サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。
2018年5月3日
サイクリン依存性キナーゼ 1 (Cdk1) 細胞周期 G2 段階で活性化し、多くの細胞経路を調節します。この重要なキナーゼの細胞内標的を確立するため Cdk1 固有のリン酸化部位の同定を可能にする Cdk1 と体外キナーゼ試金のためのプロトコルを紹介します。
このin vitroキナーゼアッセイの全体的な目標は、キナーゼサイクリン依存性キナーゼ1に特異的な目的タンパク質のリン酸化部位を同定することです。CDK1特異的なリン酸化部位の同定は、CDK1が細胞周期をどのように制御するかについてのメカニズム的な洞察を提供するため、重要です。細胞周期の調節は、染色体相の完全分配に不可欠であり、欠損は染色体異常やがんにつながります。
この技術の主な利点は、精製されたタンパク質に依存しているため、あらゆるモデル生物に適用でき、特に細胞の機能研究と組み合わせた場合に信頼性の高い結果が得られることです。CDK1はプロテウムの推定8〜13%をリン酸化するという事実にもかかわらず、既知のCDK1ターゲットの数はまだ少ないため、この方法は重要です。この方法ではCDK1特異的なリン酸化部位を同定できますが、精製されたキナーゼが利用可能であれば、他のキナーゼのリン酸化部位を同定するように変更することができます。
一般に、この分析法を初めて使用する個人は、高いリン酸化効率を得るためには、キナーゼアッセイの条件を各タンパク質ターゲットに対して最適化する必要があるため、苦労するでしょう。できれば100%IGPS 3.0ソフトウェアを使用し、Webサーバーにアクセスして、CENP-F標的タンパク質配列のCDK1特異的リン酸化部位を予測します。CDK1コンセンサス配列に対するリン酸化部位を確認します。
タンパク質の発現を開始するには、予備培養液を調製します。製造元の指示に従って、1マイクロリットルの発現プラスミドを50マイクロリットルの大腸菌コンピテントセルに変換します。プラスミドを添加した後、細胞を氷上で30分間インキュベートします。
次に、細胞を摂氏42度で45秒間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を氷上に1分間置き、細胞に400マイクロリットルのLBを加え、振とうしながら37°Cで1時間培養物をインキュベートします。次に、LB寒天プレート上に培養物の200マイクロリットルをプレートし、コンストラクトに応じて目的の抗生物質を補充します。
次に、プレートを摂氏37度で12〜20時間振とうせずにインキュベートします。次に、LB寒天プレートからコロニーを選び、目的の抗生物質の組み合わせを補充した50ミリリットルのLB培地でコロニーに接種します。37°Cで培養物をインキュベートし、毎分160〜180回転で12〜20時間振とうします。
LB媒体の各リットルについて、抗生物質と無菌ろ過グルコース溶液の体積比40%重量の10ミリリットルを追加します。この培地に、密に成長した前培養物の20ミリリットルを追加します。次に、毎分160〜180回転で振とうしながら、37°Cで培養物をインキュベートします。
600ナノメートルでの培養物の吸光度を定期的に確認してください。吸光度が0.5〜0.6に達したら、0.2ミリモルのIPTGを添加してタンパク質発現を誘導します。次に、振とうしながら37°Cで培養物を3時間インキュベートします。
3時間後、スイングアウトローターを使用して、4°CでGの100倍を15分間遠心分離することにより、細胞を回収します。遠心分離後、上清を排出します。細胞ペレットをCENP-F用の20ミリリットルのGST結合緩衝液と彼の6つのカリオフリンα用結合緩衝液に各培養リットルに再懸濁します。
次に、セルを摂氏マイナス80度で保存します。CENP-Fを精製するには、まずCENP-Fコンストラクトで細胞を解凍します。次に、GST結合バッファーを使用して容量を20ミリリットルに調整します。
容量を調整したら、すべての還元剤とプロテアーゼ阻害剤を次々と添加して、その後の溶解のために細胞懸濁液を調製します。次に、細胞懸濁液をガラスビーカーに移し、ビーカーを氷水浴に浸します。次に、培養物を超音波処理します。
超音波処理後、250マイクロモルのPMSFをライセートに加え、次にライセートを検査します。次に、ライセートを12, 000〜40, 000倍Gで25分間摂氏4度で遠心分離します。次に、2ミリリットルのグルタチオンアガロースを1対1のスラリーを使い捨てクロマトグラフィーカラムに添加して、カラムを調製します。
