Name: エストロージェン体外用ひと子宮内膜間質細胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: 学ぶ ヒト子宮内膜間質細胞の分離とin vitro脱分化誘導法。siRNAトランスフェクションによる遺伝子ノックダウンも可能で、着床や妊娠に関わる分子メカニズムの研究に有用です。

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著者が明らかに何もありません。

<ol><li>Maruyama, T., Yoshimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+mechanisms+for+differentiation+and+regeneration+of+the+uterine+endometrium%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium.</a> Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometrial+Stromal+Decidualization+Responds+Reversibly+to+Hormone+Stimulation+and+Withdrawal%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal.</a> Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).</li>
<li>Ahn, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP-Response+Element-Binding+3-Like+Protein+1+%28CREB3L1%29+is+Required+for+Decidualization+and+its+Expression+is+Decreased+in+Women+with+Endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis.</a> Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+decidualization+of+the+human+endometrium+in+reproductive+health+and+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure.</a> Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).</li>
<li>Telgmann, R., Gellersen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker+genes+of+decidualization%3A+activation+of+the+decidual+prolactin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene.</a> Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).</li>
<li>Camden, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+regulation+by+estrogen+in+breast+cancer+1+%28GREB1%29+is+a+novel+progesterone-responsive+gene+required+for+human+endometrial+stromal+decidualization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization.</a> Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).</li>
<li>Kommagani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Promyelocytic+Leukemia+Zinc+Finger+Transcription+Factor+Is+Critical+for+Human+Endometrial+Stromal+Cell+Decidualization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization.</a> PLoS Genetics. 12, e1005937(2016).</li>
<li>Large, M. J., DeMayo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+embryo+implantation+and+endometrial+decidualization+by+progesterone+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).</li>
<li>Zhang, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mesenchymal-epithelial+transition+during+in+vitro+decidualization%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Sciences%22%5BJournal%5D)">The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization.</a> Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).</li>
<li>Kommagani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+the+glycolytic+flux+by+steroid+receptor+coactivator-2+is+essential+for+endometrial+decidualization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization.</a> PLoS Genetics. 9, e1003900(2013).</li>
<li>Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometrial+decidualization%3A+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endometrial decidualization: of mice and men.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).</li>
<li>Tamura, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Function+of+a+Transcription+Factor+WT1+in+Regulating+Decidualization+in+Human+Endometrial+Stromal+Cells+and+Its+Molecular+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism.</a> Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).</li>
<li>Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Decidual+Stromal+Cells+as+a+Component+of+the+Implantation+Niche+and+a+Modulator+of+Maternal+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pregnancy%22%5BJournal%5D)">Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity.</a> Journal of Pregnancy. , 8689436(2016).</li>
<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+endometritis+modifies+decidualization+in+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16(2017).</li>
<li>Garcia-Elias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+quantification+methods+and+optimizing+protocols+for+microarray+hybridization+of+circulating+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs.</a> Scientific Reports. 7, 7725(2017).</li>
<li>Brosens, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endometrial+fibroblasts+immortalized+by+simian+virus+40+large+T+antigen+differentiate+in+response+to+a+decidualization+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus.</a> Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).</li>
<li>Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexamethasone+induces+rapid+actin+assembly+in+human+endometrial+cells+without+affecting+its+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).</li>
</ol>

この仕事はから国民衛生の健康 (NIH) の資金でサポートされている/児童保健および人間の開発 (NICHD) 助成金 (R00 HD080742) ワシントン州大学医科大学院スタートアップ研究資金 R.K.子宮内膜生検サンプルを提供するため、ワシントン大学の不妊クリニックに感謝したいと思います。

女性の月経周期は、それによって分泌細胞が上皮のようにラウンド、3、8に ESC のエストロージェンを誘導中黄体期のプロゲステロンのレベルの上昇によって特徴付けられます。エストロージェンの開始は、依存する生物です。ヒトでは、エストロージェンは、自発的にプロゲステロン濃度の上昇マウス胚盤胞の存在10,11を必要とするのに対し。エストロージェンでこの矛盾を例証するひと培養細胞の細胞分化の研究の橋渡しの利点。ホルモン4,6,10を介してエストロージェンの変調を探索する一次電池文化による試験管内アッセイがしばしば用いられます。ただし、このメソッドの制限事項は、サイクルの段階と妊娠の歴史に大きな変化なし人間組織の大規模なサンプル サ...

