します。次に、毎分160〜180回転で振とうしながら、37°Cで培養物をインキュベートします。600ナノメートルでの培養物の吸光度を定期的に確認してください。吸光度が0.5〜0.6に達したら、0.2ミリモルのIPTGを添加してタンパク質発現を誘導します。次に、振とうしながら37°Cで培養物を3時間インキュベートします。3時間後、スイングアウトローターを使用して、4°CでGの100倍を15分間遠心分離することにより、細胞を回収します。遠心分離後、上清を排出します。細胞ペレットをCENP-F用の20ミリリットルのGST結合緩衝液と彼の6つのカリオフリンα用結合緩衝液に各培養リットルに再懸濁します。次に、セルを摂氏マイナス80度で保存します。CENP-Fを精製するには、まずCENP-Fコンストラクトで細胞を解凍します。次に、GST結合バッファーを使用して容量を20ミリリットルに調整します。容量を調整したら、すべての還元剤とプロテアーゼ阻害剤を次々と添加して、その後の溶解のために細胞懸濁液を調製します。次に、細胞懸濁液をガラスビーカーに移し、ビーカーを氷水浴に浸します。次に、培養物を超音波処理します。超音波処理後、250マイクロモルのPMSFをライセートに加え、次にライセートを検査します。次に、ライセートを12, 000〜40, 000倍Gで25分間摂氏4度で遠心分離します。次に、2ミリリットルのグルタチオンアガロースを1対1のスラリーを使い捨てクロマトグラフィーカラムに添加して、カラムを調製します。カラムを平衡化するには、まず 25 ミリリットルの超純水で洗浄し、次に 25 ミリリットルの GST 結合バッファーで洗浄します。遠心分離が終了したら、上清をデカントし、0.2マイクロメートルの注ぎサイズで上清をろ過します。次に、結合ステップのために、プラグを差し込んだカラムにライセートを注ぎます。カラムにキャップをし、4°Cで30分間インキュベートしながら、穏やかにナットを動かし、泡立ちを防ぎます。30分後、カラムをラックに移し、樹脂を沈殿させます。次に、流れを回収し、25 ミリリットルの GST 結合バッファーでカラムを 2 回洗浄します。洗浄が完了したら、再度カラムを差し込みます。次に、400マイクロリットルのGST結合バッファーと250マイクロリットルのPSプロテアーゼストックをカラムに加え、1ミリグラムあたり1000ユニットの活性を示します。再度カラムにキャップをし、カラムを穏やかに渦巻かせてレジンをバッファーに再懸濁し、カラムを摂氏4度で16〜20時間インキュベートします。インキュベーション期間が終了したら、4ミリリットルのGST結合バッファーを添加して、タンパク質分解的に切断されたカラムからCENP-Fフラグメントを溶出します。次に、GSTタグを溶出するために、カラムを再度差し込みます。次に、グルタチオンを含む4ミリリットルのGST溶出バッファーをカラムに加えます。次に、カラムを10分間インキュベートして、結合したGSTタグを溶出します。10分後、溶出液を回収します。次に、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、PSプロテアーゼおよびグルタチオン溶出画分を分析します。次に、タンパク質サンプルを濃縮するために、PSプロテアーゼ溶出液を分子量3キロトンの遠心フィルターユニットの上部コンパートメントにピペットで移します。次に、溶出液をGの4倍、100倍、10分刻みで、スイングアウトローターで摂氏4度、摂氏4度で遠心分離し、サンプルを濃縮します。各増分の後、濃度勾配の形成を避けるために、ゆっくりとピペッティングで上下に動かして、濃縮フィルターでタンパク質サンプルを混合します。CENP-Fをゲルろ過で精製するには、ゲルろ過カラムを高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステムに接続します。次に、カラム容量1容量のゲルろ過バッファーでカラムを平衡化します。次に、CENP-Fフラグメントを微量遠心チューブ内の21、700倍Gで摂氏4度で20分間遠心分離します。遠心分離が終了したら、サンプルをカラムに注入し、次にゲルろ過バッファーでカラムを溶出し、CENP-Fフラグメントの0.6ミリリットルの画分を収集します。次に、ゲルろ過プロファイルを分析し、ピークフラクションのSDS-PAGEを実行します。純粋なCENP-Fを含むプール画分。次に、精製したCENP-Fフラグメントを3.3ミリグラム/ミリリットルに濃縮します。タンパク質濃度を測定するには、CENP-Fフラグメントを超純水で1対100の比率で希釈します。次に、分光光度計で220〜300ナノメートルの波長のスペクトルを記録します。次に、精製したCENP-Fの50マイクロリットルのアリコートを0.5ミリリットルのマイクロチューブに調製し、チューブを液体窒素で瞬間凍結してマイナス80°Cで保存します。キナーゼアッセイでは、CENP-FフラグメントをATPおよびCDK1サイクリンBと他のバッファーとともに0.5ミリリットルのマイクロチューブに混合します。次に、ネガティブコントロールとしてCDK1サイクリンBを含まない2番目のサンプルを調製します。次に、サンプルを摂氏30度の水浴で1〜16時間インキュベートします。質量分析法によるリン酸化部位の同定を成功させるためには、リン酸化効率ができるだけ高く、好ましくは100%であることが重要であり、リン酸化効率を高めるためには、より多くのキナーゼを追加し、インキュベーション時間を16時間に増やします。次に、同量の6モルの塩酸グアニジン溶液を残りのキナーゼアッセイ反応とネガティブコントロールに加え、質量分析を行ってリン酸化部位を同定します。高品質の質量分析データを得るためには、精製されたタンパク質サンプルの純度が高く均質であることも重要です。最初にSDS-PAGE分析を行い、CDK1を使用しないネガティブコントロールと比較して、リン酸化CENP-Fのゲル上のバンドが明確に上方にシフトしていることを示し、CENP-FのcNLSがCDK1基質であることを示しています。次に、CENP-Fリン酸化部位の数と効率を分析するために、質量分析が行われます。インタクトな in vitro リン酸化 CENP-F の ESI イオントラップ質量スペクトルは、4 つのリン酸化部位を示す 5 つのピークがあり、5 番目のピークが非リン酸化タンパク質であることを示しています。次に、このサイズ排除溶出プロファイルは、野生型CENP-Fを添加すると、カリオフェリンαピークの溶出量がより高い質量にシフトすることを示していますが、これはCENP-F変異体を添加すると観察されません。これは、CENP-Fのリン酸化模倣型S3048DがCENP-F cNLSとカリオフフェリンαとの相互作用を弱めることを示しています。最後に行われたSDS-PAGE解析では、無傷のcNLSを持つ野生型CENP-Fフラグメントがカリオフェリンαと共溶出し、強い相互作用を示していることが示されています。しかし、CENP-FのS3048D変異体とkaryopherin alphaは別々のピークで溶出します。この手順を試行する際には、得られたリン酸化部位をCDK1のコンセンサスリン酸化配列と照らし合わせて確認し、同定された基質がCDK1と同じ細胞コンパートメントに局在することを確認することを忘れないでください。この手順に従って、同定されたリン酸化部位が生理学的機能を有することを確認するために、細胞または動物モデルで機能検証を行う必要があります。機能検証には、特異的なCDK1阻害剤やリン酸化模倣変異など、多くのツールが利用可能です。プロテウムには多数のCDK1基質が存在するため、多くのヒトCDK1基質が発見されておらず、in vitroキナーゼアッセイは、これらの部位を同定、マッピング、検証するための重要なツールとなるでしょう。これらのリン酸化部位を同定することで、CDK1が細胞周期をどのように制御するかのメカニズム研究が可能になります。このビデオを見れば、in vitroキナーゼアッセイによってCDK1特異的リン酸化部位と標的タンパク質を同定する方法を十分に理解できるはずです。

