Name: プロ線維性シグナル伝達の抑制を促進する誘導心筋細胞マウス胚性線維芽細胞のリプログラミング因子を介した (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶ心筋細胞への線維芽細胞リプログラミング法。GATA4、Hand2、Mef2c、Tbx5、miR-1、miR-133の発現とTGF-βシグナル阻害により、7日で収縮する心筋細胞を60%効率で誘導し、心臓再生医療への応用が期待されます。

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この研究は、ベッチャー財団のウェッブ ワーミング生物医学研究プログラム、アメリカ心臓協会の科学者開発補助 (13SDG17400031) コロラド大学部門医学優れた初期のキャリアからの資金によって支えられました。学者プログラムは、コロラド州部の循環器バーロー Nyle 基金、大学と NIH (カンザス) に R01HL133230。A.S.R は、線維症研究 & 翻訳 (CFReT) の NIH/NCATS コロラド CTSA 許可番号 TL1TR001081 とコロラド大学コンソーシアムから博士フェローシップによって支持されました。本研究は、がんセンター助成金 (P30CA046934)、皮膚疾患研究コア助成金 (P30AR057212)、コロラド大学アンシュッツ メディカル キャンパスで流れ Cytometry コアによっても支えられました。

動物を必要とするすべての実験は、動物介護制度と UC デンバー アンシュッツ医療キャンパス利用委員会によって承認されました。
1. MEFs の分離
<ol><li>E13 の C57BL/6 妊娠マウスを購入します。一晩出荷。</li>
	<li>承認された IACUC プロトコルによると母親を安楽死させる (ex: 頚部転位続いて ~1.3 L/min CO2動物が死んだが表示されるまで)</li>
	<li>70% エタノールで母親をスプレーし、腹腔内を開きます。胚を含む子宮角を取り外して滅菌 PBS で 10 cm 皿に置きます。</li>
	<li>胚を解放する胚嚢に切開を行います。10 cm の滅菌 PBS の皿をきれいにする胚を転送します。徹底的にすすいでください。</li>
	<li>肝臓の下ボディをカットし、頭と上半身を破棄します。内臓を取り外して廃棄します。残りのティッシュを滅菌 PBS のきれいな 10 cm 皿に転送し、バイオ セーフティ レベル 1 または 2 のキャビネットにプレートを転送します。清潔で乾燥した 10 cm 皿にすべて胚からの組織を結合し、細かくみじん切り。</li>
	<li>みじん切りにした胚に 0.25% トリプシン/1 mM EDTA の 6 mL を追加します。組織を分割するピペットによって数回をカップ刻んだ。5% CO2と 37 ° C で 40 分間インキュベートします。</li>
	<li>成長媒体 (表 1) で細胞を再懸濁します。メディアのボリュームは、胚の数に基づいて調整されます。一般に、1.2 胚あたり約 25 mL の成長媒体の比率を使用します。</li>
	<li>プレート 15 cm 皿に再懸濁細胞の 25 mL。24 h 後メディアを吸引し、新鮮な成長媒体の 25 mL を各プレートに追加します。</li>
	<li>72 時間後 15 cm 皿ごとに 0.25% トリプシン/1 mM EDTA の 2 mL を追加します。細胞を培養皿からデタッチ、15 mL の培地でトリプシンを不活化し、50 mL スチロール円錐管の細胞を収集します。室温で 160 x gで 3 分の細胞を遠心します。70 μ m 孔携帯こし器を通って成長培地とフィルターで細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>診断を使用してセルをカウントし、凍結中 200 万セル因数で MEFs を凍結 (10 %dmso、25 %fbs ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) で/高血糖)-80 ° C で液体窒素を使用する準備ができるまでの 24 h とストア後セルを転送します。 注: MEFs グローバル遺伝子発現プロファイリングを実行した RNA 塩基配列解読によってこのプロトコルを使用してを分離 (RNA seq) 携帯認証を確保するため。エンコードの MEF のセルからの RNA シーケンス データ受入番号 GSE93454 と NIH 遺伝子発現オムニバス (GEO) からがダウンロードされました。MEFs 私達によって使用のための RNA シーケンス遺伝子発現データは、受入番号 GSE71405 と NIH の GEO で沈殿させた。これら 2 つのデータ セットは、一般的な遺伝子記号によると併合しました。発現データがログ変換され、MEFs エンコード MEFs、発現データの散布図が生成され、線形回帰直線 (図 1 a) と合います。このプロトコルを使用して分離された MEFs はこれらの他の実験室によって孤立した分子と似ています。</li>
</ol>2. レトロ ウイルスと MEFs の伝達の生産
注: このセクションのすべての手順を実行する必要がありますに行なうバイオ セーフティ レベル 2 キャビネット。このプロトコルは、レトロ ウイルスの伝達を利用して、少なくとも 20 分図 1B参照プログラムし直すためのタイムラインの 10% の漂白剤でウイルスのメディアを含むすべての廃棄物を扱うなどの予防措置、安全を確認します。
<ol><li>
プラチナ E (PE) 細胞株を用いたレトロ ウイルスの生産
	<ol>
<li>市販 PE PE 媒体 (表 1) 含むブラストサイジン ・ ピュロマイシン選択マーカー式ギャグ- のように細胞を維持する効率的なレトロ ウイルス粒子生産36 のポルとenv遺伝子.1:4、1:5 2 日で通過細胞。これはレトロ ウイルスの生産量を減らすことができます、セルの混雑を防ぐために注意してください。</li>
