濃縮と確立された皮下マウス腫瘍における腫瘍免疫と免疫のない微小のキャラクタリゼーション

この技術の全体的な目標は、固形腫瘍の免疫微小環境に寄与する免疫細胞画分と癌細胞画分の両方を同時にプロファイリングする方法を提供することです。この方法は、特定の治療後に腫瘍内でどのような免疫および非免疫の連続変化が発生するかなど、免疫腫瘍学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、腫瘍免疫成分と非免疫成分の効果的な濃縮を促進し、腫瘍の免疫状態の徹底的なプロファイリングを可能にすることです。

この方法の全体的な目標は、腫瘍免疫微小環境を効率的にプロファイリングし、治療によって誘発される変化を特定することです。毛髪の汚染を防ぐためにマウスに70%エタノールを噴霧した後、腫瘍に汚染組織がないことを確認しながら、皮下腫瘍を外科的に切除します。次に、氷上の24ウェルプレートの個々のウェルに、ウシ胎児血清を含まない1.8ミリリットルの塩基性RPMI 1640培地に各腫瘍を置きます。

すべての腫瘍を採取したら、ハサミを使用してサンプルを1立方ミリメートル未満に切断し、コラゲナーゼ-1、コラゲナーゼ-4、およびDNaseを含む新たに調製した10X解離カクテルを200マイクロリットル各ウェルに加えます。摂氏37度で1時間後、60〜100RPMの軌道プレートシェーカーで、5%FBSと2ミリモルEDTAを添加した1ミリリットルのRPMI 1640培地で反応を中和し、改造された1ミリリットルのピペットチップを使用して、各腫瘍スラリーサンプルを個々の50ミリリットルの円錐管に移し、個々の40マイクロメートルストレーナをトッピングします。10ミリリットルのシリンジプランジャーを使用して、ストレーナーを介して腫瘍片を機械的に分解し、ストレーナーが腫瘍からなくなるまで、2ミリリットルのRPMI 1640培地と5%FBSで各ストレーナを定期的にすすぎます。

すべての腫瘍が解離したら、必要に応じて各チューブに培地を追加して、すべてのサンプルを同じ容量にし、遠心分離によって細胞をペレット化します。次に、5ミリリットルの血清ピペットを使用して、チューブあたり2ミリリットルのFBS補充培地にペレットを再懸濁します。免疫細胞画分と腫瘍細胞画分を分離するには、サンプルごとに1つの15ミリリットルの円錐管の底に3ミリリットルの密度勾配培地を追加し、各チューブの側面から各グラジエントに2ミリリットルの腫瘍細胞懸濁液をゆっくりと重ねます。

腫瘍細胞懸濁液が重ねる前に十分に混合されていること、細胞懸濁液がチューブの側面にゆっくりとピペットで移動されていること、およびチューブが層の混合を防ぐためにチューブが慎重に取り扱われていることに注意します。密度勾配遠心分離によって細胞を分離し、上部培地と腫瘍浸潤白血球層を慎重に集めて、サンプルごとに1つの新しい15ミリリットルチューブに集めます。残りの密度勾配培地を廃棄し、腫瘍ペレットをチューブあたり2ミリリットルの培地とFBSに再懸濁します。

次に、すべてのサンプルを遠心分離し、腫瘍浸潤する白血球を200マイクロリットルに再懸濁し、腫瘍細胞を氷上のチューブあたり2ミリリットルの培地とFBSに再懸濁します。細胞をプレート化するには、各免疫染色パネルに96ウェルU底プレートを1枚ずつ標識し、さらに細胞カウント用のプレートを1枚ずつ標識し、単一細胞懸濁液を各染色パネルプレートとcalcプレートに分注します。サンプルあたり200マイクロリットルのダルベッコPBSで細胞を2回洗浄し、ウェルあたり50マイクロリットルのFCブロックで細胞を4°Cで20分間ブロックします。

ブロッキングインキュベーションの終了時に、50マイクロリットルの2倍濃縮細胞外ターゲティング抗体と固定可能な生存率染色剤混合物を各ウェルに加え、暗所で30分間インキュベーションします。染色インキュベーションの終了時に、サンプルをFACSバッファーで2回洗浄し、ペレットを200マイクロリットルの固定および透過化溶液に4°Cで一晩再懸濁し、光から保護します。翌日、遠心分離により細胞を採取し、続いてウェルあたり200マイクロリットルの透過化緩衝液で洗浄します。

透過化バッファー中の100マイクロリットルの細胞内抗体染色パネルで細胞を標識し、暗所で30分間インキュベーションした後、別の透過化バッファー洗浄を行います。次に、細胞をFACSバッファーで再度洗浄し、サンプルを300マイクロリットルの新鮮なFACSバッファーに再懸濁して、フローサイトメトリーによる分析を行います。実証されているように、腫瘍消化は、密度勾配培地濃縮の有無にかかわらず、フローサイトメトリーによって評価される約70〜90%の全腫瘍細胞集団の生存率をもたらします。

密度勾配培地濃縮は、非濃縮腫瘍消化と比較して、CD45陽性腫瘍浸潤白血球分画の2倍以上の増加、および免疫微小環境研究で一般的に観察される多数の免疫細胞サブセットを促進します。CD45陰性腫瘍細胞画分は、全体的な腫瘍生存率またはアポトーシス、増殖能力、およびさまざまな免疫抑制マーカーの発現など、多数の腫瘍の特徴についてもプロファイリングできます。骨髄性腫瘍およびリンパ球の免疫学的サブセットが1つの固形腫瘍全体でどのように変化するかを決定するために、腫瘍を4等分して、各切片がほぼ等しい腫瘍内領域を含み、真皮および腹膜に面する部分も等しく含まれる

その後、各断片を別々に消化し、実証されているように、さまざまな免疫細胞集団の存在について分析できます。一度習得すると、このテクニックはサンプルの数にもよりますが、4時間から8時間で完了することができます。この手順を試みる際には、細胞の生存率を維持するために迅速かつ効率的に作業することが重要です。

解離と分離のステップには、書かれたテキストだけでは習得が難しい技術が含まれているため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。この手順に続いて、フローサイトメトリーを実施して、存在量と表現型の両方の観点から、腫瘍内の細胞集団がどのように変化するかについての追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、実証済みの消化および密度勾配分離技術を使用して、確立された皮下マウス腫瘍の免疫成分と非免疫成分の両方を分離および分析する方法を十分に理解できるはずです。