Name: 最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞およびひと多能性幹細胞からのような心室心筋細胞の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶ：Activin AとId1過発現を用いて、人間多能性幹細胞から心臓前駆細胞と心室様心筋細胞を効率的に作製するスケーラブルな手法。この方法は、発生生物学研究や疾患モデリングに応用可能です。

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我々 は役に立つ議論のコーラのラボのメンバーと原稿の重要なレビューをありがとうございます。本研究は、NIH/NIEHS R44ES023521-02 でサポートされていたし、CIRM DISC2-10110 博士コーラに付与します。

1. Id1 ウイルス作製と感染症
<ol><li>PCDH ef1 〜 Id1 PGK PuroR、pMD2.G、pCMVDR8.74 の共同株 Id1 過剰発現レンチ ウイルスを生成 (Addgene: プラスミッド #107735) HEK293T 細胞に。ウイルス粒子を収集、濾液、上清から浄化、北村らのように-80 ° C で保存(2003 年)19します。 また、pCDH ef1 〜 Id1 PGK PuroR をレンチ製造ベンダーに送信することによって商業 Id1 レンチ ウイルスを生産。 注意: は、レンチ ウイルスに関する安全規制および標準的な操作のプロトコルに従ってください。 注: 重要: 最適なウイルス価は少なくとも 10 をする必要があります 108 9 Transducing 単位/ml (TU/mL)。</li>
	<li>感染前にコートのコーティング剤、Engelbreth ・ ホルム群マウス肉腫細胞 (材料の表を参照) によって分泌されるゼラチンのタンパク質混合物通常の 50 μ l で 96 well プレートの 1 つの井戸を実行します。</li>
	<li>1 mL の PBS Ca2 +と Mg2 +と 0.5 mM EDTA を追加することによって 6 ウェル プレートで育った多能性幹細胞の 1 つの井戸を切り離して考えます。 注: 解離時間は 3-10 分から異なります。プレートの底から細胞の 80% 以上を取り外したら、次のステップに進みます。</li>
	<li>滅菌ピペットで細胞を懸濁液を 15 mL プラスチック遠心管にまとめます。</li>
	<li>5 ml の PBS を含む Ca2 +と Mg2 +の解離試薬を中和します。</li>
	<li>遠心分離 (3 分 200 g x) によって細胞をペレットします。</li>
	<li>上清を除去し、ペレットを除去するためにチューブを優しくフリックします。</li>
	<li>幹細胞培地 1 ml を再停止します。</li>
	<li>ベンダーの指示に従って自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。</li>
	<li>あたり 20,000 実行可能な細胞は幹細胞培地 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤の 50 μ L でよく (96 ウェル プレート) をコーティング (表 1 と 2を参照)。</li>
	<li>24 h 後セル添付ファイルを監視し、2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤と 6 ng/mL hexadimethrine ブロマイドを添加した 100 μ l 幹細胞メディアでメディアを交換して (表 1および2を参照)、レンチ ウイルス感染前に 1 h。 注: の細胞は、プレートの底にしっかりと固定する必要があります。</li>
	<li>氷上 Id1 レンチ ウイルスを解凍します。</li>
	<li>3 μ L/ウェル精製レンチ ウイルスを追加 (ウイルス価は 10 の間にする必要があります8 ~ 109 TU/mL)、し、プレートを携帯文化のインキュベーター (37 ° C、5% CO220% O2) に転送。</li>
	<li>24 時間後のウイルス感染、感染した細胞に新鮮な幹細胞培地の 100 μ L を追加。</li>
	<li>48 時間後にレンチ ウイルス感染、新鮮な幹細胞培地 1 μ G/ml ピューロマイシンの 200 μ L でメディアを含む置換ウイルス。</li>
