Name: 濃縮と確立された皮下マウス腫瘍における腫瘍免疫と免疫のない微小のキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 学ぶ皮下マウス腫瘍における免疫と非免疫微小環境の分離・濃縮法。密度勾配遠心により腫瘍浸潤リンパ球とがん細胞画分を同時にプロファイリングし、治療誘導変化を解析する。

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によりは、国立衛生研究所の両方の一般的な医学の国立研究所 (T32GM088129) と国立歯科・頭蓋顔面研究 (F31DE026682) からの財政支援を認めています。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。このプロジェクトは、また NIH (P30 AI036211、P30 CA125123 S10 RR024574) とジョエル ・ m ・ Sederstrom の専門家の助力からの資金とフローサイトメトリーおよび薬の Baylor の大学で細胞選別の中心によって支えられました。

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) の薬の Baylor の大学によって承認されています。
1. 腫瘍の収穫と消化
注: 収穫に要する時間は 3 ~ 5 分/腫瘍と処理に必要な時間は ~ 1 + 2-3 min/腫瘍。
<ol><li>炭酸ガス吸入によるマウスを安楽死させるし、髪の汚染を防ぐために収穫前に各マウスをダウン 70% エタノールをスプレーします。マウス皮下腫瘍を削除し、腫瘍が任意の汚染組織(すなわち髪、肌、腹膜等)の無料手術。24 ウェル プレートでのウシ胎児血清 (FBS) なし基本 RPMI 1640 メディアの 1.8 mL の各腫瘍を配置します。大きな収穫の細胞を維持するために氷の寒さのプレートを維持します。 注: 不妊が必要なすべての腫瘍の解剖必要がありますバイオ セーフティ キャビネット (すなわちハサミ、鉗子、等)、生殖不能の外科ツールとして次のステップで実行します。0.5 - 1 cm 最長の直径が付いている腫瘍が最適とより大きいまたは小さい腫瘍試薬のスケーリングが必要になります。</li>
	<li>各ウェル内の3個セット 1 mm 以下に腫瘍をカットするのにはさみを使用します。</li>
	<li>コラゲナーゼを溶解することにより消化カクテル x 10 の準備で 10 mg/mL、コラゲナーゼ IV 2,500 U/mL と DNase 私 200 U/mL 基本 RPMI 1640 メディア (FBS) なしで私。 注: カクテルの消化日を前もって準備して格納できます-20 ° c;ただし、酵素は一度解散時間をかけて活動を失うので、長期の保管はお勧めしません。</li>
	<li>私、コラゲナーゼ IV、DNase コラゲナーゼを含む解離カクテル × 10 の 200 μ l 添加 1 mm の3個の各ウェルに。</li>
	<li>軌道プレート シェーカーを使用しての 60-100 rpm で軽く振りながら 37 ° C で 1 時間のダイジェスト サンプルを許可します。 注: 酵素消化中に 37 ° C までの温度の上昇は、免疫細胞の活性化を引き起こす可能性があります。</li>
	<li>1 時間後の各ウェルに 5 %fbs と 2 mM EDTA 添加 RPMI 1640 メディアの 1 つの mL を追加することによって反応を中和します。</li>
	<li>50 mL の遠心管の上に座っている 40 μ m セル ストレーナーに腫瘍消化、残りの腫瘍部分をピペットします。 注: は、ストレーナーに腫瘍消化を容易に転送する 1 mL ピペット チップの先端をカットします。</li>
	<li>こし器を通して腫瘍部分を機械的に細かく分けた 10 mL シリンジのプランジャーを使用します。定期的に 2 ml の補われた RPMI 1640 メディアのストレーナーを洗浄 (5% を含む FBS) セル ストレーナーが腫瘍のクリアされるまでを繰り返します。 注: メディア総数の約 4-10 mL は十分に腫瘍のストレーナーを洗浄するための十分なはずです。 注: は、細胞生存率を維持するためにすべてのサンプルのこのステップを完了するまで氷にサンプルを配置します。</li>
	<li>補足 RPMI 1640 メディアを使用して同じボリュームに各 50 mL 遠心管を調整します。 注: ボリュームの調整は、遠心力のバランスをとるため重要です。遠心分離機の損傷やけがこのステップをスキップ可能性があります。</li>
	<li>(5 分、805 × g、4 ° C) 細胞懸濁液を遠心分離、培養上清を破棄し、再補足 RPMI 1640 メディアの 2 mL で中断します。 注: セルの集計は次の再懸濁しますにくい遠心分離フォームがあります。続行する前にそれを破るため急速に 5 mL の血清ピペットとミックスを使用します。</li>
</ol>2. 免疫と腫瘍細胞分画の分離
注: この手順の所要時間は約 1 時間です。
<ol><li>密度勾配媒体の 3 mL を 15 mL 遠心管の下部に追加します。準備し、ラベルを各腫瘍に対する十分なチューブ。</li>
	<li>層の 2 つの層の混合を防ぐために管の側をゆっくりとピペッティングによる密度勾配媒体上に腫瘍細胞懸濁液 2 mL。</li>