		<li>-1 日トランスフェクション前に約成長媒体 (表 1) 16-20 h で 10 cm 皿あたり 5 x 10 の6セルを種子 (メッキその他の標準的な細胞文化皿サイズの密度の表 2を参照)。慎重にロックの料理、前後数回と 37 ° C、5% CO2インキュベーターもめっき分布を確保するために慎重に (トランスフェクション前に最適なめっき密度は図 1を参照)。 注: 生成されたレトロ ウイルス粒子を含む培地が MEFs を殺さないようにトランスフェクション前選択マーカーの無料媒体のプレート PE セルに注意してください。</li>
		<li>0 日、DNA をトランスフェクションに備えます。10 cm 皿 transfection のためそれぞれのリプログラミング因子 2 μ g を追加-GATA4 Hand2、Mef2c、Tbx5、ミール 1 とミール-133 (GHMT2m)-1.5 mL チューブに。 注: は transfect 他標準セル培養皿サイズに必要な DNA の量を拡張する表 2を参照してください。</li>
		<li>別 1.5 mL チューブ 360 μ L 低下した血清中のメディアを追加します。低下した血清中メディアに直接 36 μ L のトランスフェクション試薬を加えます。軽くチューブをフリックし、5 分間室温でインキュベートします。 注: 低トランスフェクション効率を避けるためには、低下した血清中メディアに直接トランスフェクション試薬を慎重に追加します。</li>
		<li>GHMT2m DNA カクテルに減らされた血清のメディア/トランスフェクション試薬の混合物を追加します。軽くチューブをフリックし、15 分間室温でインキュベートします。ボルテックスにかけないでください。</li>
		<li>PE のセルに反応混合物を滴下し追加、穏やかに 10-15 秒のためのメディアを旋回し、37 ° C、5% CO2インキュベーターに配置。 注: メーカーによると PE 細胞生成 10 の平均価6 107感染ユニット/mL。このプロトコルは約 2 × 106感染症ユニット/mL 24 h と 6 x 106感染症ユニット/mL 平均 4 の MOI のため 48 h を生成します。GFP/下流のトランスフェクションは、トランスフェクション/伝達効率の場合、必要なの代理としても使用トランスフェクションの効率は、48 h (図 1) で 90% を超えると予想されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MEFs の伝達
	<ol>
<li>0 日にコラーゲンと 37 ° C、5% CO2インキュベーター、少なくとも 2 時間の場所で料理をコートします。</li>
		<li>液体窒素と雪解けから MEFs を削除します。培地に 60 mm ディッシュ プレート 0.2 x 106セルです。ゆっくり確実にロック プレート均一にめっき分布にインキュベーター (メッキその他の標準的な細胞文化皿サイズの密度の最適なめっき密度および表 2 図 1を参照)。 注: これらのめっき密度分離 MEFs; の複数のバッチをテストされています。MEFs 表示生存率を大幅に侵害、しない限り、細胞播種密度を調整することは必要ではありません。</li>
		<li>1 日目、24 h 後トランスフェクション PE 細胞によって生成されたレトロ ウイルスの媒体を収集するために 30 mL の注射器を使用します。50 mL の円錐管に 0.45 μ m 孔サイズ フィルターを媒体を通過します。6 μ G/ml の最終的な集中に hexadimethrine 臭化トランスフェクション試薬を追加します。慎重にセルの変位を防ぐために培養皿の壁にピペッティング メディアによって PE セルに 10 mL の新鮮な成長媒体を追加します。</li>
		<li>MEFs から培地を吸引し、それぞれの料理に新鮮な収穫のレトロ ウイルスの培地 4 mL を追加します。MEFs をインキュベーターに戻ります。レトロ ウイルス粒子を中和するためにウイルスの媒体との接触のすべての材料を 10% の漂白剤を追加します。</li>
		<li>2 日目、48 時間後のトランスフェクション 2.2.2 と 2.2.3 の手順を繰り返します。PE セルは、レトロ ウイルスの中の 2ndコレクションの後破棄されます。 注: 不要なレトロ ウイルスを中和するために、少なくとも 20 分の破棄された PE セルに対する 10% の漂白剤を追加します。</li>
		<li>3 日目、MEFs から培地を吸引し、補充する 0.5 μ M を含む 4 mL iCM 培地 (表 1) と A-83-01 TGF-β I 型受容体阻害剤。ICM 媒質 A-83-01 2 日おきを補充します。 注: 伝達制御として GFP を使用する場合式によって期待される 90% を超えるこの時点 (図 1)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 心臓マーカーのフローサイトメトリー
<ol><li>9 日から吸引中は、死んだ細胞や残骸を削除する 1 × PBS の MEFs、洗浄 (1 x) を再プログラム。</li>
	<li>37 ° C で 1 mL 0.25% トリプシン EDTA/5 分を追加します。光学顕微鏡を使用してセルをチェックし、料理を振るセル接続されたまま、細胞を切り離すまで 37 ° C で 5 以上の分を孵化させなさい。</li>
	<li>70 μ m 孔携帯こし器を通って 5 %fbs とフィルターを含む 1 × PBS のセルを洗浄します。</li>
	<li>部屋の温度と、ペレットから液を吸引で 3 分の 160 x gで遠心分離機します。 注: セルの収量を増加するには、細胞ペレットの上約 50 μ L 液体をまま。</li>
	<li>セルを 1 %bsa を含む 500 μ L 1 × PBS で洗浄します。</li>
	<li>氷の上の 0.2 mL/1, 000 セル セル固定溶液 20 分間を修正します。</li>
