植物感染試験: スプレーと傷を介した植物病原体イネいもち病菌接種

このビデオは、植物病原体Magnaporthe griseaの無料接種や望まれる媒介接種など、植物感染分野における主要な方法を指導するのに役立ちます。この技術の主な利点は、噴霧、創傷プロトコルが真菌分離株の病型の迅速、正確、かつ大規模なスクリーニングに貢献することです。この技術の意味は、大規模な植物病害の予防と制御にとって非常に重要であるため、植物病原体と戦うための生理学の研究に関連しています。

この方法は、真菌の保全病原性メカニズムに関する洞察を提供することができます。また、米や大麦などの主な種類の農業植物にも適用できます。一般的に、この方法に不慣れな人は、滅菌綿棒で分生子をやさしくこすり落とすのが難しいため、苦労します。

この方法のデモンストレーションは、葉を貫通せずに擦り傷を収集することが困難であるため、分離した米または大麦の葉の主な手段として重要です。まず、30〜50グラムのオートミールを量ります。オートミールを800ミリリットルの蒸留脱イオン水に加え、電気ポットで30分間沸騰させます。

次に、茹でたオートミール混合物をガーゼを通してビーカーにろ過します。次に、150ミリリットルのトマトジュースと20グラムの寒天をビーカーに加えます。蒸留脱イオン水をビーカーに最大1000ミリリットル加えます。

約50個の米の種子を蒸留脱イオン水に3日間浸し、湿らせたガーゼで種子を包み、シャーレの湿った濾紙で発芽させます。次に、オートクレーブ滅菌した培養土を入れた鉢に苗を植えます。苗に水をまいた後、バーミキュライトの層でそれらを覆います。

苗を25°Cに保ったガラスの家に1〜2週間置きます。次に、滅菌手術用ハサミを使用して、3層の濾紙を8センチメートルの円に切ります。濾紙の円を100ミリメートルの滅菌プラスチックプレートに置きます。

濾紙を浸すのに十分な量の蒸留脱イオン水を各皿に加えます。次に、各培養皿に2〜3センチ間隔で2つの滅菌つまようじを置きます。播種後2週間で、稲の葉を茎の下部を切って集めます。

サーモスタットインキュベーターを使用して、M.grisea株をOTAプレート上で摂氏25度で4日間培養します。次に、ピペットを使用して、各プレートに2ミリリットルの蒸留脱イオン水を追加します。接種ループを使用して、野生型と変異株から菌糸体を菌糸体の破片にこすり落とします。

菌糸体の破片を収集し、新しいOTAプレートに移します。次に、菌糸体の破片をきれいなベンチで乾燥させます。培養菌糸体皿に2ミリリットルの蒸留脱イオン水を加え、滅菌綿棒を使用して分生子をやさしくこすります。

分生子懸濁液を2層のレンズペーパーでろ過し、懸濁液を新しい50mmチューブに移します。次に、チューブを5000倍gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を取り除き、ペレットをTween-20溶液で再懸濁すると、1ミリリットルあたり20,000分生子の濃度が得られます。

懸濁液をハンドヘルド噴霧器に注ぎ、生後2週間の稲の葉に約10ミリリットルの針分懸濁液を噴霧します。対照植物の葉にTween-20溶液をスプレーします。この後、葉を暗く湿った箱で24時間インキュベートします。

次に、葉を蛍光灯のある湿ったチャンバーに12時間移します。解剖学的な針を使用して、分離したイネの葉の主静脈にある2〜3センチメートルの長い傷を3つこすり落とします。削った葉をつまようじに置き、Tween-20溶液をスプレーします。

次に、各M.grisea株を含むOTAプレートから半×半センチメートルの菌糸体プラグを切断します。傷ついた葉にプラグを置き、摂氏25度の湿った部屋で3〜8日間インキュベートします。潜伏期間終了後、International Rice Research Instituteが提供するスコアリングシステムに従って病変を調査および評価します。

最後に、病気の葉を撮影して、テストした株の感染力を評価します。このプロトコルでは、M.grisea株P131およびCom1を使用した植物感染アッセイを感受性の高いイネ苗に対して実施しました。P131を接種した野生型の葉は、イネいもち病の典型的な強固な病変を示した。

しかし、Com1を接種した葉は明らかな感染欠陥を示し、完全な感染を引き起こさなかった。M.griseaが傷口を介して宿主細胞に感染するかどうかを判断するために、野生型植物の擦り切れた葉に菌糸体栓または分生子飛沫を接種しました。スプレー接種された葉は感染欠陥を示さなかった。

対照的に、菌糸体プラグを介して接種された葉は、明らかな欠陥を示しました。この手順を試みるときは、分離した米の葉の主静脈にある2〜3センチメートルの長さの傷を3つこすり落とすことが重要です。この手順に続いて、作物の病害抵抗性を特定および分析するために、病原体接種などの他の方法を実行できます。

この技術の開発により、植物病原体の分野の研究者が現代の生物におけるイネいもち病を探求する道が開かれます。マグナポルテ・グリセアでの作業は危険な場合があり、これらの手順を実行するときは常に手袋を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。