	<li>慎重に遠心分離機で 805 x g は、20 ° C、ないブレーキで 20 分間スピン多層チューブを配置します。 注: 適切なバランスを確認し、遠心分離中にブレーキを使用しないことを非常に重要です。このプロセスを中断する層の混合になります、サンプルの完全回復が困難になります。</li>
	<li>(ゴマ) 層と転送ピペットを使用して新しい 15 mL チューブにトップ メディア層白血球浸潤腫瘍を慎重に転送します。すべての残りの密度勾配媒体を破棄し、補われた RPMI 1640 の 2 mL でチューブの下部に腫瘍ペレットを再懸濁します。 注: 遠心分離後がありますそれぞれに対応する下に上から 4 つの可視レイヤー: 腫瘍細胞ペレット密度勾配媒体、ティルズ メディア。図 2さまざまな層の例についてはを参照してください。</li>
	<li>両方のティルを遠心し、腫瘍のサンプル チューブ (5 分、805 × g、4 ° C) を分離し、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>200 μ L のティル サンプルと補われた RPMI 1640 メディアの 2 mL で腫瘍ペレットを再懸濁します。生存率を維持するために氷の上を保ちます。</li>
</ol>3. めっきと染色
注: めっきに必要な時間は 30 s/腫瘍;表面の汚損のための所要時間は 1 時間です。細胞内染色に要する時間は 40 分です。フローサイトメトリー解析は 1 - を必要な時間 4 分/腫瘍。
<ol><li>準備し、各免疫染色パネル、セルの追加プレート用ラベル 96 ウェルの U 底プレートをカウントします。 注: 通常、3枚のプレートは、合計で用意をしています: リンパ球に焦点を当てたパネル プレート、骨髄性に焦点を当てたパネル プレート、セル数プレート。</li>
	<li>分注染色のそれぞれに単一細胞懸濁液パネル プレートとセットのボリューム カウント板に。 メモ: カウント板により正確なセル人口それぞれの染色パネルに追加されるセルの合計数を計算するため使用されます。96 ウェル プレート サンプリングおよび容積測定分析機能を備えたフローサイトは各サンプルの μ L あたりのセル数を提供し、したがって、各染め色のパネルに追加されるセルの数を計算できます。数板は 4 ° C、FACs バッファーで洗浄で一晩固定後次の日を得ることができる (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2 %fbs)、FACs バッファーの設定ボリュームで再と。</li>
	<li>(5 min, 805 × g、4 ° C) を遠心分離し、任意の無料の FBS を削除する各リンス間清を破棄してサンプルあたりダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 200 μ L で 2 回細胞を洗ってください。</li>
	<li>Fc ブロックの 50 μ L マルチ チャンネル ピペットを使用してサンプルをミックスし、4 ° C で 20 分間インキュベートを追加します。</li>
	<li>2 倍の 50 μ L 濃縮細胞ターゲティング抗体と修正可能な生存汚れの混合物、マルチ チャンネル ピペットを使用してミックス、RT または 4 ° C で暗闇の中で 30 分間インキュベートを追加します。 注: 抗体の正確な染色条件は、製造元によって異なります。すべての染色希釈は、修正可能性色素の飽和を防ぐためにない追加の FBS の DPBS でなければなりません。この原稿で使用されている染色パネルの最適な希釈液のためのテーブルの材料/機器を参照してください。Fc ブロックに追加される染色容量 100 μ L の濃度を染色 × 最終的な 1 を提供するために 2 倍の濃度では、抗体と修正可能性染色液を用意しています。</li>
	<li>(5 分、805 × g、4 ° C) を遠心分離し、各リンス間培養上清を破棄して FACs バッファーで 2 回サンプルを洗います。</li>
	<li>1 x 固定/透過液 200 μ L で再懸濁します、光から保護 4 ° C で一晩インキュベートします。 注: 実験を一時停止できる一晩この時点: 光から保護 4 ° c のサンプルを保ちます。</li>
	<li>次の日は (5 分、805 × g、4 ° C) プレートを遠心し、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>濯ぎ 1 回 x 透過バッファー、遠心分離機 (5 分、805 × g、4 ° C)、1 の 200 μ L で、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>1 x 透過バッファーの準備 1 x 集中細胞抗体染色パネルの 100 μ L を追加し、RT または 4 ° C (製造元から染色の推奨によって異なります) で暗闇の中で 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>1 x 透過とバッファー (5 分、805 × g、4 ° C) は、上澄みを廃棄したらすすぎとリンス FACs バッファーと 2 回目 (PBS 2 %fbs)。</li>
	<li>FACs バッファーの 300 μ L のサンプルを再懸濁します (PBS 2 %fbs)、流れの cytometry チューブにサンプルを転送およびフロー フローサイトメトリー分析を実施します。</li>
</ol>