	<li>1 x 冷たいパーマ/洗浄バッファーの 1 つの mL を追加します。 注: 製造元のソリューションは 10 倍です。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 160 x gで細胞を遠心し、上清を吸引します。</li>
	<li>追加時間 3.7 ・ 3.8 の手順を繰り返します。2nd洗浄後そのまま次のステップに進むまたは一晩 4 ° C で細胞を保ちます。</li>
	<li>5% ヤギ血清とロバ血清室温で 30 分間パーマ/洗浄バッファー x 1 の 100 μ L でブロックします。</li>
	<li>希釈した一次抗体 100 μ L を追加します。 注: このプロトコルのマウス トロポニン T (レバレッジ) で標識した細胞とマウス α-アクチニン (レバレッジ) の割合を定量化する細胞心筋筋節の主要なコンポーネントのために積極的。一次抗体室温で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>4 ° C で 5 m 160 x gで細胞を遠心、上清を吸引し、冷たいパーマ/洗浄バッファーで 2 倍を洗ってください。</li>
	<li>希釈した二次抗体の 100 μ L を追加します。 注: このプロトコルの細胞は抗マウス 647 nm 二次抗体 (レバレッジ) で標識しました。エンド オーバー エンド チューブ回転子に室温の 45 分の二次抗体を孵化させなさい。ホイル チューブをラップすることによって光から細胞を保護します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 160 x gで細胞を遠心、上清を吸引し、冷たいパーマ/洗浄バッファーで 2 倍を洗ってください。</li>
	<li>PBS で 1 %bsa の 1 つの mL を追加し、FACS をすぐに実行します。 注: は、FACS を実行するときに実行可能なセルを最初ゲート前方散乱対側散布を生成します。また、ライブを識別し、死んだ細胞のセルを修正する前に市販のライブ/死細胞染色を使用します。</li>
</ol>4. プログラムし直された MEFs の免疫染色
<ol><li>14 日目から吸引中は書き換え MEFs、1 mL の 1 x の氷冷 PBS で洗浄 (1 x)。 注: 免疫染色用抗体ソリューション ボリュームを最小限に抑えるため 12 ウェル プレートで実行されたリプログラミングします。24 ウェル プレートも使用できます。単に半分すべて次のボリューム。</li>
	<li>吸引、室温で 10 分間 500 μ L 2% パラホルムアルデヒドとセルを修正します。</li>
	<li>吸引し、1 mL の 1x PBS (常温洗浄あたり 5 分) で 3 回細胞を洗ってください。</li>
	<li>500 μ L 0.2% 透過性試薬による PBS で室温で 15 分間セルを permeabilize します。</li>
	<li>吸引し、500 μ L 10% 馬血清 PBS で室温で 30 分間でブロックします。</li>
	<li>吸引し、1 時間室温で希釈した一次抗体の 500 μ L で孵化させなさい。 注: このプロトコル細胞がマウス トロポニン T または α-アクチニン (各 1: 400) が付いたし、共同コネキシン 43 (1: 400) またはトロポニンに私 (1: 400) ラベル付け。</li>
	<li>一次抗体を吸引し、1 mL の 1x PBS (常温洗浄あたり 5 分) にて 3 回洗浄します。</li>
	<li>吸引し、500 μ L の希釈した二次抗体と室温で 1 時間インキュベートします。 注: このプロトコルの抗マウス 555 nm 二次抗体 (1:800) トロポニン T または α-アクチニンを認識すると反うさぎ 488 nm 二次抗体 (1:800) コネキシン 43 またはトロポニン i. また認識するラベルされた細胞、核染色ヘキスト (1:10, 000)。暗闇の中でインキュベートし、光から細胞を保護します。</li>
	<li>二次抗体を吸引し、1 mL の 1x PBS (常温洗浄あたり 5 分) にて 3 回洗浄します。光から細胞を守るし、4 ° C で保存に箔でプレートをラップします。</li>
	<li>3 ch 落射蛍光顕微鏡を使用してイメージ。</li>
</ol>5. カルシウム イメージング
注: 場合は 10 倍の倍率でイメージング、標準的な細胞培養皿とプレートに適していますカルシウム イメージング。高倍率でイメージング ガラス ガラス底培養皿の細胞をめっきすることが必要です。
<ol><li>培地を吸引し、2 mL (、6 ウェル プレート) が変更されたタイロード液 (140 mM NaCl、KCl、1.8 mM CaCl2, 5 mM 1 mM MgCl2、10 mM グルコース、10 mM HEPES、0.1 %bsa および 1% のピルビン酸、pH 7.4) を追加 5 μ M を含む Fura 2 だと 0.1% プルロニック F-127 (D14 t を打つことにo D20) iCMs。37 ° C で 30 分間インキュベートします。 注: は、蛍光指示薬の焼入を防ぐために光から細胞を守る。</li>
	<li>フラ 2 の解消のエステル化を許可する部屋の温度で 30 分間 2 mL タイロード液で細胞を洗う時。</li>
	<li>340 ディスク共焦点顕微鏡を回転画像 nm と 380 nm Slidebook 5.5 Ca2 +イメージング ソフトウェアを使用して。室温でイメージングを実行します。</li>
	<li>カルシウム濃度は 340 で蛍光強度の比を使用して計算されます 380 で蛍光強度上 nm nm。</li>
	<li>必要な場合治療 1 または 2 μ M イソプロテレノールや 10 μ M iCMs ニフェジピン カルシウム基準カルシウム トランジェントをイメージングした後の処理を操作します。ローカル セルとイメージする化合物を追加します。</li>
</ol>

