Name: 口腔の細菌感染とキイロショウジョウバエの開口 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-31T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 学ぶ口腔細菌感染法でDrosophila melanogasterの腸免疫を解析する手法。CFU測定と細菌放出量の評価により、宿主病原体相互作用と免疫変異体の生存率を詳細に調査できます。

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この作品は、免疫・感染症・進化 (http://ciie.bio.ed.ac.uk; グラント リファレンス番号 095831) の中心部の Wellcome の信頼から戦略的な賞によって支えられました。PFV に支えられたブランコ ヴァイスシュヴァルツ フェローシップ (https://brancoweissfellowship.org/)、一等書記官の交わり (生物科学の学校、エジンバラの大学);JASJ は、NERC E3 DTP 思い立ったによって支えられました。

1. ハエを維持します。
<ol><li>はえたてのルイス ・媒体の 7 mL を含む 23 mL プラスチック バイアルを保持 (参照31; から変更 1 L トリプル蒸留 H2O、6.1 g 寒天、93.6 g ブラウン シュガー、68 g のトウモロコシ、18.7 g インスタント酵母、15 mL Tegosept 抗真菌剤) インキュベーターで25 ± 1 ° C、12 h:12 h: 明暗サイクル 〜 60% の湿度。非吸収性綿バイアルを接続します。</li>
	<li>すべての 14 日後産卵するように 2-3 日のために、表面に追加、インスタント乾燥酵母を新しい食品バイアルに 20-30 の大人を転送します。この期間の経過後、卵が食品の表面に表示されることを確認します。大人のハエを削除します。 注: これは一世代、年齢をマッチさせた集団としてバイアルにハエを保ちます。</li>
	<li>開発する卵を残します。 注: 25 ° C では、成虫が蛹から 11 日目に eclose を開始、日 12-14 以上継続します。</li>
</ol>2. 実験ハエを準備します。
<ol><li>(ミックス ドライ イーストと酵母ペースト普及 (1 L トリプル蒸留 H2O、寒天 30 g、33 g のショ糖、330 mL アップル ジュース、7 mL Tegosept 抗真菌剤) 75 mL リンゴ寒天プレート上人口/胚コレクション ケージで親世代の卵を収集します。ピーナッツ バターのような一貫性に水)。湿気を提供してケージに水に浸した脱脂綿を追加します。 注: 幼虫飼育密度の違いによって引き起こされる効果を交絡を避けるため、重要です別の瓶で実験ハエが同じような密度で飼育されていること。上記の手順を実行して、効果を交絡を避けます。</li>
	<li>12 h:12 h 25 ° C で 24 時間インキュベート: 明暗サイクルまで産卵が発生しました。24 h 後もいくつかの卵がある場合は、馴化期間を提供します。リンゴ寒天プレートを交換、産卵さらに 24 h のため発生することができます。</li>
	<li>人口ケージから卵を含んだリンゴ寒天プレートを取る。寒天培地の表面から残りの酵母のペーストと、死んだハエを削除します。</li>
	<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 20 mL の寒天培地の水没、優しく細かい絵筆でリンゴ寒天から卵を取り除きます。PBS で中断している間は、50 mL の遠心管に卵を転送し、卵が底に沈むので 5 分おきます。 注: ほとんどの卵は寒天の外縁にあります。</li>
	<li>P1000 フィルター ピペット先端 4 mm 下部を切断することによって削除し、ピペット チップを使用して 50 mL の遠心管の下部から溶液 1 mL を描きます。1.5 mL 遠心チューブにこれを転送し、解決することができます。 注: 卵をピペッティング時スナップ解放プランジャーが優しくリリースするよりも効率的です。</li>
	<li>P20 フィルター ピペット先端 4 mm 下部を切断することによって削除します。ピペットを希望の音量に設定し、遠心管の底から描画します。 注: 練習では、5 μ L のボリュームは約 100 個の卵を含まれます。</li>
	<li>収集した卵には、食品を省略し、必要な時間だけを開発するそれらを残します。</li>
</ol>3. 細菌培養
<ol><li>P. entomophilaと膿の文化を成長し、30 ° C で凍結の細菌の在庫の 100 μ L とルリア ベルターニカミラ (LB) スープの 10 mL を接種する (P. entomophila) 、37 ° C (膿)、それぞれ。一晩 150 rpm で横に振る。細菌文化が飽和段階に達することを確認します。</li>
	<li>ハエを接種用菌は指数段階で、次の朝目的のボリュームの新しいサブカルチャーに一晩かけて培養に接種急速に複製するように。事前接種サブカルチャー文化の総量の 10% であることを確認します。 注: 経口感染症は高い必要があります。したがって、必要な線量と実験的サイズの十分な接種の文化を作り出すことができるので、大量の細菌培養を成長する必要は。計算式 MsVsを使用して必要な感染用量を生成する必要がどのくらいのサブカルチャーは = M私V私M がカルチャを表しますを表しますの 600 nm (外径600) 値と V で測定の光学密度がそのボリューム。下付き文字は、サブカルチャー (s) または (i) 感染用量としてカルチャを使用するかどうかを参照してください。</li>