<ol><li>Fouad, Y. A., Aanei, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5446472/">Revisiting the hallmarks of cancer.</a> American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).</li>
<li>Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment.</a> Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).</li>
<li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+and+its+role+in+promoting+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth.</a> Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).</li>
<li>Chiou, V. L., Burotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudoprogression+and+Immune-Related+Response+in+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors.</a> Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).</li>
<li>Menon, S., Shin, S., Dy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Cancer+Immunotherapy+in+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors.</a> Cancers. 8 (12), 106(2016).</li>
<li>Denkert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Associated+Lymphocytes+As+an+Independent+Predictor+of+Response+to+Neoadjuvant+Chemotherapy+in+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effects+of+ablative+radiation+on+local+tumor+require+CD8%2B+T+cells%3A+changing+strategies+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment.</a> Blood. 114 (3), 589-595 (2009).</li>
<li>Stakheyeva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+immune+component+of+tumor+microenvironment+in+the+efficiency+of+cancer+treatment%3A+perspectives+for+the+personalized+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy.</a> Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).</li>
<li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histo-Cytometry%3A+A+Method+for+Highly+Multiplex+Quantitative+Tissue+Imaging+Analysis+Applied+to+Dendritic+Cell+Subset+Microanatomy+in+Lymph+Nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes.</a> Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).</li>
<li>Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cell+Subsets+in+Tumor-Bearing+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).</li>
<li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li>
<li>Casadevall, A., Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigorous+Science%3A+A+How-To+Guide%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Rigorous Science: A How-To Guide.</a> mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CyTOF+supports+efficient+detection+of+immune+cell+subsets+from+small+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples.</a> Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).</li>
<li>Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Mass+Cytometry+%28CyTOF%29+for+Functional+and+Phenotypic+Analysis+of+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells.</a> Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).</li>
<li>Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Tumor-infiltrating+Leukocyte+Subsets+in+a+Subcutaneous+Tumor+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