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本研究では、直接初期化因子プロ線維性シグナル伝達経路の抑制と組み合わせる GHMT2m の配信を介して機能 iCMs に線維芽細胞を再プログラムする高効率戦略について説明します。フローサイトメトリー、蛍光イメージング、カルシウム イメージング、およびこのプロトコルでセルの大半を示す細胞数を打つことを使用して成功の書き換えを受けるし、CM リネージュ運命を採用します。我々 は以前に、抗線維化添加化合物の TGF-β 型を含む私受容体阻害剤 A-83-01 利回り GHMT2m 単独でことを示すと伝達に比べて打撃 iCMs 数のおよそ 6 増加プロ線維信号は心臓リプログラミングに強力な内因性バリアです。このシステムは、したがって、心筋; を支配するメカニズムを調査するため薬物をスクリーニングするため活かされるA-83-01 と一緒に小分子添加心筋の負の制御因子が明らかに。逆に、GHMT2m だけに小分子添加心筋正電圧レギュレータを解明できます。これらの正と負のレギュレータは CM の分化を支配するメカニズムの解明と、心筋のより良い理解は、さらに効率的なリプログラミングと成熟プロトコルに 。
<p class="jove_conten...

虚血性心疾患は、アメリカ合衆国1死の主要な原因です。およそ 800,000 のアメリカ人の経験最初または再発性心筋梗塞 (MI)1年につき。MI、次は、心筋 (CMs) と活性化心臓線維芽細胞による心筋の線維化の死は心臓機能2,3を損ないます。MI の後心不全の進行は主大人 CMs4、5の悪い再生能力により元に戻すこと。現在臨床治療が病気の進行を遅らせる、将来心臓イベント6,7,8,9のリスクを減少させる治療はできないのための病気の進行を逆します。CMs 心筋硬塞後10を再生成します。マイル失意のうち、次の患者を治療するために浮上している新規細胞治療、MI をこれまで続く心臓に幹細胞を提供する臨床試験は決定的でない再生潜在的な11,12,を示されています。13,14,15,16,17,18。
最初高橋 & 山中で示した 4 つの転写因子の過剰発現による線維芽細胞からひと由来の誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) の生成は、細胞療法19で新たなブレークスルーにドアを開けた。これらの細胞は、すべて 3 つの胚葉19に区別できる、CMs の大規模な番号を生成するためのいくつかの非常に効率的な方法は、以前20,21を示されています。派生した CMs (腰-CMs) 心筋を勉強する強力なプラットフォームを提供しています、心臓の損傷を修復するための重要な含意があるかもしれない。腰 CMs 現在奇形腫形成22, 懸念のため並進ハードルに直面し、その未熟な性質があります pro 不整脈23。直接他のセルタイプに線維芽細胞をリプログラミングの興味を引き起こした hiPSCs に線維芽細胞をプログラムし直します。家田らは、低効率24どまる Tbx5 (GMT)、Mef2c、GATA4 心臓系統に直接再プログラム化により、線維芽細胞で過剰発現を示した。リプログラミング効率 Hand2 (GHMT)25の付加と改善されました。これらの初期の研究から多くの出版物を示していることは26,27,28,29, 要因追加転写リプログラミング因子カクテルを変更34は改善につながる小さな分子やマイクロ Rna32,33, クロマチン修飾子30,31リプログラミング効率および/または誘導された心筋細胞のような細胞 (iCMs の成熟).
ここでは、高効率でマウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs) から iCMs を生成する詳細なプロトコルを提供します。以前示したカクテル GHMT ミール 1 とミール-133 (GHMT2m) の追加で大幅に改善され、さらに向上、プロ線維増殖因子 β (TGF-β) シグナリングを変換を含むシグナルまたは Rho 関連蛋白質キナーゼ (ロック) シグナル伝達経路が抑制35です。このプロトコルを使用して、ことを示す細胞の約 60% エクスプレス心臓トロポニン T (cTnT)、50% 約表現 α-アクチニン暴行細胞数が多いが、早ければ次の要因と治療をリプログラミングの伝達日 11 観察できます。TGF-β と I 型受容体阻害剤 A-83-01 です。さらに、これらの iCMs はギャップ結合蛋白質コネキシン 43 を含むを表し、自発収縮とカルシウム濃度を示します。このマークが以前の研究と比較して効率をリプログラミングの改善は心後梗塞に残っている内因性の細胞集団から CMs を再生成する可能性を示しています。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 マウス</td><td>Charles River's Laboratory</td><td>027</td><td>MEF 分離用</td></tr><tr><td>プラチナ E (PE) 細胞</td><td>Cell Biolabs, INC</td><td>RV-101</td><td>レトロウイルス生産用</td></tr><tr><td>DMEM 高グルコース</td><td>Gibco</td><td>SH30022.</td><td>iCM、PE、および成長培地</td>のFSコンポーネント</tr><tr><td>ミディアム 199</td><td>Life Technologies</td><td>11150-059</td><td>iCM培地の成分</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ジェミニ</td><td>100106</td><td>iCM、PE、および成長培地の成分</td></tr><tr><td>ドナーホース血清</td><td>ジェミニ</td><td>100508 500</td><td>iCM培地の成分</td></tr><tr><td>MEM必須アミノ酸、50X</td><td>Life Technologies</td><td>11130051</td><td>iCMの成分media</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム溶液, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td>iCM培地およびカルシウムイメージング用成分</td></tr><tr><td>MEM非必須アミノ酸, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td>iCM培地の成分</td></tr><tr><td>MEMビタミン液, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11120-052</td><td>iCM培地の成分</td></tr><tr><td>インスリン-トランスフェリン-セレン</td><td>ギブコ</td><td>41400045</td><td>iCM メディアのコンポーネント</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>iCM メディアのコンポーネント</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>iCM、PE、および成長メディアのコンポーネント</td></tr><tr><td>GlutaMAX (L-グルタミンサプリメント)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>iCM、PE、および成長メディアのコンポーネント</td></tr><tr><td>Blasticidin-HCl</td><td>Life Technologies</td><td>A11139-03</td><td>PE メディアのコンポーネント</td></tr><tr><td>ピューロマイシン二塩酸塩</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>A11138-03</td><td>PE培地の成分</td></tr><tr><td>0.25% トリプシン/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>培養皿から細胞を剥離するため</td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>R&Dシステム - Tocris</td><td>2939/10</td><td>TGF-&βを阻害する細胞を治療し、シグナル伝達 - 高効率のリプログラミングを促進します。0.5&microで使用してください。M</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>85190</td><td>A-83-01および凍結培地</td></tr><tr><td>SureCoat</td><td>Cellutron</td>の成分の希釈および保存用 <td>SC-9035</td><td>プレートMEFsへのディッシュコーティング用</td></tr><tr><td>FuGENE 6 トランスフェクション試薬</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>Opti-MEM 還元血清培</td>地 <td>Gibco</td><td>11058-021</td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-GATA4</td><td></td><td></td><td>リプログラミング因子を含むプラスミド</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Hand2</td><td></td><td></td><td>リプログラミング因子を含む プラスミド</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Mef2c</td><td></td><td></td><td>リプログラミング因子を含む プラスミド</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Tbx5</td><td></td><td></td><td>リプログラミング因子を含む</td></tr><tr><td>プラスミド pBabe-X miR-1</td><td></td><td></td><td>を含む プラスミドリプログラミング因子</td></tr><tr><td>pBabe-X miR-133</td><td></td><td></td><td>リプログラミング因子</td></tr><tr><td>pBabe-X GFP</td><td></td><td></td><td>リプログラミング因子</td></tr><tr><td>ポリブレン (臭化ヘキサジメトリン)</td> を含むプラスミド<td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td>ウイルス誘導用。