	<li>サブカルチャーの表面に収まってフラスコの斜面の先頭 (せいぜい) ちょうどそのボリュームに 2 L の三角フラスコでのこのサブカルチャーを成長します。細菌の増殖を阻害すると、このマークの上記入しないでください。</li>
	<li>OD 30 分毎に測定することにより、指数関数的成長段階にこのサブカルチャーの中の細菌を確認します。 注: これはサブカルチャーが 0.6-0.8 間 OD600に達する 3-5 h 後発生します。</li>
	<li>遠沈管 50 mL でこのサブカルチャーの平等なボリュームを注ぐし、細菌を餌に 4 ° C で 15 分間 2,500 x g でサブカルチャーをスピンします。ペレット、一度削除し、細菌の大半の削除を確認する上記の条件で再び上澄みをスピンします。 注: ごくわずかなサイズ (高さ 1 mm より小さい) のペレットはこれを確認します。</li>
	<li>再培養上清中のサブカルチャーの 5 mL に懸濁し、1 つ 50 mL のチューブでこれらのソリューションを再結合して個別のチューブの細菌のペレットを組み合わせます。この濃縮培養で細菌をペレットへの 4 ° C で 15 分間 2,500 x g をスピンします。</li>
	<li>上澄みを除去し、再 5% ショ糖水溶液で最終的な細菌ペレットを中断します。外径を確認し、目的の伝染性の線量を調整 (外径600 p. entomophila8と OD600 100 = =膿16,2825)、5% でペレットを再懸濁で必要量、スクロース水溶液。 注: 追加する 5% ショ糖水溶液の量計算できます 3.2.1 の手順で数式を使用して (MsVs M私V私を =)。</li>
</ol>4. 経口感染ハエ
<ol><li>確実に経口感染症を細菌への露出の前に 2-4 h のハエをハエを標準寒天培地瓶 (1 L トリプル蒸留液 7 mL Tegosept 抗真菌剤 84 g ブラウン シュガー、寒天 20 g H2O) に転送することによって餓死します。</li>
	<li>ハエが不足している間は、感染のバイアルを準備します。緑膿菌感染症バイアル標準糖寒天の 500 μ L 分注を行う 7 mL のサンプル チューブの蓋に、乾燥させておきます。蓋に濾紙ディスクを置くし、フィルター ディスク上に直接細菌培養の 100 μ L をピペットします。、感染症制御のため、細菌の培養を 5% ショ糖水フィルター紙の上の同じボリュームに置き換えます。</li>
	<li>サンプル チューブに単一のハエを追加し、18-24 h のまま。</li>
	<li>経口感染を確認、まず細菌の露出の直後にハエの表面殺菌、20-30 米の 70% のエタノールの 100 μ L にそれらを置くことによって削除しエタノール、追加 100 μ L トリプルの蒸留水 20-30 秒の水を削除する前に。1 × pbs 100 μ L を追加し、フライを均質化します。</li>
	<li>96 ウェル プレートの一番上の行にホモジュネートを転送し、1x PBS の 90 μ L を下回るごとに追加します。</li>
	<li>連続範囲の CFU 値を区別するためにこのサンプルを希釈します。トップまあの磨砕液の 10 μ L を取る、これをよく下記に追加します。この手順を繰り返します 2 番目のも、まあ、第三に 10 μ L を転送するように、必要に応じて、できるだけ多くのシリアル希薄. 注: それは希釈液の各セットに新しいピペット チップを使用することが重要。</li>
	<li>全て滴残る離散を保障する、5 μ L の LB 寒天プレートにシリアルの希薄をプレートします。</li>
	<li>P. entomophilaの膿、それぞれ 30 ° C と 37 ° C で一晩 LB 寒天プレートを孵化させなさいそして表示 CFUs をカウントします。 注:ショウジョウバエ腸内細菌には、明確な嫌気性成長条件が必要ですが、選択培地、たとえば緑膿菌分離培地 (PIM) はシュードモナスCFUs のみが数えられるかどうかを確認する使用ことがあります。</li>
	<li>10-60 CFUs がはっきり見えるシリアル希釈で現在のコロニーの数を数えることによってフライあたり CFUs の数を計算します。フライあたりの細菌数を計算するための希釈倍率を乗算します。</li>
	<li>統計分析を実行します。必要に応じて、正規分布へ飛ぶあたり CFUs を変換します。ログ変換によってこれを行います。変換されると、どの試験治療グループによって異なりますが CFUs のフライ (R33など、一般に利用できる統計ソフトウェア パッケージを使用して) をテストする一般化線形モデル (GLMs)30,31,32を使用します。 注: 残りのフライ ホモジネートは、定量的逆転写 PCR (RT qPCR) 解析による遺伝子発現を測定に使用できます。RNA 分離試薬を 50 μ l 添加の磨砕液を修正、RNA の抽出、Rt-qpcr によって特定の遺伝子で免疫抗体を定量化 (例えば、見なさい詳細なプロトコルのグプタとベールの16 )。特定の免疫遺伝子転写の表現を (すなわちrp49) ハウスキーピング遺伝子の転写レベルを正規化し、倍変更 2−ΔΔCt法31を使用してコントロールのハエを基準として表現する必要があります。 32,33,34。</li>
</ol>5. 記録生存感染
<ol><li>ハエに 4.2 の手順で説明されているように経口感染します。</li>
	<li>感染を転送または標準ルイス バイアルおよび 25 ° c 12 h:12 h でインキュベーターで明暗を維持に、それぞれ感染バイアルからコントロール ハエ サイクル (または条件を希望)。彼らは死んでいるまでにハエを保ちます。</li>