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Biochemistry

生物化学

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プロテインキナーゼは高度に進化したシグナリング酵素であり、細胞間および細胞内シグナル伝達にとって重要な足場である。本発明者らは、細胞シグナル伝達調節の解明を助ける信頼できる方法である放射性標識アデノシン三リン酸（[γ- 32 P] ATP）の使用によるキナーゼ活性を測定するためのプロトコールを提示する。...

放射性標識ATPによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ

ペプチド競合アッセイは、種々の分子および免疫学的実験において広く使用されている。本稿では、in vitroオリゴペプチド競合キナーゼアッセイの詳細な方法と、特定のリン酸化部位を見出すのに有用な関連する検証手順について説明します。...

リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

キャピラリー等電集中はタンパク質と非常に小さい試料からアイソ フォームの詳細な特性解析を有効に、抗体を用いた、超高感度、高スループット手法です。次に、自動化・ ロボット化の方法で特定の蛋白質とアイソ...

タンパク質キャピラリー等電点焦点法によるアイソ フォームの高感度・定量的検出

このプロトコルの目的は、ラベル、豊かにする、および特定蛋白質キナーゼ CK2 細胞ライセートや組織ホモジネートなど複雑な生物的サンプルからの基板です。このメソッドは、この目的のため CK2...

多彩な生化学的アプローチを用いた新規 CK2 キナーゼ基板の識別

我々は、堅牢な生化学的アプローチを用いた新しいキナーゼタンパク質を特徴付けた:異なる細胞株および組織上の専用の特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析、共免疫沈殿実験による相互作用、西洋で検出されたキナーゼ活性ホスホ特異的抗体およびγ[32P]ATP標識を用いたブロット。...

新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析

本プロトコルは、ニューロンK-Cl共輸送体KCC2の機能と活性を研究するためのウェスタンブロッティング技術の適用を強調しています。このプロトコルは、ウェスタンブロッティング による...

ウェスタンブロッティングを用いたニューロンK-Cl共輸送体KCC2の機能と活性の研究

学ぶin vitroキナーゼアッセイを用いてCdk1特異的リン酸化サイトを同定する方法。精製タンパク質を使用し、細胞周期制御のメカニズム解明とがん研究への応用が可能です。

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

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