生殖年齢の女性がホルモンによって調節される子宮内膜の増殖・分化・月経1 として知られているプロセスで妊娠の準備のためにその後放出の毎月のサイクルを受ける初潮の段階と月経閉止期の間 ,2。ひと子宮内膜のような物理的な変更が必要1子宮壁に適切な胚移植です。形態学的および生化学的適応を含む子宮内膜の変化は卵巣性ステロイド ホルモンのエストロゲンとプロゲステロン (P4) を介して月経サイクルを通して仲介される3,4,5。増殖 (または卵胞) フェーズの中で排卵エストロゲン レベルが高く、子宮内膜肥厚を開始します。次の排卵、分泌 (または黄体) 相は丸め、上皮のような脱落膜細胞線維芽細胞のような外観から子宮内膜間質細胞 (ESC) の形態学的変化を誘導する P4 濃度の大幅な上昇を促進します。エストロージェン4,6として知られているプロセス。注入の失敗とその後初期流産胚4,7,8根本原因として不適切なエストロージェンを設置します。したがって、エストロージェン分子機構の解明、診断と妊娠初期の損失の治療に有利であります。
現在、子宮内膜間質細胞のエストロージェンの根本的な影響を探検するいくつかの手法が利用されています。生体内で、マウス子宮機械的刺激 (すなわち、, 傷) を介してエストロージェンの人工的に誘導することができますまたは油ホルモン プライミング子宮9で注入。人間とは異なる、この合成の刺激は、胚盤胞の存在、齧歯動物の10、11エストロージェンの開始のために必要なステップの外観を提供することで子宮内腔の分化を促進します。したがって、並進合併症の動物モデルと人間の生体内で調査を囲む倫理的なジレンマに関連するのためエストロージェン ベース モデルはほとんどが正常に研究体外。
本研究では被験者は両方のローカル英語とスペイン語の新聞広告の配置によって募集しています。この研究に適した候補として識別される科目は、研究コーディネーター、潜在的なリスクの完全な情報開示の説明に会うため持って来られます。潜在的なリスクの完全な理解の確認後、被験者の同意は書面と口頭の両方の形態で得られます。被写体の同意には、(1) 今後の研究目的のための組織の瀉血 (2) 長期的なストレージを受けるし、(3) 収集した組織標本から初代培養の作成に同意する権限が含まれています。同意、次科目は、人種/民族および/または機密保持のための権利を許可された自己で完了するフォームを与えられています。その後の訪問は、サブジェクトの月経周期に基づく子宮内膜生検を達成する予定です。この研究に募ったボランティア 2012年国勢調査によって文書化されたセントルイス都市圏の民族、人種的な人口を反映し、妊娠中の女性、胎児、胚を含む任意の脆弱な人口の参加を伴わない18 歳未満の年齢、または他の弱者の子供。生検サンプル コレクションに参加するための資格要件は、(1) 歳の 18-45 年 (2) (3) を持たない現在の妊娠や避妊薬ホルモン/子宮内のデバイスの使用規則的な月経周期 (25-32 日) を持つが現在膣感染症や性感染症 (5) ない現在の抗生物質治療と (6) を持たない登録 (4) 前 30 日間ないこと現在の異常な Pap 汚れ。
この研究では、ひと子宮内膜間質細胞 (HESC) を培養し、人工的に誘導した体外ホルモン (エストラジ オール (E2)、酢酸メドロキシプロゲステロン (MPA)、および環状アデノシンのサプリメントからエストロージェンを受けることに一リン酸塩 (キャンプ)) 媒体に。このメソッドは、エストロージェンの程度は、ホルモン治療日数の合計数に基づいて変更されます。細胞骨格再配置に伴い、ホルモン補充は脱落膜細胞が分泌のような資質2,4を発生生化学的適応を誘発します。プロラクチン (PRL) とインスリン様成長因子結合蛋白質 1 (IGFBP1) などの認刻極印の遺伝子の表現を活用して、確認、HESC エストロージェン5,12,の程度を定量化すること13,14します。 重要なことは、遺伝子の特定の打撃を行うこのプロトコルの生存性も実証されています。