時間は、多様で複雑な細胞成分と分子で構成されます。最近の証拠は、この環境の正確な特性評価が治療の成功または障害のよりよい理解を提供できる治療抵抗性のメカニズムを特定するを助けてもいいこと示唆しています。たとえば、エフェクター免疫反応を軽減することができ、免疫療法の効果を破棄する腫瘍様々 な免疫細胞 (すなわちMDSCs、T 細胞など) のレベルを上げます。一方、エフェクター免疫個体群 (など腫瘍特異 cd8 T 細胞、ナチュラル キラー細胞、ヘルパー T 細胞) の腫瘍存在感を増しては治療成功の強力な予測をすることができます。腫瘍の免疫状態を正確に表す続けて別の特性は彼ら自身腫瘍細胞の表現型の特徴です。これは様々 な免疫抑制配位子、酵素、または downregulating エフェクター免疫応答を目指した分子の式が含まれます (すなわち、 PD L1、PD L2 indolamine 2, 3-ジオキシゲナーゼ、窒素酸化物、等)。一緒に取られて、これは固体腫瘍の免疫と腫瘍細胞機能の正確かつ広範な評価の必要性を示しています。
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抑制時間は、最近、癌の特徴として認識されているし、開発、進行固形腫瘍癌の保護に重要な役割を果たすだけでなく、免疫療法1感受性を緩和する知られています。時間は、多数の細胞サブセットと腫瘍の免疫学的状態に重要な洞察力を提供するすべての表現型で構成されます。これらの免疫のサブセットは、一緒に自然免疫と適応免疫応答2,3の大半を構成するリンパ球や骨髄由来の細胞にさらに層化できます。がん免疫療法の分野の最近の進歩は免疫療法戦略(すなわち、免疫チェックポイント阻害剤、キメラ抗原受容体の T 細胞等)に耐久性のある癌を誘発する可能性があることを示しています。リグレッションただし、固形腫瘍の癌4,5で比較的効果が残ります。多数のグループでは、時間治療成功6、7、遊ぶことができる、したがって、特に中心前臨床設定の新しい免疫療法を正確に評価する必要があるいる、重要なハードルを示されている、変調または8時間を克服する機能。
通常時間を特徴付ける現在の努力はどちらか顕微鏡を利用またはフローサイトメトリー抗体の免疫細胞サブセットと9,10代の機能を識別するための戦略を分類と共に。これらの 2 つの戦略顕微鏡により細胞サブセットの空間感謝されフローサイトメトリー高スループット、携帯電話の変更のより広範な定量化一意に異なる情報を提供します。今まで 7 つのパラメーターをサポートできる、スペクトル イメージング システムの最適化多重免疫組織染色の最近の改善にもかかわらず限定パネル サイズ広範なレベル プロファイリング免疫困難は、したがってこの手法はしばしば予約詳細解析に焦点を当てた。その結果、フローサイトメトリーはプロファイリング技術最も広く使われている免疫の一つであります。時間評価技術の広範な使用、にもかかわらず処理と染色に使用される方法は非常に変数です。多くの場合プロトコル利用酵素の分離腫瘍 (すなわちコラゲナーゼ、DNase、等) と単一細胞懸濁液を達成するために手動の解離メソッドの後に抗体染色と分析7。それぞれの方法の利点があるにもかかわらず多数のグループはこれらテクニック11まで誘導することができます大規模な変動を示しています。これにより、同じマウス腫瘍モデルを評価する際にも、腫瘍微小環境のプロファイリングのクロス研究比較が非常に困難になります。さらに、これらのメソッドは、腫瘍細胞を評価する限られた可能性を提供し、腫瘍免疫侵入、独立していないコンポーネント消化後両方のコンポーネントが点在するので。サンプル量は、マルチパネル染色とまれな免疫学的サブセットを特徴付けるように試みとが主要な問題の分析を制限 (すなわち、腫瘍特定の T 細胞)12。質量 cytometry など (CyTOF)、飛行時間によってフローサイトメトリー最新技術は、42 の独立したパラメーター13以上のパネル デザインをサポートいくつかのシステムと細胞サブセットの高次元の表現型解析を許可します。CyTOF 免疫プロファイリング技術の驚異的なパワー、にもかかわらず、それは費用、解析の専門知識、および機器へのアクセスのため限られています。さらに、CyTOF プロトコルの多くは、信号対雑音比の14を改善するために免疫のサブセットの浄化をお勧めします、したがって私たちの濃縮方法を使用できることを提案 CyTOF 分析データの品質を向上させるための上流。
本腫瘍微小環境消化と腫瘍免疫を組み込む方法は侵入分離解析について述べる。このメソッドの目的は、腫瘍免疫浸潤、腫瘍微小環境の広範な評価の腫瘍細胞の一部分の独立した高スループット プロファイルを許可することです。このメソッドを使用すると、さらに示す全腫瘍の分析の重要性と皮下腫瘍モデル発見された重要な免疫不.全体的にみて、このメソッドより正確かつ一貫して比較できますサンプル間腫瘍内免疫細胞サブセットの豊か、独立した腫瘍細胞と腫瘍の免疫分数のプロファイリングが可能になります。