	<li>各バイアルは毎日、または必要に応じて、生活や死者のハエの数をカウントします。</li>
	<li>食べ物で立ち往生ハエを避けるために 5 日ごと新しい瓶にハエを転送します。</li>
	<li>(KM) カプラン ・ マイヤー生存曲線としてこれらのデータを表示または平均 ± SE 比例生存プロットします。分析するには、いくつかの要因と互いにそれぞれの相互作用の効果は Cox 比例ハザード モデル35など生存分析を実行する統計パッケージ (たとえば、パッケージ R33の「サバイバル」) を使用します。</li>
</ol>6. 細菌負荷の測定
<ol><li>希望の時間の時点で、1 つの感染したフライを滅菌 1.5 mL 遠心チューブに転送します。</li>
	<li>4.4 の手順で説明するよう、表面はハエを滅菌します。</li>
	<li>フライを均質化して 4.5-4.10 の手順で説明されているプロトコルを使用して細菌負荷を定量化します。</li>
</ol>7. 測定細菌を流して
<ol><li>内部の負荷と一緒に放出を測定します。</li>
	<li>感染後 24 h のためのルイス ・媒体の 〜 50 μ L を含む 1.5 mL 遠心チューブに単一のハエを転送します。</li>
	<li>内部負荷測定のハエを削除する (手順 6 参照) 3 頻繁にボルテックスの 1 × PBS 100 μ L で管を洗うと s。</li>
	<li>めっきが LB 寒天 4.6-4.8 の手順で説明されているように同じプロトコルを使用してこの洗浄の CFUs を測定します。</li>
	<li>感染後 24 h のためのルイス ・媒体の 〜 50 μ L を含む 1.5 mL 遠心チューブに単一のハエを転送します。</li>
	<li>3 頻繁にボルテックスによってさらに 24 時間の洗浄のためのルイス ・媒体の 〜 50 μ L を含む新しいマイクロ遠心チューブ用の 1 × PBS 100 μ L に汚染されたチューブ ハエに転送 s。</li>
	<li>めっきが LB 寒天 4.6-4.8 の手順で同じプロトコルを使用してこの洗浄の CFUs を測定します。</li>
	<li>7.2 と 7.3 とレコード フライ死亡すべての転送手順を繰り返します。</li>
</ol>

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細菌性病原体とキイロショウジョウバエを確実に経口感染のためのプロトコルを提案します。我々 は膿とP. entomophilaに焦点を当てるが、このプロトコルは、簡単に有効など、セラチア7.など他菌種の感染症に適応できます。このプロトコルの重要な側面は、菌種によって異なります。それに応じて、最も効率的な感染用量、対応する病原性および宿主遺伝子感受性すべてられますが、理想的なパイロット研究でテストします。光学密度の範囲の細菌文化のハエを公開および彼らの伝染性の線量と生存率を測定は、新しい菌種やフライラインを使用適切な出発点です。
プロトコル手順など供給する前に飢餓を飛ぶし、5% ショ糖液に細菌ペレットの再懸濁経口感染症で一般的露出7,8,の中に細菌感染の信頼性を高める9,10します。 ただし、露光中にハエが、細菌文化の面に基本的にライブに注意することが重要です。この文化を歩くと、過程では、ハエの表面、特にキューティクルや毛24の周りに細菌が引っかかってください。これらのエピクチクラ細菌正常腸管感染症を反映していないがフライの均質化、めっきによってまだ検出されます。誤検知の可能性を減らすためには、それは表面に不可欠な 1 分の 70% エタノールに浸漬をハエを滅菌します。
細菌の開口率を考慮した、経口感染症は欠かせません。病原体がホスト環境にリリース数は測定しにくい頻繁、内部負荷は頻繁にしたがって伝送26,27感染症の重症度のプロキシとして取られます。細菌を流してと一緒に測定細菌負荷は疾患重症度と広がり38のこれらの 2 つの重要なコンポーネント間の関係の検討をことができます。提案手法の 1 つの制限は、ハエの内部の細菌負荷を試金と破壊的なサンプリングが必要とすることです。病原体の成長と同じ個人内のクリアランスの縦の動向を調査するは困難します。ただし、各コホートの平均微生物負荷が与えられた内縦病原体ダイナミクスを反映する仮定の下での感染症のさまざまな段階で個人の破壊的サンプリング コホートによってこの制限を克服するために不可能です。個々。細菌を流して苦しむしない同じ制限と我々 は放出できる定量化断面サンプルまたは縦どのように時間をかけて個人内変化放出を調査する方法の例を提供します。
多くのホストと病原体の特徴は共同で疾患25,26,39を送信する個人の傾向を決定します。可能性が高いこれらの特性の意義は、宿主-病原体システムによって異なります、流している可能性が高い糞便口頭伝達の主要な決定要因。細菌の放出を測定する能力は、この仮定をテストする機会を開きます。フライラインの目的パネルにおける宿主-病原体ダイナミクスの特徴を持つ、実験者が経口感染個人、し、感染期間中に感染していない、影響を受けやすいホストと一緒に置いています。これらの '受信者' ハエは、伝送を直接測定する方法として各種の時点で内部の細菌負荷の試金される可能性があります。

キイロショウジョウバエ、フルーツ フライ (酢フライ) は、感染と免疫は病原体1,2のさまざまなモデル生物として広く使用されています。この作業では、感染症の生理的影響基本的な洞察を提供していて、寄生蜂、細菌、真菌、ウイルス感染症に対する宿主免疫応答の分子経路の解明にも先駆的だった。この知識は昆虫や他の無脊椎動物の自然免疫応答を理解するのに役立ちますなくショウジョウバエはまた多くの免疫機構は、昆虫と哺乳類の間保存された、ためには発見に拍車をかけた哺乳類の主要な免疫のメカニズム、人間3を含みます。