	<li>幹細胞培地 1 μ G/ml ピューロマイシンの 200 μ L で毎日メディアを更新します。</li>
	<li>文化が 80% の confluency に達したら、Ca2 +と Mg2 + + 0.5 mM EDTA なし 200 μ L の PBS (96 ウェル プレートのウェル 1 個) を使用してセルを切り離して考えます。</li>
	<li>細胞懸濁液を遠心管にまとめます。</li>
	<li>5 ml の PBS を含む Ca2 +と Mg2 +の解離試薬を中和します。</li>
	<li>遠心分離 (3 分 200 g x) によって細胞をペレットします。</li>
	<li>上清を除去し、ペレットを除去するためにチューブを優しくフリックします。</li>
	<li>再幹細胞培地 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤 1 ml を中断します。</li>
	<li>12 ウェル プレートのコーティング (1 mL) のすべてのセルに転送します。</li>
	<li>24 h 後幹細胞培地の 1 mL でよくと置換メディアに付着のためのモニターは 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤と 6 ng/mL hexadimethrine 臭化物、伝達の前に 1 つの h を補充しました。</li>
	<li>氷上 Id1 レンチ ウイルスを解凍します。</li>
	<li>ウェル (12 ウェル プレート) あたり純化ウイルスの 5 μ L を追加します。</li>
	<li>24 h 後レンチ ウイルス感染、1 ml の新鮮な幹細胞培地 3 μ G/ml ピューロマイシンのメディアを含む置換ウイルス。</li>
	<li>48 h レンチ ウイルス感染ウイルス含有 1 ml の新鮮な幹細胞培地 6 μ G/ml ピューロマイシンのメディアを交換してください。</li>
	<li>文化が 80% の confluency に達したら、500 μ L の PBS Ca2 +と Mg2 +と 0.5 mM EDTA (12 ウェル プレートのウェル 1 個) を使用してセルを切り離して考えます。</li>
	<li>半分を転送 (250 μ L) コーティング剤の 1 つの井戸に細胞懸濁液のコーティング幹細胞培地 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤 2 mL を含む 6 ウェル プレート。</li>
	<li>その他の半分を使用 (250 μ L) RNA の抽出およびレンチウイルスベクターを介したId1表現のレベル、コーラらのようにを定めるために qRT PCR のサンプルの(2012 年)4。 注: 重要な: Id1 mRNA 発現レベルよりも低い場合 (qRT PCR のプライマーの表 3を参照) GAPDH発現レベルの 0.005 倍、Id1 表現のレベルを超過するまで、上記のように感染プロセスを繰り返す、しきい値。</li>
</ol>2. hPSCsId1メンテナンス
<ol><li>文化の hPSCsId1コーティング 6 ウェル プレートで、幹細胞培地 6 μ G/ml ピューロマイシンの井戸あたり 3 mL で育ちます。</li>
	<li>HPSCsId1が 80% の confluency に達したら、通路のベンダーのガイドラインに従う酵素無料解離試薬を用いた集計値 (1:6 分割比) と細胞、幹細胞培地 6 μ G/ml ピューロマイシンの井戸あたり 3 mL で育ちます。</li>
</ol>3. 差別化の hPSCsId1の準備
<ol><li>コーティング剤の井戸あたり 500 μ L で 12 ウェル プレートをコートします。</li>
	<li>5-10 分チェック解離過程、毎分Id1に達する 90% の confluency hPSCs 1 mL の PBS Ca2 +と Mg2 +とよく当り 0.5 mM EDTA を追加することによって細胞を分離するとき、80% の細胞をプレートから解離する一度、次の手順に進みます。</li>
	<li>細胞懸濁液を遠心管にまとめます。</li>
	<li>5 ml の PBS を含む Ca2 +と Mg2 +の解離試薬を中和します。</li>
	<li>遠心分離 (3 分 200 g x) によって細胞をペレットします。</li>
	<li>上清を除去し、ペレットを除去するためにチューブを優しくフリックします。</li>