<table><tbody><tr><td>6週齢から12週齢の雄C57BL/6マウス</td><td>ジャクソン研究所&nbsp;</td><td>N/A</td><td>私たちの腫瘍研究で使用されたマウス</td></tr><tr><td>MEER マウス 同系がん細胞株</td><td>共同研究者から取得&nbsp;</td><td>N/A</td><td>E6/E7 HPV抗原発現マウス扁桃上皮がん細胞株&nbsp;</td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール70%&nbsp;</td><td>EMDミリポア&nbsp;</td><td>PX1840</td><td></td></tr><tr><td>マウス手術ツールキット</td><td>ワールド精密機器</td><td>マウスキット</td><td>主に必要なものはハサミ、ピンセット、メスだけです。&nbsp;</td></tr><tr><td>24ウェルプレート&nbsp;</td><td>デンビルサイエンティフィック株式会社</td><td>T1024</td><td>または任意の24ウェルフラットボトムプレート。</td></tr><tr><td>RPMI-1640 メディア</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ I&nbsp;</td><td>EMD Milipore</td><td>234153</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004189</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>低速オービタルシェーカー</td><td>BioExpress (サプライヤー:Genemate)&nbsp;</td><td>S-3200-LS</td><td>または任意のオービタルシェーカー。</td></tr><tr><td>体温調節インキュベーター</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>13-255-27</td><td>またはその他の温度調節インキュベーター</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8192</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>AMRESCO</td><td>E177</td><td></td></tr><tr><td>1 mL ピペットとチップ</td><td>エッペンドルフ</td><td>13-690-032</td><td>またはその他のピペットとチップ</td></tr><tr><td>40 um セルストレーナー</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック・サイエンティフィ</td><td>ック 22363547</td><td></td></tr><tr><td>50 mL遠心チューブ</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>15 mL コニカルチューブ</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Luer-Lok注射器(針なし</td>) <td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep Density Gradient Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipettes</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>P7212</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルU底プレート</td><td>デンビルサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>D8573</td><td></td></tr><tr><td>FoxP3転写因子染色バッファーセット&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>00-5523-00</td><td>固定/透過化バッファーおよび透過化バッファー</td></tr><tr><td>サーモレギュレート遠心分離機</td><td>エッペンドルフ&nbsp;</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Flow Cytometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td>96ウェル細胞体積計数用&nbsp;</td></tr><tr><td>精製ラット抗マウスCD16/CD32(マウスBD fcブロック)&nbsp;クローン2.4G2&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>553141</td><td>Fc Block</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34962</td><td>Fixable viability stain</td></tr><tr><td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>47-0451-80</td><td></td></tr><tr><td>TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>CD8-&アルファ;抗体 (KT15), PE</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53473&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Monoclonal 抗体 (GK1.5)、PE-Cyanine5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-0041-81</td><td></td></tr><tr><td>MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal 抗体 (M5/114.15.2)、 Alexa Fluor 700</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>56-5321-82</td><td></td></tr><tr><td>CD11c Monoclonal 抗体 (N418)、PE-Cyanine5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 Monoclonal 抗体 (BM8)、eFluor 450</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>48-4801-80</td><td></td></tr><tr><td>CD11b モノクローナル抗体 (M1/70), APC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6G (Gr-1) モノクローナル抗体 (RB6-8C5), PE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>CD274 (PD-L1, B7-H1) モノクローナル抗体 (MIH5), PE-Cyanine7</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25-5982-80</td><td></td></tr><tr><td>CD273 (B7-DC) モノクローナル抗体 (122), PerCP-eFluor 710</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46-9972-82</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 モノクローナル抗体 (B56), BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563755</td><td></td></tr></tbody></table>

濃縮と確立された皮下マウス腫瘍における腫瘍免疫と免疫のない微小のキャラクタリゼーション

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

腫瘍免疫微小環境 (時間) は最近特に免疫療法のための固形腫瘍の治療反応の重要な仲介人として認識されています。免疫療法の臨床的進歩は、再現可能な方法で正確かつ完全に特徴付ける腫瘍とその関連付けられた免疫潜入の必要性を強調表示します。腫瘍の酵素消化とフローサイトメトリーによる解析により、多数の免疫細胞サブセットおよび表現型; の広範な評価しかし、分析の深さは多くの場合パネルのデザインと大きな腫瘍のサンプルを取得する必要があります興味のまれな免疫個体を観察する fluorophore 制限によって制限されます。したがって、分離・非免疫腫瘍コンポーネントから腫瘍免疫潜入を豊かに高スループットの効果的な方法を開発しました。記載されている腫瘍消化と遠心密度ベースの分離技術により、腫瘍と腫瘍の個別特性免疫潜入分数と細胞生存率を保持し、したがって、腫瘍の広範な評価を提供します免疫学的状態。このメソッドは、さらに一貫性のある全体の腫瘍免疫学的プロファイリング技術の必要性を示す固形腫瘍広範なの空間的免疫不均一を特徴付けるために使用されました。全体として、このメソッドは固体マウス皮下腫瘍の免疫学的特性に対する効果的かつ適応手法を提供します。よい腫瘍の免疫学的機能を特徴付けるためのこのツールの使用など、新しい免疫療法戦略の前臨床評価。