6 &microの濃度で使用します。g/mL</td></tr><tr><td>真空フィルター + ボトル (0.22 &micro;m pores)</td><td>Nalgene</td><td>&nbsp;〒569-0020&nbsp;</td><td>メディアのフィルタリング用</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>BD真空洗浄器実験器具&nbsp;</td><td>309654</td><td>ウイルスろ過用</td></tr><tr><td>0.45 & micro;m フィルター</td><td>セルトリート</td><td>229749</td><td>ウイルスろ過用</td></tr><tr><td>70 & マイクロ;mセルストレーナー</td><td>ファルコン&nbsp;</td><td>352350</td><td>MEF単離およびフローサイトメトリー</td></tr>用 <tr><td>Cytofix/Cytoperm Solution</td><td>BD</td><td>554722</td><td>フローサイトメトリー用細胞の固定および透過化用</td></tr><tr><td>パーマ/ウォッシュバッファー&nbsp;</td><td>BD</td><td>554723</td><td>フローサイトメトリー用細胞洗浄用</td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td>細胞洗浄用</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>VWR</td><td>0332-100g</td><td>フローサイトメトリーおよびカルシウムイメージング用</td></tr><tr><td>ヤギ血清シ</td><td>グマ&nbsp;</td><td>G9023</td><td>フローサイトメトリー用ブロッキング細胞用</td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Sigma</td><td>D9663-10mg</td><td>フローサイトメトリー用ブロッキング細胞用</td></tr><tr><td>マウストロポニン T</td><td>Thermo Scientific</td><td>ms-295-p</td><td>1:400 IF, 1:200 フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>マウス &α;-アクチニン</td><td>Sigma</td><td>A7811L</td><td>1:400 IF, 1:200 フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>ウサギ コネキシン 43</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C6219</td><td>1:400</td></tr><tr><td>IF ウサギ トロポニン I</td><td>PhosphoSolutions</td><td>2010-TNI</td><td>1:400 IF</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>62249</td><td>1:10000 IF</td></tr><tr><td>Alexa 488、ウサギ</td><td>Life Technologies</td><td>A-11034</td><td>1:800 IF</td></tr><tr><td>Alexa 555、マウス</td><td>Life Technologies</td><td>A-21422</td><td>1:800 IF</td></tr><tr><td>Alexa 647、マウス</td><td>Life Technologies</td><td>A-31571</td><td>1:200 フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>27色ZE5 フローサイトメーター&nbsp;</td><td>FACSパラ</td>ホルムアルデヒドシグマP6148-500mgのための<td>Bio-RAD</td><td></td></tr> IF<tr><td>のための細胞を固定するため Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td>IFのEVOS&tradeのための細胞の透過化のため</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>;FLカラーイメージングシステム</td><td>Thermo Scientific System Thermo Scientific</td><td></td><td>AMEFC4300 For IF</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020-5000</td><td>カルシウムイメージング用</td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>395</td><td>カルシウムイメージング用</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C614-500</td><td>カルシウムイメージング用</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>VWR</td><td>97061-352</td> カルシウム<td>イメージング用</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマ</td><td>G7528-250g</td><td>カルシウムイメージング用</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>H4034-500g</td><td>カルシウムイメージング用</td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ F1221</td><td>カルシウムイメージング</td></tr><tr><td>用 フルロニック F-127</td><td>シグマ</td><td>P2443-250g</td><td>カルシウムイメージング用</td></tr><tr><td>ニフェジピン</td><td>シグマ</td><td>N7634-1G</td><td>iCMの破壊カルシウム過渡現象用 - 10 &マイクロ;M</td></tr><tr><td>イソプロテレノール</td><td>シグマ</td><td>I6504-1g</td><td>iCM のカルシウム過渡現象の数を増やす場合 - 1-2 &micro で使用します。M</td></tr><tr><td>マリアナ諸島 スピニングディスク 共焦点顕微鏡</td><td>3i</td><td></td><td>カルシウムイメージング用</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>デコンラボラトリーズ</td><td>2801</td><td></td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>クロロックス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td></td><td></td></tr> 227261 <tr><td>15 mL コニカルチューブ</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td></td><td></td></tr> 188271 <tr><td>15 cm 細胞培養皿</td><td>ファルコン</td><td></td><td></td>353025</tr><tr><td>10 cm細胞培養皿</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>60 mm細胞培養皿</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル細胞培養プレート</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>657160&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>12ウェル細胞培養プレート</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>665180&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル細胞培養プレート</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>662160&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