カラムを平衡化するには、まず 25 ミリリットルの超純水で洗浄し、次に 25 ミリリットルの GST 結合バッファーで洗浄します。遠心分離が終了したら、上清をデカントし、0.2マイクロメートルの注ぎサイズで上清をろ過します。次に、結合ステップのために、プラグを差し込んだカラムにライセートを注ぎます。
カラムにキャップをし、4°Cで30分間インキュベートしながら、穏やかにナットを動かし、泡立ちを防ぎます。30分後、カラムをラックに移し、樹脂を沈殿させます。次に、流れを回収し、25 ミリリットルの GST 結合バッファーでカラムを 2 回洗浄します。
洗浄が完了したら、再度カラムを差し込みます。次に、400マイクロリットルのGST結合バッファーと250マイクロリットルのPSプロテアーゼストックをカラムに加え、1ミリグラムあたり1000ユニットの活性を示します。再度カラムにキャップをし、カラムを穏やかに渦巻かせてレジンをバッファーに再懸濁し、カラムを摂氏4度で16〜20時間インキュベートします。
インキュベーション期間が終了したら、4ミリリットルのGST結合バッファーを添加して、タンパク質分解的に切断されたカラムからCENP-Fフラグメントを溶出します。次に、GSTタグを溶出するために、カラムを再度差し込みます。次に、グルタチオンを含む4ミリリットルのGST溶出バッファーをカラムに加えます。
次に、カラムを10分間インキュベートして、結合したGSTタグを溶出します。10分後、溶出液を回収します。次に、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、PSプロテアーゼおよびグルタチオン溶出画分を分析します。
次に、タンパク質サンプルを濃縮するために、PSプロテアーゼ溶出液を分子量3キロトンの遠心フィルターユニットの上部コンパートメントにピペットで移します。次に、溶出液をGの4倍、100倍、10分刻みで、スイングアウトローターで摂氏4度、摂氏4度で遠心分離し、サンプルを濃縮します。各増分の後、濃度勾配の形成を避けるために、ゆっくりとピペッティングで上下に動かして、濃縮フィルターでタンパク質サンプルを混合します。
CENP-Fをゲルろ過で精製するには、ゲルろ過カラムを高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステムに接続します。次に、カラム容量1容量のゲルろ過バッファーでカラムを平衡化します。次に、CENP-Fフラグメントを微量遠心チューブ内の21、700倍Gで摂氏4度で20分間遠心分離します。
遠心分離が終了したら、サンプルをカラムに注入し、次にゲルろ過バッファーでカラムを溶出し、CENP-Fフラグメントの0.6ミリリットルの画分を収集します。次に、ゲルろ過プロファイルを分析し、ピークフラクションのSDS-PAGEを実行します。純粋なCENP-Fを含むプール画分。
次に、精製したCENP-Fフラグメントを3.3ミリグラム/ミリリットルに濃縮します。タンパク質濃度を測定するには、CENP-Fフラグメントを超純水で1対100の比率で希釈します。次に、分光光度計で220〜300ナノメートルの波長のスペクトルを記録します。
次に、精製したCENP-Fの50マイクロリットルのアリコートを0.5ミリリットルのマイクロチューブに調製し、チューブを液体窒素で瞬間凍結してマイナス80°Cで保存します。キナーゼアッセイでは、CENP-FフラグメントをATPおよびCDK1サイクリンBと他のバッファーとともに0.5ミリリットルのマイクロチューブに混合します。次に、ネガティブコントロールとしてCDK1サイクリンBを含まない2番目のサンプルを調製します。
次に、サンプルを摂氏30度の水浴で1〜16時間インキュベートします。質量分析法によるリン酸化部位の同定を成功させるためには、リン酸化効率ができるだけ高く、好ましくは100%であることが重要であり、リン酸化効率を高めるためには、より多くのキナーゼを追加し、インキュベーション時間を16時間に増やします。次に、同量の6モルの塩酸グアニジン溶液を残りのキナーゼアッセイ反応とネガティブコントロールに加え、質量分析を行ってリン酸化部位を同定します。
高品質の質量分析データを得るためには、精製されたタンパク質サンプルの純度が高く均質であることも重要です。最初にSDS-PAGE分析を行い、CDK1を使用しないネガティブコントロールと比較して、リン酸化CENP-Fのゲル上のバンドが明確に上方にシフトしていることを示し、CENP-FのcNLSがCDK1基質であることを示しています。次に、CENP-Fリン酸化部位の数と効率を分析するために、質量分析が行われます。