	<li>再幹細胞培地 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤 2 ml を中断します。</li>
	<li>自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。</li>
	<li>井戸幹細胞培地培養孵卵器に 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤と 6 μ G/ml ピューロマイシン転送プレートと補足の 1 mL あたりプレート 300,000 セルです。</li>
	<li>幹細胞培 6 μ G/ml ピューロマイシン文化まで 90% の confluency 地 2 mL を毎日メディアを更新します。この時点で、心臓の分化を開始 (次の手順)。</li>
</ol>4. hPSCsId1の最初のハート フィールドのような心臓前駆細胞 (CPs について L) への分化
<ol><li>12 ウェル プレート形式の幹細胞培地を 1.5 mL の誘導培 (表 1) に置き換えることによって開始分化 (0 日目) はアクチビンと補足 (100 ng/mL) (表 2の推奨されるボリュームとアクチビン A の濃度を参照してください。異なるプレート フォーマット)。</li>
	<li>(24 h 分化開始後) 1 日に 2 ml (/12 ウェル プレートのウェル) アクチビン A せず誘導メディアのメディアを交換します。</li>
	<li>3 日目、アクチビン A なし (/12 ウェル プレートのウェル) 誘導メディアの 2 mL でメディアを置き換えます。</li>
	<li>5 日目、凍結保存用について L CPs を収集 (次の手順)。 注: 重要な: 凍結をお勧めこの時点で心臓前駆細胞の後心筋細胞生産とバイオバンク大きなバッチから世代を切り離すことが可能。メモ、または、5 日目について L CPs は、分化を続行し、手順 5.1-5.5 passFHF L の CPs を参照してくださいステップ 6.5 に差別化のために進みますたてコーティング プレートに渡すことができます。</li>
</ol>5. 急性肝不全-L CPs の凍結保存
<ol><li>5 日目を含む井戸からすべてのメディアを吸引について L CPs とすぐに暖かい (37 ° C) 1 x の酵素を含む解離試薬 1 mL を追加 (材料の表を参照してください)。組織文化のインキュベーターでプレートを配置します。</li>
	<li>1 分後プレートをインキュベーターを左右に振る。</li>
	<li>2 分 (合計時間) 後インキュベーターからプレートを削除し、10 %fbs メディアの 1 つの mL を追加します。</li>
	<li>優しくピペットでのセルを上下プレートから細胞の剥離を容易にするために 5 mL をピペットで移しなさい。</li>
	<li>3 分間 200 × g で遠心分離遠心チューブ、ペレット細胞を細胞懸濁液を収集します。</li>
	<li>再凍結保存試薬の 2 mL の細胞ペレットを中断します。</li>
	<li>自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。</li>
	<li>凍結保存試薬を追加 (材料の表を参照) を目的濃度 (通常 5-10 x 106セル/mL) で細胞を凍結保存するための十分なボリュームで。</li>
	<li>凍結保存バイアルにセルを転送し冷却装置 (1 ° C/分) でバイアルに、一晩-80 ° C のフリーザーで冷却装置を置きます。</li>
	<li>24 h 後に、長期保存用液体窒素に凍結バイアルを転送します。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
</ol>6. 急性肝不全-L CP のような心室心筋細胞分化
<ol><li>ドライアイスの容器に液体窒素から 5 日目凍結について L CPs バイアルを転送します。</li>
	<li>細胞懸濁液は、完全に解凍するまで 2 〜 3 分の 37 ° C の水浴のバイアルを配置します。 注: 重要な: 解凍処理は一刻を争う。時間の過剰な量の細胞凍結保存メディアを公開する (すなわち、 10 分) 細胞生存率が低下します。</li>
	<li>解凍バイアル数に応じて、15 または 50 の mL の遠心管にセルを転送します。</li>