ほとんど仕事ショウジョウバエ感染症・免疫は、全身の感染症、虫体に直接穴をあけることまたは注入の4,5,6病原体を提供する接種メソッドを使用を重視しています。制御感染用量の配信をできるようにこれらのメソッドの利点ははっきりと全身感染症の作品の大きな体でサポートされています。ただし、キイロショウジョウバエの多くの自然発生する細菌病原体が腸内免疫がホストの防衛7,8,で重要な役割を果たしている有機物の分解に餌を通じて取得されます。9,10,11,12,13,14,15. 全身の伝染を用いる実験は、これらの防御を迂回し、したがって、昆虫が自然な病原体に対する防御をマウントする方法の完全に別の画像を提供します。これは、仕事の目的は、生態と感染症の進化についての予測をテストする自然な病原体と感染経路が重要な16,17場合に特に問題です。最近仕事大幅病原体によって経路が病気結果18,19をどのように影響するかを強調している、異なる免疫経路20,21を引き出す、保護効果を決定することができます。共生16を継承、再生ホスト防御17の進化に重要な役割をことがあります。
感染症の経口経路を採用するもう一つの理由、次の経口感染症22,23,糞便排泄中に細菌を流して測定することによって病原体の感染の差異の調査をことが24. 病気の感染でホストの不均一性の原因を理解自然集団25,26、挑戦しますが、伝達、管理された実験室の下で取除いて病原体などの成分を測定条件には、有用な代替アプローチ27が提供しています。餌ハエ細菌、様々 な制御の実験条件で遺伝と環境場面の下で放出測定細菌の変動要因のホスト間の転送を識別することが可能です。
ここでは、病原性細菌にキイロショウジョウバエを経口感染させるためのプロトコルについて述べるし、(図 1) に続く細菌の増殖を定量化し、流すの。2 つのシュードモナス菌上でこのプロトコルについて述べる: 日和見菌緑膿(PA14) の強毒株と病原体p. entomophilaを飛行、自然の少ない悪性のひずみ。生は広いホストの範囲で、脊椎動物、植物、線虫、昆虫に感染する一般的なグラム陰性細菌であり、ほとんど環境4,6にあります。膿とp. entomophilaによるショウジョウバエの腸管感染症は腸管上皮12,13,14,15、病理結果します。 28。一方、我々 はこれらの 2 つの細菌性病原体に焦点を当てる、ここで説明する方法原則として適用できるマイナーな修正と関心の任意の細菌の病原体に。経口暴露に続いて感染後の生存率を測定し、個々 のはえ内微生物負荷を測定し、コロニー形成単位 (CFUs) で表される、環境に実行可能な微生物を流します。最後に、腸の免疫は、上皮のバリアと体液性応答の組み合わせから結果、ためこれらの防御が途切れるフライラインの生存も測定します。具体的には、Drosocrystallin (Dcy)変異体は、以前腸29劣化囲食マトリックスによる口腔細菌感染しやすくする示されています。また、IMD 経路30経由でグラム陰性菌に対して抗菌ペプチドの生産から妨げ風味 (Rel) 変異体の生存率を測定します。

<table><tbody><tr><td>バイアルザ</td><td>ルスタット株式会社</td><td>58.490</td><td>ポリスチレンフラットベースチューブ75mm x 23.5mm、23ml</td></tr><tr><td>寒天</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7002</td>寒<td>天、灰分2.0-4.5%</td></tr><tr><td>ブラウンシュ</td><td>ガーBidvest</td><td>66032</td>ライト<td>ブラウンソフトシュガー</td></tr><tr><td>トウモロコシ</td>の<td>鳩の農場</td><td></td><td>有機トウモロコシ粉</td></tr><tr><td>フェルミパン酵母</td><td>Bidvest</td><td>96360</td><td>乾燥、インスタント酵母</td></tr><tr><td>メチル-4-ヒドロキシ安息香酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td>>=99.0%, 結晶性</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td>スクロース BioUltra, 分子生物学用, >=99.5% (HPLC)</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>Fisher Scientific UK Ltd.</td><td>15788517</td><td>X600 シャーレ 90 X 16.2MM 滅菌トリプルベン</td></tr>ト <tr><td>ファルコンチューブ (50ml)</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>210261</td><td>遠心分離チューブ、50ml、スカート付き、袋詰め、滅菌済みエ</td></tr><tr><td>ッペンドルフチューブ (0.5ml)</td><td>Sarstedt Ltd.</td><td>72.699</td><td>ザルスタット マイクロチューブ コニカルベース プッシュキャップ 0.5ml スタンダードニュートラル</td></tr><tr><td>エッペンドルフチューブ (1.5ml)</td><td>Sarstedt Ltd.