インタクトな in vitro リン酸化 CENP-F の ESI イオントラップ質量スペクトルは、4 つのリン酸化部位を示す 5 つのピークがあり、5 番目のピークが非リン酸化タンパク質であることを示しています。次に、このサイズ排除溶出プロファイルは、野生型CENP-Fを添加すると、カリオフェリンαピークの溶出量がより高い質量にシフトすることを示していますが、これはCENP-F変異体を添加すると観察されません。これは、CENP-Fのリン酸化模倣型S3048DがCENP-F cNLSとカリオフフェリンαとの相互作用を弱めることを示しています。
最後に行われたSDS-PAGE解析では、無傷のcNLSを持つ野生型CENP-Fフラグメントがカリオフェリンαと共溶出し、強い相互作用を示していることが示されています。しかし、CENP-FのS3048D変異体とkaryopherin alphaは別々のピークで溶出します。この手順を試行する際には、得られたリン酸化部位をCDK1のコンセンサスリン酸化配列と照らし合わせて確認し、同定された基質がCDK1と同じ細胞コンパートメントに局在することを確認することを忘れないでください。
この手順に従って、同定されたリン酸化部位が生理学的機能を有することを確認するために、細胞または動物モデルで機能検証を行う必要があります。機能検証には、特異的なCDK1阻害剤やリン酸化模倣変異など、多くのツールが利用可能です。プロテウムには多数のCDK1基質が存在するため、多くのヒトCDK1基質が発見されておらず、in vitroキナーゼアッセイは、これらの部位を同定、マッピング、検証するための重要なツールとなるでしょう。
これらのリン酸化部位を同定することで、CDK1が細胞周期をどのように制御するかのメカニズム研究が可能になります。このビデオを見れば、in vitroキナーゼアッセイによってCDK1特異的リン酸化部位と標的タンパク質を同定する方法を十分に理解できるはずです。
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概要
本記事では、サイクリン依存性キナーゼ1（Cdk1）に特異的なリン酸化部位を特定するために設計された、in vitroキナーゼアッセイのプロトコルを提示します。これらのリン酸化部位を理解することは、細胞周期調節におけるCdk1の役割と、染色体完全性および癌への影響を解明するために極めて重要です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞生物学
- 生化学
- 神経科学
背景
- Cdk1は細胞周期のG2期に活性化されます。
- Cdk1は染色体分離に不可欠なさまざまな細胞経路を制御しています。
- Cdk1活性の不全は、染色体異常や癌を引き起こす可能性があります。
- その重要性にもかかわらず、既知のCdk1標的の数は限られています。
研究の目的
- タンパク質におけるCdk1特異的なリン酸化部位を同定すること。
- 細胞周期制御におけるCdk1の役割について、メカニズム的な知見を提供すること。
- 細胞プロセスに対するCdk1の影響に関する理解を深めること。
使用した手法
- 精製タンパク質を用いたin vitroキナーゼアッセイ。
- Cdk1特異的なリン酸化部位の同定。
- さまざまなモデル生物への本手法の適用。
- 信頼性の高い結果を得るための、細胞を用いた機能研究との組み合わせ。
主な結果
- Cdk1特異的なリン酸化部位の同定に成功。
- 異なるモデル生物間における本手法の適用可能性を実証。
- 細胞周期におけるCdk1のメカニズム的な役割についての知見。
- 他のキナーゼを研究するための改変への可能性。
結論
- in vitro キナーゼアッセイは、Cdk1の研究において有用なツールです。
- リン酸化部位を特定することで、細胞周期調節の理解を深めることができます。
- この手法は他のキナーゼにも応用可能であり、その汎用性を広げることができます。
よくある質問
産業上の重要性