プロトコルで説明したように、非免疫腫瘍コンポーネントから分離までの大きな利点を示した。また、記載されているメソッドを使用して確立された固形腫瘍の重要な免疫学的不均一性を示す.
多くの腫瘍解離技術の大きな問題として、過酷な消化条件 (すなわち、上昇温度、不十分な栄養供給など) の結果として最もよくのサンプルの実行可能性の損失。説明消化法の使用またはなければ密度勾配中の濃縮を提供します約 70-90% 総細胞生存フローサイトメトリー (図 1A) により評価しました。似たような目は、こまで観察された濃縮し、腫瘍を豊かに分数、このメソッドが (図 1図 2C</s...

ここで分離し、確立された皮下腫瘍における腫瘍免疫と免疫のない微小環境のコンポーネントを豊かにする方法をについて説明します。この手法は、腫瘍免疫浸潤と非免疫腫瘍腫瘍免疫微小環境の包括的な評価を可能にすることができます独立した分析のためことができます。

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

この技術の全体的な目標は、固形腫瘍の免疫微小環境に寄与する免疫細胞画分と癌細胞画分の両方を同時にプロファイリングする方法を提供することです。この方法は、特定の治療後に腫瘍内でどのような免疫および非免疫の連続変化が発生するかなど、免疫腫瘍学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、腫瘍免疫成分と非免疫成分の効果的な濃縮を促進し、腫瘍の免疫状態の徹底的なプロファイリングを可能にすることです。この方法の全体的な目標は、腫瘍免疫微小環境を効率的にプロファイリングし、治療によって誘発される変化を特定することです。毛髪の汚染を防ぐためにマウスに70%エタノールを噴霧した後、腫瘍に汚染組織がないことを確認しながら、皮下腫瘍を外科的に切除します。次に、氷上の24ウェルプレートの個々のウェルに、ウシ胎児血清を含まない1.8ミリリットルの塩基性RPMI 1640培地に各腫瘍を置きます。すべての腫瘍を採取したら、ハサミを使用してサンプルを1立方ミリメートル未満に切断し、コラゲナーゼ-1、コラゲナーゼ-4、およびDNaseを含む新たに調製した10X解離カクテルを200マイクロリットル各ウェルに加えます。摂氏37度で1時間後、60〜100RPMの軌道プレートシェーカーで、5%FBSと2ミリモルEDTAを添加した1ミリリットルのRPMI 1640培地で反応を中和し、改造された1ミリリットルのピペットチップを使用して、各腫瘍スラリーサンプルを個々の50ミリリットルの円錐管に移し、個々の40マイクロメートルストレーナをトッピングします。10ミリリットルのシリンジプランジャーを使用して、ストレーナーを介して腫瘍片を機械的に分解し、ストレーナーが腫瘍からなくなるまで、2ミリリットルのRPMI 1640培地と5%FBSで各ストレーナを定期的にすすぎます。すべての腫瘍が解離したら、必要に応じて各チューブに培地を追加して、すべてのサンプルを同じ容量にし、遠心分離によって細胞をペレット化します。次に、5ミリリットルの血清ピペットを使用して、チューブあたり2ミリリットルのFBS補充培地にペレットを再懸濁します。免疫細胞画分と腫瘍細胞画分を分離するには、サンプルごとに1つの15ミリリットルの円錐管の底に3ミリリットルの密度勾配培地を追加し、各チューブの側面から各グラジエントに2ミリリットルの腫瘍細胞懸濁液をゆっくりと重ねます。腫瘍細胞懸濁液が重ねる前に十分に混合されていること、細胞懸濁液がチューブの側面にゆっくりとピペットで移動されていること、およびチューブが層の混合を防ぐためにチューブが慎重に取り扱われていることに注意します。密度勾配遠心分離によって細胞を分離し、上部培地と腫瘍浸潤白血球層を慎重に集めて、サンプルごとに1つの新しい15ミリリットルチューブに集めます。残りの密度勾配培地を廃棄し、腫瘍ペレットをチューブあたり2ミリリットルの培地とFBSに再懸濁します。