</td><td>72.690.001</td><td>ザルスタット マイクロ チューブ コニカル ベース プッシュ キャップ 1.5ml 標準中</td></tr><tr><td>性エタノール</td><td>VWR インターナショナル リミテッド</td><td>20821.33</td>エ<td>タノールアブソリュートアナラーNP ACS / R.PE - 分析グレード</td></tr><tr><td>2 Lコニカルフラスコ</td><td>VWRインターナショナル株式会社</td><td>214-0038</td><td>ナローネック、2 L三角フラスコ</td></tr><tr><td>滅菌濾紙</td><td>Fisher Scientific UK Ltd.</td><td>1001-020</td><td>プレーンサークルとシート。粒子保持:11um以上;ろ過速度:150ヘルツベルク;空気の流れ:10.5s / 100mL / in2;中程度の気孔率;滑らかな表面;グレード1;タイプ:円;直径:20mm</td></tr><tr><td>Bijouサンプルコンテナ</td><td>Fisher Scientific UK Ltd.</td><td>129A</td><td>7ml ポリスチレン サンプル容器</td></tr><tr><td>シュードモナス分離寒天</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17208</td><td>寒天 13.6 g/L、塩化マグネシウム 1.4 g/L、動物組織の消化消化物 20g/L、硫酸カリウム 10g/L、トリクロサン 0.025g/L</td></tr><tr><td>LB ブロス、Miller</td><td>Fisher Scientific UK Ltd.</td><td>BP1426</td><td>10g トリプトン、5g 酵母抽出物、10g 塩化ナトリウム/リットルを含む</td></tr><tr><td>大胚コレクションケージ</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td><td>59-101</td><td>Flystuff- 100mm ペトリ皿</td></tr><tr><td>TRI 試薬溶液</td>に適合 <td>Life Technologies</td><td>AM9738</td><td></td></tr><tr><td>96-well microplate</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td><td>353072</td><td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC処理ポリスチレン細胞培養マイクロプレート、蓋付き 滅菌乳</td></tr><tr><td>棒</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>12649595</td><td>乳棒、滅菌済み;アクシゲン;ティッシュグラインダー;青い;不活性ポリプロピレン構造;1.5mLおよび2.0mLの遠心分離管に適合します。個別に包装されています。100/パック</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>科学研究所用品株式会社</td><td>CHE2068</td><td>グリセロール A.R. 99.5% 2.5 L</td></tr><tr><td>脱脂綿 - 非吸収性</td><td>Cowens Ltd</td><td>ABL</td><td>非吸収性 大量 20 袋 x 500</td></tr><tr><td>脱脂綿 - 吸収性</td><td>Cowens Ltd</td><td>ABS</td><td>BP 少量 20 袋 x 500</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisherbrand</td><td></td><td>Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V</td></tr><tr><td>オービタルインキュベーター</td><td>Gallenkamp</td><td>INR-200-010V</td><td>220 V、50 Hz、5 A. 公称温度: 70°C. 振とう周波数: 0...400 rpm.</td></tr><tr><td>吸収度マイクロプレートリーダーBiotek</td><td>Instruments Ltd</td><td></td><td>ELx808&trade;吸光度マイクロプレートリーダー</td></tr><tr><td>Gen 5 マイクロプレートリーダーおよびイメージャーソフトウェア</td><td>Biotek Instruments Ltd</td><td></td><td>吸光度マイクロプレートリーダー用</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>392304</td><td>アレグラ X-12R ベンチトップ遠心分離機、冷蔵 50Hz 230V</td></tr><tr><td>ステップワンプラス リアルタイムqPCRシステム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4376600</td><td>応用バイオシステム ステップワンプラス リアルタイムqPCRシステム</td></tr><tr><td>Step One Software 2.3</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td>SteponeおよびSteponePlusリアルタイムqPCRシステム用</td></tr><tr><td>R Statistical Software</td><td>https://cran.r-project.