<table><tbody><tr><td>Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>脱落膜培地</td></tr>用 <tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1X)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>細胞数用</td></tr><tr><td>PureLink RNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>12183018A</td><td>For RNA Isolation/</td></tr><tr><td>Purification TaqMan 2X Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4374967</td><td></td></tr><tr><td>Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control</td><td>Life Technologies</td><td>4319413E</td><td>qPCR内部制御用</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182</td><td>qPCR内部制御用</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expressionアッセイ IGFBP1 プローブ</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182</td><td>qPCR 内部制御用</td></tr><tr><td>ファロイジン-iFluor 488 試薬 - CytoPainter</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td></td></tr><tr><td>ヒト プロラクチン ELISA キット</td><td>Invitrogen</td><td>EHIAPRL</td><td></td></tr><tr><td>16% パラホルムアルデヒド</td><td>Alfa Aesar</td><td>30525-89-4</td><td>固定剤</td></tr><tr><td>リポフェクタミン RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止試薬 DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA (1X)</td> の取り付け用<td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>木炭剥ぎ取り 牛胎児血清</td><td>Σ</td><td>F6765-500ML</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム (7.5%)</td><td>Gibco</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS試薬</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td></td>ックのコラゲナーゼ45001749 <td></td></tr><tr><td>Clostridium histolyticum</td><td>シグマ</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>デオキシリボヌクレアーゼIからウシ膵臓</td><td>シグマ</td><td>DN25-100MG</td><td></td></tr><tr><td>メドロキシプロゲステロン17酢酸</td><td>シグマ</td><td>M1629-1GEPC</td><td>メディア用</td></tr><tr><td>エストラジオール</td><td>シグマ</td><td>E1024-1G</td><td>EPCメディア</td></tr><tr><td>用 cAMP</td><td>シグマ</td><td>A6885-100MG</td><td>EPCメディア用</td></tr><tr><td>ファインストレートステッチはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 遺伝子発現アッセイ NCOA2 プローブ</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351372</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td><td>Gibco</td><td>10-082-147</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-antimycotic</td><td>Thermo科学</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>ハンク平衡塩溶液&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>21-021-cv</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 円錐形ポリプロピレン ファルコンチューブ</td><td>コーニング</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5/45 鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm ガラス ペトリ皿</td><td>VWR</td><td>75845-546</td><td></td></tr><tr><td>40 ミクロン セル ストレーナー</td><td>Midsci</td><td>229481</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 215 ウォーターバス</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>FS-215</td><td></td></tr><tr><td>LSE遠心分離機&nbsp;</td><td>Corning</td><td>6755</td><td></td></tr><tr><td>ヒト NCOA2 siRNA&nbsp;</td><td>Dharmacon</td><td>L-020159-00</td><td>遺伝子特異的qPCRプローブ</td></tr><tr><td>Steri-cycle i160 CO2 Incubator&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>51030301</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>RNA定量用</td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50146771</td><td></td></tr><tr><td>75cm傾斜ネック細胞培養フラスコ</td><td>コーニング</td><td>430641U6</td><td></td></tr><tr><td>ウェル非発熱性細胞培養プレート</td><td>コーニング</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>ピペットコントローラーウルトラ</td><td>コーニング</td><td>4099</td><td></td></tr><tr><td>フォトショップ</td><td>アドビ</td><td>19.0.1.334</td><td></td></tr><tr><td>25cm傾斜ネック細胞培養フラスコ</td><td>コーニング</td><td>7200876</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 円錐形ポリプロピレン ファルコンチューブ</td><td>コーニング</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>10 mL シリンジ</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>1300 シリーズ A2 生物学的安全性フード</td><td>Thermo Scientific</td><td>1377</td><td></td></tr><tr><td>accuspin Micro17 遠心分離機</td><td>Fisher Scientific</td><td>13100675</td><td></td></tr><tr><td>7500 FastリアルタイムPCRシステム</td><td>Applied Biosystems</td><td>3052632</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL 免疫蛍光顕微鏡</td><td>Life Technologies</td><td>01414-155G-291</td><td></td></tr><tr><td>ライカ 倒立光学顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>Illrustrator</td><td>Adobe</td><td>22.0.1.253</td><td></td></tr><tr><td>Excelスプレッドシート</td><td>Microsoft</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>Deckglaser 18 mmカバーメガネ</td><td>NeuVitro</td><td>GG-18</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Bright-Line 血球計算盤</td><td>Sigma</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP176-100</td><td>RNA 溶解バッファー</td></tr><tr><td>用 1.2mL おねじポリプロピレン 極低温バイアル</td><td>コーニング</td><td>430658</td><td>HESC細胞凍結用&nbsp;</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650-100mL</td><td>凍結培地用</td></tr></tbody></table>