次に、すべてのサンプルを遠心分離し、腫瘍浸潤する白血球を200マイクロリットルに再懸濁し、腫瘍細胞を氷上のチューブあたり2ミリリットルの培地とFBSに再懸濁します。細胞をプレート化するには、各免疫染色パネルに96ウェルU底プレートを1枚ずつ標識し、さらに細胞カウント用のプレートを1枚ずつ標識し、単一細胞懸濁液を各染色パネルプレートとcalcプレートに分注します。サンプルあたり200マイクロリットルのダルベッコPBSで細胞を2回洗浄し、ウェルあたり50マイクロリットルのFCブロックで細胞を4°Cで20分間ブロックします。ブロッキングインキュベーションの終了時に、50マイクロリットルの2倍濃縮細胞外ターゲティング抗体と固定可能な生存率染色剤混合物を各ウェルに加え、暗所で30分間インキュベーションします。染色インキュベーションの終了時に、サンプルをFACSバッファーで2回洗浄し、ペレットを200マイクロリットルの固定および透過化溶液に4°Cで一晩再懸濁し、光から保護します。翌日、遠心分離により細胞を採取し、続いてウェルあたり200マイクロリットルの透過化緩衝液で洗浄します。透過化バッファー中の100マイクロリットルの細胞内抗体染色パネルで細胞を標識し、暗所で30分間インキュベーションした後、別の透過化バッファー洗浄を行います。次に、細胞をFACSバッファーで再度洗浄し、サンプルを300マイクロリットルの新鮮なFACSバッファーに再懸濁して、フローサイトメトリーによる分析を行います。実証されているように、腫瘍消化は、密度勾配培地濃縮の有無にかかわらず、フローサイトメトリーによって評価される約70〜90%の全腫瘍細胞集団の生存率をもたらします。密度勾配培地濃縮は、非濃縮腫瘍消化と比較して、CD45陽性腫瘍浸潤白血球分画の2倍以上の増加、および免疫微小環境研究で一般的に観察される多数の免疫細胞サブセットを促進します。CD45陰性腫瘍細胞画分は、全体的な腫瘍生存率またはアポトーシス、増殖能力、およびさまざまな免疫抑制マーカーの発現など、多数の腫瘍の特徴についてもプロファイリングできます。骨髄性腫瘍およびリンパ球の免疫学的サブセットが1つの固形腫瘍全体でどのように変化するかを決定するために、腫瘍を4等分して、各切片がほぼ等しい腫瘍内領域を含み、真皮および腹膜に面する部分も等しく含まれるようにすることができる。その後、各断片を別々に消化し、実証されているように、さまざまな免疫細胞集団の存在について分析できます。一度習得すると、このテクニックはサンプルの数にもよりますが、4時間から8時間で完了することができます。この手順を試みる際には、細胞の生存率を維持するために迅速かつ効率的に作業することが重要です。解離と分離のステップには、書かれたテキストだけでは習得が難しい技術が含まれているため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。この手順に続いて、フローサイトメトリーを実施して、存在量と表現型の両方の観点から、腫瘍内の細胞集団がどのように変化するかについての追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、実証済みの消化および密度勾配分離技術を使用して、確立された皮下マウス腫瘍の免疫成分と非免疫成分の両方を分離および分析する方法を十分に理解できるはずです。

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本稿では、腫瘍に浸潤する白血球の高度に精製された集団を単離するためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは複雑な腫瘍組織から細胞を単離するための収率および純度を高めるためにミルテニーバイオテクプロトコルから構成されている。...

原発腫瘍から免疫細胞の分離

このビデオは、皮下腫瘍が不完全に切除されたマウスモデルでのアジュバントまたは追加療法のテストを示しています。腫瘍を部分的に切除したマウスは、制御性T細胞の抗細胞傷害性タンパク質を標的とする抗体で治療され、腫瘍の再増殖を抑制し、効果的なアジュバント療法が示唆されます。...

