プロ線維性シグナル伝達の抑制を促進する誘導心筋細胞マウス胚性線維芽細胞のリプログラミング因子を介した

この方法は、心筋形成を促進または修復する経路を特定するなど、心臓のリプログラミング分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、以前に発表された方法よりも高い効率で機能的な誘導心筋細胞を生成できることです。これらの化学的心疾患は、心筋細胞の喪失と心機能の障害をもたらします。

したがって、この技術は、線維芽細胞を機能的に誘導された心筋細胞に変換することにより、高度な修復に役立つ可能性があります。レトロウイルスの産生を開始するには、PE培地でPlatinum EまたはPE細胞を増殖させます。バイオセーフティレベル2のキャビネットに、10CMの皿に選択マーカーを添えて補充します。

2日ごとに、細胞を1〜4回、または1〜5回目の希釈で通過させます。計画されたトランスフェクションの1日前に、10CMの培養皿にPE細胞を10MLの成長培地に播種し、その後、皿を前後に静かに揺らします。細胞が均一に分布するように、皿をインキュベーターに慎重に置き、24時間インキュベートします。

トランスフェクション当日は、GHMT2Mカクテルを1.5 MLチューブに加えます。次に、360マイクロリットルの還元血清培地を別の1.5MLチューブに加えます。続いて、還元された血清培地に36マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加え、チューブを静かにフリックして混合します。

室温で5分間インキュベートします。このステップで使用するトランスフェクション試薬はプラスチックに結合します。トランスフェクションの効率を避けるため、トランスフェクション試薬をピペットで直接還元された血清培地にピペットで移し、ピペットの先端をチューブ壁に触れないように注意してください。

次に、還元された血清培地トランスフェクション試薬混合物を、GHMT2M DNAカクテルを含むチューブに加えます。チューブを静かにフリックして混合し、室温で15分間インキュベートします。最後に、トランスフェクション反応混合物をPE細胞に滴下します。

皿を10〜15秒間静かに回転させます。トランスフェクションした細胞を摂氏37度で16〜20時間インキュベートします。次に、60MMの皿をコラーゲンでコーティングし、摂氏37度で最低2時間インキュベートします。

次に、解凍したばかりのマウス胚性線維芽細胞(MEF)をコラーゲンコーティングされた皿に分注します。そして、成長培地を60MM皿あたり4MLの最終容量に加えます。皿をそっと揺らし、インキュベーターに入れます。

MEFをめっきする際には、細胞を均一にめっきすることが重要です。皿を渦巻かせると、メッキにムラが出ることがありますので、避けてください。代わりに、皿を前後にそっと揺らし、インキュベーターに慎重に置きます。

PE細胞トランスフェクションの24時間後、30 MLシリンジを使用して、細胞によって生成されたレトロウイルス培地を回収します。レトロウイルス培地の最初のコレクションを45 μmの注ぎ口フィルターに通し、50 MLの円錐管に通します。次に、PE細胞を移動させないように注意しながら、10MLの新鮮な増殖培地を皿の壁に加えます。

細胞を摂氏37度でさらに24時間インキュベートします。次に、ウイルス上清を含む50MLの円錐管に、1ミリリットルあたり10MGの7.2マイクロリットルの臭化メトリン形質導入試薬を追加します。次に、MEFから培地を吸引し、収穫したばかりのレトロウイルス培地4MLを皿に加えます。

PE細胞のトランスフェクション後48時間で、細胞を摂氏37度で24時間インキュベートし、レトロウイルス培地を回収し、最初の採取とまったく同じ方法で形質導入を行います。レトロウイルス培地の2回目の収集後にPE細胞を廃棄し、レトロウイルス培地と接触するすべての材料に10%漂白剤を添加します。

インキュベーション後、MEFからレトロウイルス培地を吸引し、05マイクロモルのTGFベータ1型受容体阻害剤を含む4MLのICM培地を追加します。ICM媒体は、さらに使用するまで2日ごとに交換してください。免疫染色を開始するには、14日目に再プログラムされたMEFからICM培地を吸引します。

次に、12ウェルプレートのウェルごとに1MLの氷冷PBSで細胞を1回洗浄します。次に、PBSを吸引し、500マイクロリットルの2%パラホルムアルデヒドを加えて細胞を固定し、室温で10分間インキュベートします。パラホルムアルデヒドを吸引した後、1MLのPBSで細胞を3回洗浄します。

PBSを吸引した後、02%Triton X 100を500マイクロリットル加え、室温で15分間インキュベートします。Triton X 100を吸引した後、500マイクロリットルの10%ウマ血清で細胞を室温で30分間ブロックします。

次に、ウマ血清を吸引し、希釈した一次抗体を500マイクロリットル加えます。室温で1時間インキュベートします。一次抗体を吸引した後、PBS1MLで3回洗浄します。

PBSを最後に洗浄した後、希釈した二次抗体500μLを添加します。プレートをホイルで包み、暗所で室温で1時間インキュベートします。最後に、二次抗体を吸引し、1MLのPBSで3回洗浄します。

プレートをホイルで包み、イメージングが完了するまで摂氏4度で保存します。この方法は、MEFの心筋細胞への高効率な変換を示しています。代表的なフローサイトメトリー解析では、形質導入後9日目を追加すると、細胞の約70%で活性化された心筋トロポニンTの発現が示されています。

同様に、心臓のα-アクチニン発現は、GFP形質導入コントロールと比較した場合、細胞の約55%で観察されます。さらに、形質導入の2週間後に実施された心臓マーカーの免疫染色では、細胞の大部分がトロポニンI、アルファアクチニン、およびトロポニンTを発現していることが示されました。さらに、ICMをα-アクチニン、またはトロポニンTおよびCx43と共標識すると、隣接する細胞間にギャップ結合が形成されていることが明らかになります。

GHMT2M形質導入とA83O1による治療により、MEFの一部が8日目までに拍動細胞に再プログラムされます。11日目には、1平方センチメートルあたり約10000個の拍動細胞が観察されます。自発的なカルシウム過渡現象は、鼓動する心筋細胞で検出されます。

βアドレナリン作動薬イソプロテレノールの添加は、自発的なカルシウム過渡現象の頻度を有意に増加させる。対照的に、L型カルシウムチャネル遮断薬ニフェジピンの扇動は、カルシウム過渡現象の頻度を有意に減少させる。このビデオを見た後、線維芽細胞を機能的で誘導された心筋細胞に高効率で再プログラムする方法をよく理解しているはずです。

このプロトコルに従って、RNAシーケンシングやチップシーケンシングなどの他の方法を使用して、全体的な遺伝子発現やクロマチンの状態など、心臓のリプログラミング中に変化する追加の質問に答えることができます。レトロウイルスを扱うことは危険な場合があることを忘れないでください。バイオセーフティレベル2のキャビネットでの作業、個人用保護具の着用、すべてのレトロウイルス廃棄物の適切な廃棄などの予防措置は、このプロトコルを実行する際に常に実施する必要があります。