Cdk1特異的なリン酸化部位を正確に特定することで、細胞周期標的のバリデーションにおけるメカニズム上のリスクを排除でき、腫瘍学および細胞分裂関連のポートフォリオにおける予測精度を高めることが可能になります。このin vitroキナーゼアッセイは、キナーゼと基質の関係をマッピングするための標準化された種横断的なワークフローを提供し、初期探索およびトランスレーショナル研究の重要な転換点に直接的な知見を与えます。信頼性の高いリン酸化部位のマッピングは、パスウェイ解析における曖昧さを軽減し、機能的な標的の優先順位付けを加速させます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- メカニズム的なターゲット検証のため、Cdk1基質部位の直接的なマッピングを可能にする。
- 細胞周期調節経路の仮説に基づいた解析をサポートする。
- キナーゼと基質の特異性を確認することで、生物学的なリスク低減を促進する。
- 細胞周期に関連するターゲットの推進に向けた予測信頼性を向上させる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ダウンストリームの機能解析に不可欠な、検証済みのリン酸化部位データを提供します。
- キナーゼ-基質アッセイを標準化し、再現性と拡張性を確保します。
- 質量分析により定量的な出力を生成し、堅牢なスクリーニングへの対応を可能にします。
- キナーゼ活性に対する化合物の影響を、信頼性高く評価できます。
翻訳および前臨床研究
- リン酸化部位のデータを、疾患に関連する細胞周期モデルと整合させます。
- in vitroでの機序研究からin vivoでの機能的検証までの継続性をサポートします。
- リスク調整に基づいた細胞周期調節戦略の進展に情報を供します。
- トランスレーショナルなバイオマーカー開発に向けた機序的な知見を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このキナーゼアッセイは、初期探索からリード化合物の特定までを統合し、細胞周期研究パイプラインにおけるメカニズムのリスク低減および機能的検証をサポートします。
- 探索生物学：Cdk1依存的なリン酸化イベントを単離することで、仮説検証およびパスウェイの解明を可能にする。
- スクリーニング：アッセイ開発および化合物プロファイリングに不可欠な、再現性のある定量的なリン酸化部位データを提供する。
- 分析：質量分析およびSDS-PAGEを用いて、リン酸化状態を精密に測定および比較する。
- トランスレーショナルリサーチ：in vitroでのメカニズム的な知見を、細胞および動物モデルにおける機能研究へと橋渡しする。
- エンタープライズでの再利用：他のキナーゼやモデル生物への適応が可能であり、幅広いポートフォリオへの応用を支援する。
運用上および企業への影響
- 科学的価値： 細胞周期ターゲットの検証における予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減します。
- 運用的価値： キナーゼアッセイのワークフローを標準化し、再現性の確保とチーム間での導入を促進します。
- 戦略的価値： 情報に基づいたgo/no-go判断を可能にし、細胞周期ターゲットの開発を資本効率よく推進します。
- ポートフォリオへの影響： キナーゼ主導の治療プログラムにおける、リスク調整後の優先順位付けをサポートします。
実施上の考慮事項
- タンパク質精製、キナーゼアッセイ、および質量分析解析の専門知識が必要です。
- タンパク質の発現、精製、および分析的検証のための高品質な機器へのアクセスが求められます。
- アッセイ条件およびデータ解釈に関するチーム間での標準化が必要です。
- 各タンパク質標的に合わせて最適化を行うことで、さまざまなモデルシステムに適応可能です。
- 信頼性の高い部位同定には、高いリン酸化効率とタンパク質の均一性の達成が不可欠です。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:04
Title
1:25
Prediction of Cdk1-specific Phosphorylation Sites and Expression of CENP-F in Escherichia coli
4:11
Recombitant Protein Purification by Glutathione-affinity Chromatography and Gel Filtration Followed by In Vitro Kinase Assay with Cdk1/Cyclin B
9:50
Results: Use of In Vitro Kinase Assay to Study Cdk1-specific Phosphorylation Sites in CENP-F
11:13
Conclusion