	<li>滴 (5 滴 30 秒ごと) に予め温めておいた (37 ° C) 心原性メディア (表 1) 携帯ソリューションを調剤します。1:3 凍結保存メディアまでこのプロセスを続行: 心原性メディア比に達する。この時点で、1:10 まで心原性メディアの添加率を高める凍結保存メディア: 心原性メディア比に達する。 注: 重要な: 急速な浸透圧の変化が、解凍処理中に細胞死を増加したがって、心原性メディアの滴下前述のよう強くお勧めします。</li>
	<li>細胞懸濁液とペレットを遠心分離機、遠心分離 (3 分 200 g x) によって。</li>
	<li>上清を除去し、やさしく細胞ペレットを取り除くため遠心管をフリックします。</li>
	<li>再 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤を添加した心原性のメディアでセルを中断します。 注: セル実行可能性は、雪解けから解凍して、一般に変わることができる、> 65% 生存率が良いめっき効率を予測します。</li>
	<li>希釈濃縮細胞懸濁液めっき用目的のセルの濃度を取得する 2 μ M ・ ロー/ロック経路の阻害剤を添加した心原性のメディア (異なるプレート形式の表 2を参照)。 注: 重要な: 細胞はまばらすぎる播かれる場合心筋分化効率が低下することに注意してください。</li>
	<li>プレート上の種子のセル。</li>
	<li>組織文化のインキュベーターに転送する前に 20 分のティッシュ文化フード プレートをしてください。</li>
	<li>6 日目に分化、細胞接着を監視します。 注: 心臓前駆細胞は分化の 5 日目に凍結しました。細胞を解凍後 24 h は分化の 6 日目になります。 注: 浮動 (死んだ) 細胞の存在は、一般的です。</li>
	<li>7 日にメディアの 50% を吸引し、新鮮な心原性メディアの等しい量に置き換えます。 注: 心原性メディアにロー/ロック経路阻害剤の追加はこのポイントの後必要ありません。</li>
	<li>その他毎日心原性メディアでメディアの 50% を置き換えます。</li>
	<li>11 日目と 13 日目の間に自発的な鼓動するメモが表示されます。</li>
	<li>15 日に DAPI (核染色) と ACTC1 を用いた蛍光抗体法による心筋分化効率の定量化 (パン心臓マーカー)。</li>
</ol>7. 渡す、のような心室心筋細胞のメンテナンス
注: 日 14-16 のような心室心筋細胞を自発的に契約の単分子膜を得られなければならない.この時点で、切り離して、再度文化を均質化し、セルがプレートからデタッチすることを防ぐために心筋細胞をプレートすることをお勧めします。
<ol><li>井戸からすべてのメディアを吸引し、迅速に予め温めておいた (37 ° C) 1 x の酵素を含む解離試薬 1 mL を追加します。 メモ: 酵素を含む解離試薬ボリューム x 1 プレート形式によって異なりますが完全によく画面の下部をカバーする必要があります。</li>
	<li>組織文化のインキュベーターにプレートを転送します。</li>
	<li>軽く板側に剥離プロセスを加速するインキュベーター内 2 分ごとを振る。</li>
	<li>5-15 分後にプレートの底から細胞の 80% 〜 100% を取り外したら、インキュベーターからプレートを取り外し、10 %fbs メディアの等しい量を追加することによって酵素含有解離試薬活性 x 1 を阻害します。 注: このプロセスの 1 x 酵素を含む解離でインキュベーション時間もバッチごとに変わります。</li>
	<li>細胞懸濁液を遠心管に収集します。</li>
	<li>自動化された細胞カウンターを使用してカウントのピペットで移しなさい細胞と細胞懸濁液を混ぜます。</li>
	<li>目的のセルの濃度に細胞懸濁液を希釈 (異なるプレート形式の表 2を参照) 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤を添加した保守メディアで。</li>
	<li>プレート上に心筋細胞を播種後セルを均等にして細胞は、組織文化のインキュベーターにプレートを転送する前に 10-20 分を添付します。</li>
	<li>24 h 再メッキ後は、細胞接着と回復を監視します。 注: 浮動 (死んだ) 細胞の存在は、一般的です。48-72 時間後再メッキ、心筋細胞は自発的な収縮を再開しなければなりません。</li>
	<li>心筋細胞培養を維持するために保守メディアでその後の実験のような心室の心筋細胞が使用されるまで、その他の毎日メディアの 50% を置き換えます。</li>
</ol>