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>10 & micro;Lピペットチップ</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>741015</td><td>Easlyloadギルソンスタイル。目盛り付き、クリア、詰め替え、960個</td></tr><tr><td>200&マイクロ;Lピペットチップ</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>741065</td><td>Easlyload ギルソンスタイル。目盛り付き、クリア、詰め替え、960個</td></tr><tr><td>1000&マイクロ;Lピペットチップ</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>741045</td><td>イーズリーロード ギルソンスタイル。目盛り付き、クリア、詰め替え、960個20</td></tr><tr><td>&マイクロ;Lフィルター付きピペットチップ</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>774288</td><td>フィルターチップ ギルソンスタイル。クリア、ラックブルー、シングルパック、R / Dnaseフリー、96pcs</td></tr><tr><td>200 & microの10ラック。Lフィルター付きピペットチップ</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>739288</td><td>フィルターチップ ギルソンスタイル。クリア、ラックブルー、シングルパック、R / Dnaseフリー、96pcs</td></tr><tr><td>1000 & microの10ラック。Lフィルター付きピペットチップ</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>740288</td><td>フィルターチップ ギルソンスタイル。クリア、ラックブルー、シングルパック、R / Dnaseフリー、60個入り10ラック</td></tr></tbody></table>

口腔の細菌感染とキイロショウジョウバエの開口

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

ミバエショウジョウバエは、感染と自然免疫の最高の開発したモデル システムのひとつです。ほとんどの作業は、全身感染症に焦点を当て、病原体は、ハエに経口感染するメソッドを必要とする腸内免疫のメカニズムに興味の最近の増加があった。ここで口頭で日和見細菌の病原体 (緑膿菌) とキイロショウジョウバエ(緑膿菌 entomophila) の自然な細菌の病原体の個々 のはえを公開するためのプロトコルを提案する.このプロトコルの目的は、これらの病原体を男性と女性のハエを公開する堅牢な方法を提供することです。病原体伝播の不均質性の研究に関連するである放出、細菌、微生物負荷生存の表現型を示す代表的な結果を提供します。最後に、我々 はことを確認 (腸管上皮細胞の保護囲食マトリックスに欠けている) Dcy変異体 (免疫機能不全 (IMD) 経路に欠けている) 変異体を味わう、口腔の細菌感染に感受性の増加を示します。このプロトコルには、腸の感染症の結果、細菌感染によるバリエーションの様々 な遺伝と環境の要因の研究に拡張することができます, 感染症の経口ルートを使用してハエに感染する堅牢な方法したがって、について説明します。

今回行った実験の結果を例示キイロショウジョウバエは、口頭で膿やp. entomophilaに感染しました。図 2に示しますハエ外径600の細菌文化への 12 時間または 24 時間の曝露期間、次の成功の口腔感染膿(図 2 a) のp. entomophila (図 2 b = 25 と 100C)、それぞれ。図 2 bは、 P. entomophilaハエが大きい光学密度の細菌文化にさらされているときに細菌負荷の増加によって表示のより集中されたカルチャを使用しての重要性を示しています。男性と女性のオレゴン州 R (動体) ハエ同じレート (図 3) で膿感染をオフにし膿CFUs (図 4 a) の同じ数を当てます。しかしp. entomophilaに感染している、男性と女性の動体ハエは (図 4 b) の時間経過と共に変化する方法での細菌小屋の数が異なります。男性と女性は、異なるレートで膿(図 5 a) とp. entomophila (図 5 b) から死にます。(これは腸管上皮細胞の保護囲食マトリックスの欠如) Dcy変異体とレリッシュ突然変異体 (機能 IMD 免疫経路の欠如) を示す次のp. entomophilaと膿減らされた存続も参照してください。経口感染症 (図 5)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig1.jpg"> 図 1: 生存、流して、キイロショウジョウバエで経口感染細菌の内部の負荷を測定するためのプロトコルの概要。キイロショウジョウバエの経口感染症 3 潜在的な実験のイラスト。単一のハエをバイアルに転送して、感染した寿命を記録して '生存' を測定します。'' 単一ハエをキャップでルイス ・媒体の 50 μ L で 1.5 mL 遠心チューブに移すことによって放出を測定します。チューブで 24 h 後フライと渦の 1x PBS 100 μ L にチューブを取り外します。このソリューションを細菌の放出を計算する LB 寒天プレートを取り外して。流す同じフライで縦、24 h 後キャップでルイス ・培地で新鮮なチューブにハエを転送したり洗濯をしたり今汚染されたチューブをめっきによって測定します。