プロ線維性シグナル伝達の抑制を促進する誘導心筋細胞マウス胚性線維芽細胞のリプログラミング因子を介した

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

別に 1 つの体細胞のタイプのトランス分化には、モデルおよび人間の病気の治療に莫大な可能性があります。以前研究示されている、マウス胚は、真皮、そして心臓線維芽細胞を誘導心筋細胞様細胞 (iCMs) に書き換えることができます GATA4、Hand2 Mef2c など心原性転写因子の過剰発現を介して、Tbx5の in vitroとin vivoの両方。ただし、これらの以前の研究は、比較的低効率を示しています。心臓機能障害を復元するために iCMs の成熟と効率を向上させる心臓のリプログラミングを支配するメカニズムを解明する必要があります。
以前、リプログラミング効率を劇的にプロ線維のシグナル伝達の阻害に増加を示した。ここでは、リプログラミング効率 60% を達成する方法を詳しく説明します。また、フローサイトメトリー、蛍光イメージングは、リプログラミング効率とプログラムし直された線維芽細胞の成熟を定量化するカルシウム イメージングなどいくつかの方法をについて説明します。ここで詳細なプロトコルを使用して、心臓のリプログラミングの正と負のレギュレータを決定する解明を引き受けることができます。これらの研究は、リプログラミング効率と人間の心臓病を治療する細胞治療法につながる可能性の成熟を促進するためにターゲットすることができますシグナリング経路を識別できます。

約 70% と心筋トロポニン T を発現する細胞の心筋 α-アクチニン、日 9 にフローサイトメトリーによる定量化を発現する細胞の約 55% の iCMs 上記及び図 1Bリプログラミングの戦略を使用して、生成しました。次の GHMT2m の伝達 (図 2 aとB)。さらに、細胞の大部分はエクスプレス心臓トロポニン T、トロポニンは心筋 α-アクチニンと次の伝達 (図 2およびD) 日 14 にギャップ接合マーカー コネキシン 43。高倍率画像では、明確に定義された筋節構造形成とギャップ結合隣接細胞 (白い矢印、図 2 D) 形成を明らかにします。さらに、自発的な収縮とカルシウム濃度は、iCMs (図 3 a<...