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</ol>

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正常な分化、密接に上記の指示に従うことを確認してください。さらに、ここで我々 は強く分化の結果に影響を与える重要なパラメーターを強調表示します。分化を開始する前に次の 3 つの形態学的パラメーターを観察する必要があります: hPSCsId1、高細胞密度および高い合流の幹の形態 (> 90%) 0 日目で文化。その点で最適な分化条件が単一セルとして解離メッキの hPSCsId1によって作成される最高と 2 〜 3 日のコース中に ~ 90% 合流する成長分子をクラスター化しっかりとフォームにそれらを許可します。逆に、hPSCId1文化ショー悪い細胞コロニー形態、植民地低圧縮と文化の中で分化の大部分の存在、成功について L CP 分化はほとんどありません。
メディア ボリューム アクチビン A の濃度は、重要なパラメーターについて L CP 分化とプレート形式に依存 (表 2参照)。最適アクチビン A の濃度に応じて異なる場合があります注 hPSC ラインを使用し、濃度の最適化が必要な場...

ひと多能性幹細胞 (hPSCs) の大規模な生産-派生心臓前駆細胞と心筋細胞は幹細胞ベースの治療1、病モデル2,3との迅速な評価の前提新規経路心筋分化4,の5,6と生理7,の8を規制します。,15が非常に効率的な前述した研究9,10、11,12,13,14の数hPSCs から心筋分化誘導方法、どれもが対処にもかかわらず左違いの重要な分子の同定の結果心筋細胞の心臓領域の原点 (最初ハート フィールド) と右の (2 番目のハート フィールド)心室心筋細胞16と心フィールド固有の先天性心疾患の存在すなわち、左心低形成症候群17または不整脈原性右室異形成症18。したがって、心臓前駆細胞の生成と定義されたハート フィールド hPSCs 由来の心筋細胞は治療としての妥当性を高めるために必要になっていると疾患モデリング ツール。
このプロトコルは、Id1、最近同定された5最初ハート フィールドを指定するキュー アクチビン A との組み合わせでは必要であり、hPSCs での心臓を開始するための十分な学会の構成に依存します。特に、カニンガムら(2017)5を示して、Id1 誘起前駆細胞具体的表現 (HCN4、 TBX5) 最初のハート フィールドが 2 番目のないハート フィールド マーカー (SIX2、 ISL1) 心筋分化を遂げる。さらに、著者はまたしたトランスジェニック マウス胚の遺伝子 (Id1-4)、家族Idを欠けている開発最初心臓フィールド心臓前駆細胞より内側と後部の心臓前駆細胞 (間を形成することがなく、表示します。2 つ目のハート フィールド) はそれにより Id 蛋白質初めてハート フィールドの心臓生体内での開始に必須を示唆、まだ形成できます。便利な Id1 誘起前駆細胞凍結保存することができ、自発的に心室固有マーカー (IRX4, MYL2) 式を含め、心室のような特性を表示する心筋細胞に分化し、ような心室の活動電位。
ここで Id1 過剰 hPSCs から最初心臓フィールドのような (急性肝不全-L) 心臓前駆細胞のような心室心筋細胞を生成するシンプルかつスケーラブルな手法について述べる。このプロトコルの重要な機能は、便利な冷凍保存の手順を使用してその後心筋細胞生産から心臓前駆細胞生成を切り離すことです。要約すると、このプロトコルは (1) Id1 過剰発現の hPSCs を生成する、(2) hPSCs から急性肝不全-L 心臓前駆細胞を生成する、(3) 結果前駆細胞の凍結、(4) 再開について L 心臓前駆細胞の分化に必要な手順の詳細し、を生成高濃縮 (> 70-90%) のような心室心筋細胞を打ちます。

<table><tbody><tr><td>ACTC1抗体</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>アクチビンA</td>幹<td>細胞技術</td><td>Hu Recom アクチビンA</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質 抗真菌薬(抗抗抗薬)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27サプリメント</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B27サプリメント w/o - インスリン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック サイオリティ</td><td>フィック A1895601</td><td></td></tr><tr><td>ビタミンA</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12587001</td><td></td></tr><tr><td>CDH5抗体</td><td>R&D Systems</td><td>AF938</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7930</td><td>凍結保存試薬</td></tr><tr><td>DMEM 高グルコース</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DPBSワット/Ca&Mg</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>89510-186</td><td></td></tr><tr><td>FluoVolt 膜電位キット&nbsp;&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F10488</td><td>光学的活動電位の取得については、McKeithan et al. 2017</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, Growth Factor Reduced</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Coating reagent</td></tr><tr><td>mTeSR1 media kit</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>PBS w/o Ca &Mg</td><td>コーニング</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピュロマイシン&nbsp;</td><td>Acros</td><td>227422500</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5872</td><td>酵素フリー解離試薬</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>TAGLN抗体</td><td>Abcam</td><td>ab14106</td><td></td></tr><tr><td>チアゾビビン</td><td>幹細胞技術</td><td>72254</td><td>RHO/ROCK経路阻害剤</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12605 -010</td><td>1X 酵素含有解離試薬</td></tr><tr><td>Tyrodes solution mix packets&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T2145-10X1L</td><td>(光学的活動電位取得については、McKeithan et al. 2017をご参照ください)</td></tr></tbody></table>