ハエの '内部負荷' は、感染したフライ、表面殺菌、それを取り、最後に LB 寒天の磨砕液をメッキする前に均質化によって測定できます。これを計算する測定した放出後に実行できますどのように '内部ロード' と脱落との相関関係。この図で使用されるフライの図によって B. Nuhanen36当初描いた。著者は、ウィキメディア ・ コモンズ37から取られた例 Kaplan-meier 曲線に合わせて変更しました。その他のイラストはすべてオリジナルです。<a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig2.jpg"> 図 2: 経口感染細菌の伝染性の線量。(A) 膿文化への露出の後男女オレゴン-R の伝染性の線量が飛ぶ (外径600 = 25) 12 h。男性 3 名・女性 3 から平均と SE を求めた。(B)次の 4 つのp. entomophila文化の一つに露出 outcrossed 野生型女性の感染用量 (外径600 = 100、75、50、25) または 24 時間の 5% ショ糖液を制御します。統計の違い (F3,76 18.567、 p = &lt; 0.001) 露出治療の間伝染性の線量でバーの上の異なる文字で表されます。外径600 5 飛ぶ手段を求めた = 0 の線量、および他のすべての用量の 18-20。(C) P. entomophila文化への露出の後男女オレゴン-R の伝染性の線量ハエ (外径600 = 100) 24 時間。平均と SE 20 男女 20 名から算出しました。<a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig3.jpg"> 図 3: 内部膿負荷経口感染症後のハエ。オレゴン-R は男性と女性の平均 ± SE 細菌負荷飛ぶ膿と経口感染 (外径600 = 25) 感染後 168 h まで。平均値と各時点の SE は、3 の個人から計算されます。ハエの内部の細菌の負荷が大幅に時間をかけて変更 (p &lt; 0.001)。<a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig4.jpg"> 図 4: 細菌の経口感染を流します。(A)最大 120 h 感染後に図 3に使用される同じハエによって膿を流します。男性 3 名・女性 3 から平均と SE を求めた。(B) P. entomophila男性と女性のオレゴン州 R によって流す飛ぶP. entomophilaで経口感染 (外径600 = 100) 感染後 120 h まで。平均と SE は、34 男女 38 名から算出しました。膿とP. entomophilaハエに CFUs 小屋の数が大幅に変更時間をかけて (p &lt; 0.001)。<a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig5.jpg"> 図 5: 細菌の経口感染のハエの生存します。カプラン ・ マイヤー (KM) 生存曲線(A)オレゴン R オスとメスの飛ぶ膿で経口感染 (外径600 = 25) または 5% ショ糖液を制御します。KM の生存曲線は、治療グループあたり 20 ハエの 4 バイアルから計算しました。(B)男性と女性の動体飛ぶP. entomophila経口感染後 (外径600 = 100)。4 単一のコントロールや両方の男性と女性のための 34 の感染蠅から KM 生存曲線を求めた。(C)免疫変異: Dcy (Drosocrystallin 囲食マトリクス変異) とRel (レリッシュ IMD 変異)、コントロール 5% ショ糖液や膿(Pa14) P. entomophila (Pe) にさらされます。すべての感染したグループ死ぬ大幅コントロール ハエよりも速く (p &lt; 0.001)。<a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

このプロトコルでは、経口感染細菌性病原体とミバエショウジョウバエ melanogaster を公開し、次の腸感染症伝染性の細菌の小屋の数を測定するための方法について説明します。さらに口腔細菌感染飛ぶ生存に免疫の突然変異体の効果について述べる.

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

この方法は、感染と免疫の分野で重要な問題、例えば、個人がさまざまな感染の根源にどのように反応するかなど、答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、主に摂食を通じて獲得される感染に対する宿主防御に重要な役割を果たす腸免疫担当の検査を可能にすることです。この方法は、ショウジョウバエ以外の種にも使用できる可能性があり、ウイルスなどの他の病原体の研究にも使用できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、これらの微生物学プロトコル中に必要な実験的厳密さのために苦労するでしょう。ハエを23ミリリットルのプラスチックバイアルに保持し、7ミリリットルの新しく作られたルイス培地を入れます。バイアルを差し込むには、非吸収性の脱脂綿を使用してください。相対湿度が約60%の12〜12の明暗サイクルで摂氏25度に保ちます14日ごとに、20〜30人の成人を新しい食品バイアルに移し、表面にドライイーストを少し加えます。2〜3日後、十分な卵が産まれた場合は、成虫のハエを処分します。卵を集めるには、ポピュレーションケージを準備します。まず、水に浸した脱脂綿を加えてうるおいをします。次に、基質には、リンゴ寒天と酵母ペーストのスプレッドで満たされた75ミリリットルのプレートを使用します。