機能的な心筋細胞発現 Tbx5、ミール 1 とミール 133 Mef2c、Hand2 GATA4 (GHMT2m) と一緒に TGF-β シグナルの阻害を介してプライマリ胚性線維芽細胞を再プログラムする手法をご紹介します。我々 のプロトコル 60% までの 7 日間後の伝達も早く拍動心筋細胞を生成する効率。

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

この方法は、心筋形成を促進または修復する経路を特定するなど、心臓のリプログラミング分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、以前に発表された方法よりも高い効率で機能的な誘導心筋細胞を生成できることです。これらの化学的心疾患は、心筋細胞の喪失と心機能の障害をもたらします。したがって、この技術は、線維芽細胞を機能的に誘導された心筋細胞に変換することにより、高度な修復に役立つ可能性があります。レトロウイルスの産生を開始するには、PE培地でPlatinum EまたはPE細胞を増殖させます。バイオセーフティレベル2のキャビネットに、10CMの皿に選択マーカーを添えて補充します。2日ごとに、細胞を1〜4回、または1〜5回目の希釈で通過させます。計画されたトランスフェクションの1日前に、10CMの培養皿にPE細胞を10MLの成長培地に播種し、その後、皿を前後に静かに揺らします。細胞が均一に分布するように、皿をインキュベーターに慎重に置き、24時間インキュベートします。トランスフェクション当日は、GHMT2Mカクテルを1.5 MLチューブに加えます。次に、360マイクロリットルの還元血清培地を別の1.5MLチューブに加えます。続いて、還元された血清培地に36マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加え、チューブを静かにフリックして混合します。室温で5分間インキュベートします。このステップで使用するトランスフェクション試薬はプラスチックに結合します。トランスフェクションの効率を避けるため、トランスフェクション試薬をピペットで直接還元された血清培地にピペットで移し、ピペットの先端をチューブ壁に触れないように注意してください。次に、還元された血清培地トランスフェクション試薬混合物を、GHMT2M DNAカクテルを含むチューブに加えます。チューブを静かにフリックして混合し、室温で15分間インキュベートします。最後に、トランスフェクション反応混合物をPE細胞に滴下します。皿を10〜15秒間静かに回転させます。トランスフェクションした細胞を摂氏37度で16〜20時間インキュベートします。次に、60MMの皿をコラーゲンでコーティングし、摂氏37度で最低2時間インキュベートします。次に、解凍したばかりのマウス胚性線維芽細胞(MEF)をコラーゲンコーティングされた皿に分注します。そして、成長培地を60MM皿あたり4MLの最終容量に加えます。皿をそっと揺らし、インキュベーターに入れます。MEFをめっきする際には、細胞を均一にめっきすることが重要です。皿を渦巻かせると、メッキにムラが出ることがありますので、避けてください。代わりに、皿を前後にそっと揺らし、インキュベーターに慎重に置きます。PE細胞トランスフェクションの24時間後、30 MLシリンジを使用して、細胞によって生成されたレトロウイルス培地を回収します。レトロウイルス培地の最初のコレクションを45 μmの注ぎ口フィルターに通し、50 MLの円錐管に通します。次に、PE細胞を移動させないように注意しながら、10MLの新鮮な増殖培地を皿の壁に加えます。細胞を摂氏37度でさらに24時間インキュベートします。次に、ウイルス上清を含む50MLの円錐管に、1ミリリットルあたり10MGの7.2マイクロリットルの臭化メトリン形質導入試薬を追加します。次に、MEFから培地を吸引し、収穫したばかりのレトロウイルス培地4MLを皿に加えます。PE細胞のトランスフェクション後48時間で、細胞を摂氏37度で24時間インキュベートし、レトロウイルス培地を回収し、最初の採取とまったく同じ方法で形質導入を行います。レトロウイルス培地の2回目の収集後にPE細胞を廃棄し、レトロウイルス培地と接触するすべての材料に10%漂白剤を添加します。インキュベーション後、MEFからレトロウイルス培地を吸引し、05マイクロモルのTGFベータ1型受容体阻害剤を含む4MLのICM培地を追加します。ICM媒体は、さらに使用するまで2日ごとに交換してください。免疫染色を開始するには、14日目に再プログラムされたMEFからICM培地を吸引します。次に、12ウェルプレートのウェルごとに1MLの氷冷PBSで細胞を1回洗浄します。次に、PBSを吸引し、500マイクロリットルの2%パラホルムアルデヒドを加えて細胞を固定し、室温で10分間インキュベートします。パラホルムアルデヒドを吸引した後、1MLのPBSで細胞を3回洗浄します。PBSを吸引した後、02%Triton X 100を500マイクロリットル加え、室温で15分間インキュベートします。Triton X 100を吸引した後、500マイクロリットルの10%ウマ血清で細胞を室温で30分間ブロックします。次に、ウマ血清を吸引し、希釈した一次抗体を500マイクロリットル加えます。室温で1時間インキュベートします。一次抗体を吸引した後、PBS1MLで3回洗浄します。PBSを最後に洗浄した後、希釈した二次抗体500μLを添加します。プレートをホイルで包み、暗所で室温で1時間インキュベートします。最後に、二次抗体を吸引し、1MLのPBSで3回洗浄します。プレートをホイルで包み、イメージングが完了するまで摂氏4度で保存します。この方法は、MEFの心筋細胞への高効率な変換を示しています。代表的なフローサイトメトリー解析では、形質導入後9日目を追加すると、細胞の約70%で活性化された心筋トロポニンTの発現が示されています。同様に、心臓のα-アクチニン発現は、GFP形質導入コントロールと比較した場合、細胞の約55%で観察されます。さらに、形質導入の2週間後に実施された心臓マーカーの免疫染色では、細胞の大部分がトロポニンI、アルファアクチニン、およびトロポニンTを発現していることが示されました。さらに、ICMをα-アクチニン、またはトロポニンTおよびCx43と共標識すると、隣接する細胞間にギャップ結合が形成されていることが明らかになります。GHMT2M形質導入とA83O1による治療により、MEFの一部が8日目までに拍動細胞に再プログラムされます。11日目には、1平方センチメートルあたり約10000個の拍動細胞が観察されます。自発的なカルシウム過渡現象は、鼓動する心筋細胞で検出されます。βアドレナリン作動薬イソプロテレノールの添加は、自発的なカルシウム過渡現象の頻度を有意に増加させる。対照的に、L型カルシウムチャネル遮断薬ニフェジピンの扇動は、カルシウム過渡現象の頻度を有意に減少させる。このビデオを見た後、線維芽細胞を機能的で誘導された心筋細胞に高効率で再プログラムする方法をよく理解しているはずです。このプロトコルに従って、RNAシーケンシングやチップシーケンシングなどの他の方法を使用して、全体的な遺伝子発現やクロマチンの状態など、心臓のリプログラミング中に変化する追加の質問に答えることができます。レトロウイルスを扱うことは危険な場合があることを忘れないでください。バイオセーフティレベル2のキャビネットでの作業、個人用保護具の着用、すべてのレトロウイルス廃棄物の適切な廃棄などの予防措置は、このプロトコルを実行する際に常に実施する必要があります。

