エストロージェン体外用ひと子宮内膜間質細胞の分離

この方法は、脱落膜化の根底にある分子メカニズムに関する生殖医療分野の重要な疑問に答えるとともに、子宮内膜間質細胞の脱落膜化における特定の遺伝子の役割を理解するために使用できます。この研究は、ヒト子宮内膜間質細胞の単離と、その後のホルモンの培養培地への補充による人工脱落膜化のための詳細なプロトコルを提供します。プロラクチンやインスリン様成長因子結合タンパク質1などのホルモン変化の発現を利用して、脱落膜化の程度を確認し定量化することができます。

重要なことに、このプロトコルが遺伝子特異的ノックダウンを実施する可能性も実証されています。滅菌した鉗子で生検を10ミリリットルの新鮮なHBSFを含む50ミリリットルのチューブに移し、続いて500x Gで90秒間遠心分離します。1 mLピペットを使用して培地を取り出し、3 mLの予熱済みhES単離培地を加えます。

生検を5mLのhES単離培地を含む10cmの皿にデカントし、Dumont 5鉗子と細いストレートステッチハサミを使用して約20分間刻み始めます。1 mLピペットを使用して、刻んだ生検を新しい50 mLチューブに移し、さらに7 mLのhES分離培地を皿に加えて、残りの断片を50 mLチューブに移します。次に、サンプルを800x Gで2分間遠心分離し、1 mLピペットを使用して上清を除去します。

次に、DNase-1とコラゲナーゼ消化混合物を、10ミリリットルのシリンジに取り付けられた0.2ミクロンのフィルターを介してペレットに直接ろ過します。次に、チューブを10秒間ボルテックスしてペレットを再懸濁し、水浴中で90分間インキュベートします。10分ごとにチューブを10秒間ボルテックスして、組織が適切に消化されていることを確認します。

インキュベーション後、新しい50ミリリットルチューブに積み重ねた40ミクロンのセルストレーナーで懸濁液をろ過して間質細胞を回収し、収集した細胞を800x Gで2.5分間遠心分離します。遠心分離後、細胞ペレットを乱さないように、1ミリリットルのピペットを使用して上清を静かに取り除きます。次に、細胞ペレットを10ミリリットルの新鮮なhES単離培地に再懸濁し、続いて800x Gで2.5分間遠心分離します。

遠心分離後、上清を慎重に吸引し、細胞を6ミリリットルの新鮮なhES培地に再懸濁します。次に、血液細胞を除去するために、再懸濁した細胞を3ミリリットルの密度勾配培地にゆっくりと重ね、サンプルを400x Gで30分間遠心分離します。遠心分離後、密度勾配培地を乱さずに上清を回収します。

次に、hES培地を添加して総容量を最大10ミリリットルにし、サンプルを800x Gで2.5分間再び遠心分離します。遠心分離後、上清を除去し、細胞を6ミリリットルのhES培地に再懸濁します。次に、6ミリリットルの細胞再懸濁液と10ミリリットルのhES培地をフラスコに加え、フラスコを揺さぶって穏やかに混合することにより、75センチメートルのフラスコに細胞をプレート化します。

めっき後、顕微鏡で細胞密度を確認し、2日ごとにhES培地を交換するようにしながら、二酸化炭素5%のインキュベーターで3〜5日間細胞を培養します。48時間後、細胞は単層として成長するはずです。通常、5日後、細胞は75センチメートルのフラスコで80〜90%のコンフルエントを達成します。

siRNAトランスフェクションの場合、まず、ウェルあたり800,000個の細胞を6ウェルプレートに各条件で3回プレーティングし、トランスフェクションの準備のために細胞を5%二酸化炭素インキュベーターで2日間インキュベートします。2日後、5 mLチューブに150マイクロリットルのOpti-MEM無血清培地を加え、続いて5マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加えます。反転させてよく混合し、5分間インキュベートします。

次に、100 マイクロリットルのOpti-MEM無血清培地を新しい5 mLチューブに添加し、続いて16ナノモルのSRC-2 siRNAを添加します。次に、5 mLのチューブに100マイクロリットルのOpti-MEM無血清培地を添加し、続いて16ナノモルのコントロールsiRNAを添加します。インキュベーション後、希釈したトランスフェクション試薬をSRC-2 siRNAと組み合わせ、ピペッティングを順方向および逆方向にピペッティングしてよく混合します。