最後に、成虫をポピュレーションケージに入れます。24時間間隔で、プレートを交換し、卵の存在を確認します。十分な卵が産まれたら、プレートから死んだハエを取り除き、集めたプレートから残りのイーストペーストを取り除きます。次に、寒天を20ミリリットルのPBSに浸し、細かいペイントブラシを使用して卵をそっと取り除きます。PBSの卵を50ミリリットルのチューブに移します。その後、卵を約5分かけて底に沈めます。次に、p1000チップの端を約4ミリメートル短くし、それを使用して溶液中の卵を吸引します。プランジャーのスナップリリースは、それらを引き上げるのに効果的です。次に、PBSの卵を1.5ミリリットルのチューブに移し、卵が落ち着くまで待ちます。次に、ろ過したp20チップを4ミリメートル切り取り、それを使用して卵のアリコートを食品のバイアルに移して発育します。P.entomomielaおよびP.aeruginosaの培養物を育てるには、10ミリリットルのLBブロスに100マイクロリットルの凍結ストックを接種し、150rpmの振とうで一晩インキュベートします。次に、培養物を2リットルの円錐形フラスコに移し、フラスコの壁の斜面の始まりまでLBで満たします。継代培養が指数関数的成長段階に達したら、偶数の50ミリリットルチューブに等量を移し、スピンダウンします。次に、上清を集めて、再びスピンダウンします。次に、各パレットを5ミリリットルの上清に再懸濁して、すべてのチューブからの細菌ペレットを結合し、次に懸濁液を単一の50ミリリットルチューブに再結合します。次に、別のスピンの後、細菌を5%ショ糖溶液に再懸濁します。次に、この懸濁液のサンプルを100倍に希釈して、懸濁液の外径を確実に測定し、懸濁液の最終濃度を所望の感染線量に調整します。経口感染の2〜4時間前に、ハエを食物を含まない標準的な寒天バイアルに移します。.その間、ハエごとに感染バイアルを準備します。まず、7ミリリットルのサンプルチューブの蓋に500マイクロリットルの標準砂糖寒天をロードし、固化させます。次に、濾紙のディスクを寒天に貼り付け、次に100マイクロリットルの細菌培養物を直接フィルターディスクにピペットで移します。コントロールには、5%のショ糖水を使用します。飢餓期間の後、シングルフライを準備したチューブに移します。ハエを18〜24時間インキュベートした後、ハエを表面滅菌します。100マイクロリットルの70%エタノールが入ったチューブに個体をロードします。20〜30秒後、エタノールを取り出し、100マイクロリットルの三重蒸留水と交換します。さらに20〜30秒後、水を取り除きます。次に、100マイクロリットルのPBSを追加し、フライを均質化します。ホモジネートを96ウェルプレートの最上列に移し、90マイクロリットルの1x PBSを下のすべてのウェルに加えます。次に、10マイクロリットルのアリコートを使用して、このサンプルを連続希釈し、CFU値の範囲を区別します。次に、LB栄養寒天プレートに段階希釈液を5マイクロリットルの液滴でプレートします。液滴がプレート上に目立たないように配置します。その後、プレートを一晩インキュベートします。翌日、希釈液からCFUの数を計算し、10〜60個のはっきりと見えるコロニーを生成します。細菌負荷を測定するには、感染した1匹のハエを滅菌済みの1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。次に、前述のように、ハエを表面滅菌し、次にハエを均質化してCFU分析を行います。細菌の排出を測定するには、約50マイクロリットルのルイス培地を含む1.5ミリリットルのチューブに単一のハエを移します。チューブは24時間ごとに交換してください。3本のチューブを24時間装着した後、ハエを廃棄します。各移乗後、チューブに含まれる細菌を測定します。ボルテックスを使用して、チューブの内容物を100マイクロリットルのPBSと混合します。次に、連続希釈液をめっきして混合物中のCFUを測定します。記述プロトコルを使用して、経口細菌感染の影響を死亡率と細菌排出を通じて調査しました。シェディングは、同じハエで縦方向に測定され、内部の細菌負荷とともに単一の時点で測定されました。D.melanogasterは、P.aeruginosaまたはP.entomophilaに経口感染していました。成功した経口感染は、細菌培養物への12時間または24時間の曝露期間後に発生しました。P.entomophilaのより濃縮された培養物を使用する必要がありました。オスとメスのオレゴンRフライは、同じ割合で緑膿菌感染を解消し、同じ数の緑膿菌CFUを排出しました。しかし、P.entomomielaに感染すると、オスとメスのオレゴンRフライは、時間依存的に排出される細菌の数が異なりました。男性と女性は、緑膿菌と昆虫炎菌で死亡した割合が異なっていました。それに比べて、腸上皮に保護用の周栄養マトリックスがない突然変異型のハエは、機能的なIMD免疫経路を欠く突然変異体と同様に、より早く死滅します。このビデオを見た後、ショウジョウバエを細菌に経口感染させる方法と、寿命や細菌の排出など、結果として生じる病状の主要な側面を測定する方法についてよく理解できるはずです。一度習得すると、このテクニックは、適切に実行すれば、2日間で約6〜8時間実行できます。この手順に続いて、qRT-PCRなどの他の方法を実行して、感染が免疫遺伝子発現をどのように変化させるかなどの追加の質問に答えることができます。細菌性病原体を扱う作業は非常に危険である可能性があるため、これらの手順を実行するときは、適切な個人用保護具を着用し、層流フード内で作業するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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