suppression-pro-fibrotic-signaling-potentiates-factor-mediated

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

心原性誘導効率を定量化するために修飾されたマウス胚性幹細胞ベースのアッセイ

ここでは、レトロウイルスを媒介としたGata4、Tbx5、Mef2cのポリシストロニックコンストラクトによる送達を使用したiCMの生成のためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、効率と品質が向上した比較的均質な再プログラムされた細胞集団をもたらし、iCMリプログラミングの将来の研究に価値があります。...

GATA4、MEF2C及びTBX5の最適な比率を表現ポリシストロン構築物を用いて誘導心筋細胞の改善された世代

ここに示されているのは、脱細胞化した心臓組織の細胞外マトリックスの超微細構造を視覚化する方法です。...

細胞外マトリックスを視覚化するために浸軟組織の電子顕微鏡をスキャンします

このプロトコルは、成体マウス心筋細胞の再現性のある単離と長期培養のための段階的な方法を説明しています。これは、高収率、純度、および生存率を備えています。...

成体マウスの心筋細胞の単離、培養および形質導入

ここで説明するプロトコルは、転写因子の最小セットの過剰発現によるマウス胚性線維芽細胞における造血プログラムの誘導を詳述しています。この技術は、造血、血液疾患、造血幹細胞移植の将来の研究のためのプラットフォームを提供するために、人間のシステムに変換される可能性があります。...

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

我々は、心筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞およびパッチ媒介性サイトカインの送達と細胞注射を組み合わせることにより、移植細胞の生着を改善する配送方法に、ヒト人工多能性幹細胞を分化するための3つの新規かつより効率的なプロトコルを提示します。...

多能性幹細胞は、心筋の修復のための心臓細胞を派生します

この原稿は、レトロウイルスが媒介するGata4、Hand2、Mef2c、およびTbx5の送達を使用して、多様な再プログラムされた心臓サブタイプの生成と定量化のための段階的なプロトコルを説明しています。...

マウス胚線維芽細胞の転写因子媒介リプログラミングに続いて心筋細胞のサブタイプを評価します

このプロトコルでは、ヒト誘導多能性幹細胞を心筋細胞の分化および精製に使用する方法をデモンストレーションし、さらに、Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤による移植効率を改善する方法について説明します。マウス心筋梗塞モデルにおける前処理。...

Rhoキナーゼ活性の一過性阻害によるヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞の増着増強

このプロトコルは、血球性幹および前駆細胞を生成する転写因子GATA2、GFI1BおよびFOSの強制発現によるヒト皮膚線維芽細胞における血球形成プログラムの誘導を示す。...

転写因子の強制発現によるヒト線維芽細胞のヘモジェニックリプログラミング

GCaMP3レポーターによる心臓特異的カルシウムフラックス測定による心臓リプログラミングのインビトロ評価

学ぶ心筋細胞への線維芽細胞リプログラミング法。GATA4、Hand2、Mef2c、Tbx5、miR-1、miR-133の発現とTGF-βシグナル阻害により、7日で収縮する心筋細胞を60%効率で誘導し、心臓再生医療への応用が期待されます。

プロ線維性シグナル伝達の抑制を促進する誘導心筋細胞マウス胚性線維芽細胞のリプログラミング因子を介した

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