次に、希釈したトランスフェクション試薬をコントロールsiRNAと組み合わせ、ピペッティングを順方向および逆方向にピペッティングしてよく混合します。次に、複合体を5分間インキュベートします。このインキュベーション中に、hES培地を吸引し、各ウェルに1ミリリットルの変更培地を加えます。

5分間のインキュベーション後、複合体を500x Gで2分間遠心分離し、溶液を回収します。次に、細胞と培地を含む各ウェルに250マイクロリットルのsiRNAトランスフェクション試薬複合体を加え、穏やかに揺さぶって混合した後、5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で5時間インキュベートします。5時間後、培地を吸引してhES培地に交換し、in vitro脱落膜アッセイの準備として2日間インキュベーションを続けます。

48時間のトランスフェクション後、in vitro脱落膜化アッセイを開始する前に、ゼロデイコントロールのsiRNAおよびSRC-2 siRNAトランスフェクション細胞を回収します。まず、培地を吸引し、ウェルあたり1 mLのPBSで洗浄します。次にPBSを取り出し、ウェルあたり300マイクロリットルのRNA溶解バッファーを加えて3分間インキュベートします。

3分間のインキュベーション後、RNA溶解バッファー中の細胞を1.5 mLチューブに集め、後で下流で分析します。次に、適切な量の脱落膜培地を分注してEPC培地を調製し、10ナノモルのエストラジオール、1マイクロモルの酢酸メドロキシプロゲステロン、および50マイクロモルの環状アデノシン一リン酸を50ミリリットルのチューブに加えます。残りの6日目のウェルについては、各ウェルに2ミリリットルのEPC培地を追加し、摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターで細胞を6日間インキュベートし、EPC培地を48時間ごとに交換します。

6日目以降、6日目のコントロールsiRNAと6日目のSRC-2 siRNAトランスフェクション細胞ペレットをRNA溶解バッファーに回収し、リアルタイムPCRを使用したダウンストリーム解析を行います。エストロゲンによる脱落膜化の誘導 メドロキシプロゲステロンおよび環状アデノシン一リン酸は、細長い線維芽細胞から丸みを帯びた上皮細胞への間質細胞の細胞骨格再構成をもたらします。子宮内膜間質細胞のファロイジン染色は、hES脱落膜化に特徴的な活性線維細胞骨格再編成をさらに明らかにします。

ビヒクルで処理されたhESでは、細胞は外観が線維芽細胞性のままですが、EPC処理された細胞では、hESは類上皮様に見えました。in vitro脱落膜化アッセイの有効性を確認するために、脱落膜化マーカーであるプロラクチンおよびインスリン様成長因子結合タンパク質-1のmRNA転写レベルを6日間にわたって評価しました。ヒト子宮内膜間質細胞の脱落膜化により、プロラクチンおよびIGFBP1レベルは時間依存的に増加しました。

分泌プロラクチンレベルの時間依存的な増加は、ELISA法によるhES組織培養培地の検討によっても確認されました。ヒト子宮内膜間質細胞の脱落膜化の細胞および分子変化に対する遺伝子特異的ノックダウン効果は、48時間siRNAトランスフェクション後の培養6日目に、コントロールまたはステロイド受容体の共活性化因子である2 siRNAを用いて評価されました。コントロールsiRNAトランスフェクションされたhESは、石畳の形態学的変化や脱決定マーカーPRLおよびIGFBP1の転写レベルの増加など、適切な脱落膜化と一致する細胞および分子の変化を示しました。

SRC-2 siRNAノックダウンでは、hESはコントロールのsiRNAトランスフェクトhESと比較して外観が線維芽細胞性のままであり、PRLおよびIGFBP1転写産物レベルが有意に低下しました。SRC-2 siRNAトランスフェクトhESでは、コントロールsiRNAと比較して、SRC-2転写産物レベルが有意に低下しており、この方法の遺伝子サイレンシングに対する生存性が示されています。このビデオを見れば、in-vitroでの脱落膜法やsiRNAトランスフェクションによる特定の遺伝子のノックダウンを目的として、子宮内膜生検から初代間質細胞を単離する方法を十分に理解できるはずです。