皮下腫瘍が不完全切除されたマウスモデルにおける補助療法

このプロトコルは、マウス腫瘍モデルにおける腫瘍微小環境内の白血球サブセットの詳細な評価方法を記述しています。ケメリン発現B16メラノーマ細胞を同系マウスに皮下移植した。その後、腫瘍微小環境の細胞を染色し、フローサイトメトリーで解析することで、詳細な白血球サブセット解析が可能になりました。...

皮下腫瘍モデルにおける腫瘍浸潤白血球サブセットの評価

私たちは、腫瘍微小環境（TME）を模倣するために透過性の微多孔質膜インサートを適応させました。このモデルは混合細胞培養で構成されており、蛍光標識や細胞選別を使用せずに、高度に濃縮された個々の細胞集団の簡易な生成を可能にし、正常またはストレス条件下でTME内の細胞間コミュニケーションを研究することができます。...

濃縮細胞集団を生成し、細胞間コミュニケーションを調べるための簡単​​な方法：腫瘍微小環境のミミック

頭頸部扁平上皮癌同所性同種モデルマウスを開発するための再現可能な方法をご紹介します。腫瘍免疫の浸潤、リンパ節転移、貧しい分化壊死を含む病気の臨床的病理組織学的機能について示します。担癌マウスでは、嚥下障害、顎の変位、減量など臨床的に関連する症状を起こします。...

腫瘍免疫プロファイル用のマウスおよび治療応答評価における扁平上皮癌細胞の粘膜接種

このプロトコルは、正形外科膵腫瘍の外科的生成と、新たに単離されたマウス膵腫瘍の急速な消化について説明する。消化後、生存可能な免疫細胞集団は、フローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン検出のためのT細胞のex生体内刺激を含むさらなる下流分析に使用することができる。...

直交トピック膵腫瘍の生成と腫瘍浸潤T細胞細胞傷害のEx生体内特性評価

ここでは、マウス腫瘍モデルにおける腫瘍固有および末梢由来腫瘍浸潤リンパ球の特性評価のための腫瘍移植プロトコールを提示する。フローサイトメトリーによるレシピエント由来免疫細胞の流入の特異的追跡は、抗腫瘍免疫応答中のこれらの細胞の表現型および機能的変化のダイナミクスを明らかにする。...

マウスにおける腫瘍浸潤CD8+ T細胞の動態を評価するための腫瘍移植

HNSCCの同系マウスモデルにおけるIL-1αの抗腫瘍活性および関連する毒性を研究するための標準プロトコルが記載されている。...

ポリ無水物IL-1αナノ粒子の 生体内 抗腫瘍活性の評価

このプロトコルは、Flt3L発現B16-F10黒色腫を伴う細胞ベースの腫瘍ワクチン接種を使用した癌免疫療法モデルを提示します。このプロトコルは、培養腫瘍細胞の調製、腫瘍移植、細胞照射、腫瘍増殖の測定、腫瘍内免疫細胞の分離、フローサイトメトリー分析などの手順を示しています。...

造血サイトカインによる腫瘍ワクチン接種を用いた実験的黒色腫免疫療法モデル

このプロトコルは、免疫腫瘍学研究のためのヒト免疫系(HIS)マウスの生成について概説しています。このモデルに移植されたヒト腫瘍に対するヒト免疫療法を試験するためのこのモデルの使用における指示および考慮事項は、腫瘍に対するヒト免疫系の応答を特徴付けることに重点を置いたものとして提示されている。...

ヒト腫瘍を有するヒト化マウスモデルにおける癌免疫療法の試験

腫瘍内免疫療法への関心が高まる中、利用しやすく実用的な腫瘍モデルの選択が不可欠です。皮下腫瘍は確立しやすいですが、可視化や操作は困難です。本プロトコルでは、視認性とアクセス性を向上させる皮内腫瘍の生成方法を説明しています。...

ミウリがん腫瘍内免疫療法研究における皮内腫瘍の着床モデル

学ぶ皮下マウス腫瘍における免疫と非免疫微小環境の分離・濃縮法。密度勾配遠心により腫瘍浸潤リンパ球とがん細胞画分を同時にプロファイリングし、治療誘導変化を解析する。

濃縮と確立された皮下マウス腫瘍における腫瘍免疫と免疫のない微小のキャラクタリゼーション

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