エストロージェン体外用ひと子宮内膜間質細胞の分離

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

分泌脱落膜に線維芽細胞のような外観からひと子宮内膜間質細胞 (HESC) の分化は、母親の子宮の子宮内に胚移植に必要な変換です。着床障害とそれに続く初期胚流産の根本的な原因として不適切なエストロージェンを設置します。したがって、エストロージェンの分子機構を理解することは成功した出生率向上に有利であります。人工エストロージェンの生体内研究は人間研究として動物モデル内での並進運動合併症に関連付けられている倫理的なジレンマのためしばしば制限しています。その結果、一次電池文化を通しての in vitroアッセイがホルモンを介してエストロージェンの変調を探るにしばしば用いられます。この研究は、悪名高くの分離と培養の培地にホルモンの補充によるその後の人工エストロージェンの詳しいプロトコルを提供します。さらに、この研究は、siRNA の脂質ベースの transfections を利用してノックダウンするうまく設計された方法興味の任意の遺伝子を提供します。このプロトコルにより、文化純度としてエストロージェンとの後の定量化の基礎となる分子機構を理解するための信頼性の高い方法としてこのモデルを活用する能力を最大化する製品の歩留まりの最適化decidualized 子宮内膜間質細胞因子を分泌します。

HESC 文化エストロージェン
次の分離、ひと子宮内膜間質細胞は 80-90% の confluency による単分子膜形成に培養し、体外エストロージェンの 10 nM E2、1 μ M MPA、50 μ M のキャンプと治療による (EPC)。エストロージェン体外に関連付けられている形態学的変化は、図 1 aに, 可視化されました。エストロージェンに HESCs は細長い、線維芽細胞から丸みを帯びた類上皮細胞の細胞骨格語順換えを経る。したがって、ファロイジン染色を HESC エストロージェン中細胞骨格の再構成を確認に行った。ファロイジンはアクチン フィラメントの染色を活用した高選択的環ペプチドにより体外エストロージェン (図 1 b) と一貫性の...

本稿ではエストロージェンの in vitroアッセイを行うひと子宮内膜間質細胞の分離文化の検証と最適化されたプロシージャ。さらに、この研究では、ひと子宮内膜間質細胞で Sirna を使用して特定の遺伝子の効率的にノックダウンする詳細な方法が提供します。

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

この方法は、脱落膜化の根底にある分子メカニズムに関する生殖医療分野の重要な疑問に答えるとともに、子宮内膜間質細胞の脱落膜化における特定の遺伝子の役割を理解するために使用できます。この研究は、ヒト子宮内膜間質細胞の単離と、その後のホルモンの培養培地への補充による人工脱落膜化のための詳細なプロトコルを提供します。プロラクチンやインスリン様成長因子結合タンパク質1などのホルモン変化の発現を利用して、脱落膜化の程度を確認し定量化することができます。重要なことに、このプロトコルが遺伝子特異的ノックダウンを実施する可能性も実証されています。滅菌した鉗子で生検を10ミリリットルの新鮮なHBSFを含む50ミリリットルのチューブに移し、続いて500x Gで90秒間遠心分離します。1 mLピペットを使用して培地を取り出し、3 mLの予熱済みhES単離培地を加えます。生検を5mLのhES単離培地を含む10cmの皿にデカントし、Dumont 5鉗子と細いストレートステッチハサミを使用して約20分間刻み始めます。1 mLピペットを使用して、刻んだ生検を新しい50 mLチューブに移し、さらに7 mLのhES分離培地を皿に加えて、残りの断片を50 mLチューブに移します。次に、サンプルを800x Gで2分間遠心分離し、1 mLピペットを使用して上清を除去します。次に、DNase-1とコラゲナーゼ消化混合物を、10ミリリットルのシリンジに取り付けられた0.2ミクロンのフィルターを介してペレットに直接ろ過します。次に、チューブを10秒間ボルテックスしてペレットを再懸濁し、水浴中で90分間インキュベートします。10分ごとにチューブを10秒間ボルテックスして、組織が適切に消化されていることを確認します。インキュベーション後、新しい50ミリリットルチューブに積み重ねた40ミクロンのセルストレーナーで懸濁液をろ過して間質細胞を回収し、収集した細胞を800x Gで2.5分間遠心分離します。遠心分離後、細胞ペレットを乱さないように、1ミリリットルのピペットを使用して上清を静かに取り除きます。次に、細胞ペレットを10ミリリットルの新鮮なhES単離培地に再懸濁し、続いて800x Gで2.5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を慎重に吸引し、細胞を6ミリリットルの新鮮なhES培地に再懸濁します。次に、血液細胞を除去するために、再懸濁した細胞を3ミリリットルの密度勾配培地にゆっくりと重ね、サンプルを400x Gで30分間遠心分離します。遠心分離後、密度勾配培地を乱さずに上清を回収します。次に、hES培地を添加して総容量を最大10ミリリットルにし、サンプルを800x Gで2.5分間再び遠心分離します。遠心分離後、上清を除去し、細胞を6ミリリットルのhES培地に再懸濁します。次に、6ミリリットルの細胞再懸濁液と10ミリリットルのhES培地をフラスコに加え、フラスコを揺さぶって穏やかに混合することにより、75センチメートルのフラスコに細胞をプレート化します。めっき後、顕微鏡で細胞密度を確認し、2日ごとにhES培地を交換するようにしながら、二酸化炭素5%のインキュベーターで3〜5日間細胞を培養します。48時間後、細胞は単層として成長するはずです。通常、5日後、細胞は75センチメートルのフラスコで80〜90%のコンフルエントを達成します。siRNAトランスフェクションの場合、まず、ウェルあたり800,000個の細胞を6ウェルプレートに各条件で3回プレーティングし、トランスフェクションの準備のために細胞を5%二酸化炭素インキュベーターで2日間インキュベートします。2日後、5 mLチューブに150マイクロリットルのOpti-MEM無血清培地を加え、続いて5マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加えます。反転させてよく混合し、5分間インキュベートします。次に、100 マイクロリットルのOpti-MEM無血清培地を新しい5 mLチューブに添加し、続いて16ナノモルのSRC-2 siRNAを添加します。次に、5 mLのチューブに100マイクロリットルのOpti-MEM無血清培地を添加し、続いて16ナノモルのコントロールsiRNAを添加します。インキュベーション後、希釈したトランスフェクション試薬をSRC-2 siRNAと組み合わせ、ピペッティングを順方向および逆方向にピペッティングしてよく混合します。次に、希釈したトランスフェクション試薬をコントロールsiRNAと組み合わせ、ピペッティングを順方向および逆方向にピペッティングしてよく混合します。次に、複合体を5分間インキュベートします。このインキュベーション中に、hES培地を吸引し、各ウェルに1ミリリットルの変更培地を加えます。5分間のインキュベーション後、複合体を500x Gで2分間遠心分離し、溶液を回収します。次に、細胞と培地を含む各ウェルに250マイクロリットルのsiRNAトランスフェクション試薬複合体を加え、穏やかに揺さぶって混合した後、5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で5時間インキュベートします。5時間後、培地を吸引してhES培地に交換し、in vitro脱落膜アッセイの準備として2日間インキュベーションを続けます。48時間のトランスフェクション後、in vitro脱落膜化アッセイを開始する前に、ゼロデイコントロールのsiRNAおよびSRC-2 siRNAトランスフェクション細胞を回収します。まず、培地を吸引し、ウェルあたり1 mLのPBSで洗浄します。次にPBSを取り出し、ウェルあたり300マイクロリットルのRNA溶解バッファーを加えて3分間インキュベートします。3分間のインキュベーション後、RNA溶解バッファー中の細胞を1.5 mLチューブに集め、後で下流で分析します。次に、適切な量の脱落膜培地を分注してEPC培地を調製し、10ナノモルのエストラジオール、1マイクロモルの酢酸メドロキシプロゲステロン、および50マイクロモルの環状アデノシン一リン酸を50ミリリットルのチューブに加えます。残りの6日目のウェルについては、各ウェルに2ミリリットルのEPC培地を追加し、摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターで細胞を6日間インキュベートし、EPC培地を48時間ごとに交換します。6日目以降、6日目のコントロールsiRNAと6日目のSRC-2 siRNAトランスフェクション細胞ペレットをRNA溶解バッファーに回収し、リアルタイムPCRを使用したダウンストリーム解析を行います。エストロゲンによる脱落膜化の誘導 メドロキシプロゲステロンおよび環状アデノシン一リン酸は、細長い線維芽細胞から丸みを帯びた上皮細胞への間質細胞の細胞骨格再構成をもたらします。子宮内膜間質細胞のファロイジン染色は、hES脱落膜化に特徴的な活性線維細胞骨格再編成をさらに明らかにします。ビヒクルで処理されたhESでは、細胞は外観が線維芽細胞性のままですが、EPC処理された細胞では、hESは類上皮様に見えました。in vitro脱落膜化アッセイの有効性を確認するために、脱落膜化マーカーであるプロラクチンおよびインスリン様成長因子結合タンパク質-1のmRNA転写レベルを6日間にわたって評価しました。ヒト子宮内膜間質細胞の脱落膜化により、プロラクチンおよびIGFBP1レベルは時間依存的に増加しました。分泌プロラクチンレベルの時間依存的な増加は、ELISA法によるhES組織培養培地の検討によっても確認されました。ヒト子宮内膜間質細胞の脱落膜化の細胞および分子変化に対する遺伝子特異的ノックダウン効果は、48時間siRNAトランスフェクション後の培養6日目に、コントロールまたはステロイド受容体の共活性化因子である2 siRNAを用いて評価されました。コントロールsiRNAトランスフェクションされたhESは、石畳の形態学的変化や脱決定マーカーPRLおよびIGFBP1の転写レベルの増加など、適切な脱落膜化と一致する細胞および分子の変化を示しました。SRC-2 siRNAノックダウンでは、hESはコントロールのsiRNAトランスフェクトhESと比較して外観が線維芽細胞性のままであり、PRLおよびIGFBP1転写産物レベルが有意に低下しました。SRC-2 siRNAトランスフェクトhESでは、コントロールsiRNAと比較して、SRC-2転写産物レベルが有意に低下しており、この方法の遺伝子サイレンシングに対する生存性が示されています。このビデオを見れば、in-vitroでの脱落膜法やsiRNAトランスフェクションによる特定の遺伝子のノックダウンを目的として、子宮内膜生検から初代間質細胞を単離する方法を十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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ヒト多能性幹細胞のin vitro分化における絨毛細胞へ

学ぶ ヒト子宮内膜間質細胞の分離とin vitro脱分化誘導法。siRNAトランスフェクションによる遺伝子ノックダウンも可能で、着床や妊娠に関わる分子メカニズムの研究に有用です。

エストロージェン体外用ひと子宮内膜間質細胞の分離

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