最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞およびひと多能性幹細胞からのような心室心筋細胞の生成

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

機能的ひと多能性幹細胞由来心筋前駆細胞の大量および定義された中心領域の原点の心筋細胞の生成は、セルベースの心臓治療法や疾患モデリングの前提です。我々 は最近、Id 遺伝子が必要と脊椎動物の開発中に最初の心臓フィールドの前駆細胞を指定するのに十分なことを示しています。この分化プロトコルは、これらの知見を活用し、最初心臓フィールドのような (急性肝不全-L) 前駆細胞を生成する強力な指定する手がかりとしてアクチビン A との組み合わせで Id1 の過剰発現を使用します。重要なは、結果前駆細胞のような心室心筋細胞 (〜 70-90%) を効率的に区別します。ここで我々 は 1) Id1 過剰発現 hPSCs を生成し、2) 前駆細胞について-L cryopreservable のような心室心筋細胞のスケーラブルな量を区別するための詳細な方法をについて説明します。

HPSCs の生成Id1ライン hPSCs は、Id1 過剰発現 (図 1A) を仲介するレンチ ウイルスに感染しています。HPSCId1が生成される遺伝子発現は qRT PCR (図 1B) によって定量化されます。GAPDHの 0.005 倍を超えるレベルでId1 mRNA を表現する hPSCId1線だけは差別化のために使わなければなりません。
hPSCsId1<st...

ここで我々 アクチビン A のレンチ ウイルスを介した Id1 を高発現、単純な組み合わせを使用して、ひと多能性幹細胞から最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞のような心室心筋細胞を生成するスケーラブルな方法をについて説明します。

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

この単純な手法の主な利点は、明確な心野の起源とサブタイプの心臓前駆細胞と心筋細胞を生成することです。また、得られた細胞は、基礎的な発生生物学、概念実証による細胞ベースの治療、心疾患モデリング研究など、幅広い研究用途に使用することができます。この手順を実演するのは、私の研究室のSean SpieringとMichael Yuです。まず、96ウェルプレートのウェルに50マイクロリットルのコーティング試薬を塗布し、その後の細胞播種およびウイルス感染ステップに対応します。次に、6ウェルプレートのウェルに1ミリリットルの解離試薬を加えて、播種した多能性幹細胞を分離します。次に、滅菌ピペットを使用して、細胞懸濁液を15ミリリットルのプラスチック遠心チューブに移します。チューブに、カルシウムとマグネシウムを含む5ミリリットルのPBSを加えて、解離試薬を中和します。次に、細胞を200倍gで3分間遠心分離します。遠心分離後、上清を捨ててから、チューブを静かにフリックしてペレットを取り除きます。次に、細胞ペレットを1ミリリットルの幹細胞培地に溶解します。次に、自動セルカウンターを使用してセルの数をカウントします。カウントが完了したら、2マイクロモルのRHO/ROCK経路阻害剤を添加した幹細胞培地の50マイクロリットルを含む96ウェルプレートの各ウェルに20,000個の生存細胞を播種します。24時間後、細胞接着をモニターし、レンチウイルス感染の1時間前に培地を100マイクロリットルの幹細胞培地と交換します。次に、Id1レンチウイルスを氷上で解凍し、ウェルごとに3マイクロリットルの精製レンチウイルスを追加します。レンチウイルスを加えた後、プレートを摂氏37度の細胞培養インキュベーターに5%の二酸化炭素で戻します。ウイルス感染後24時間で、感染した細胞に100マイクロリットルの新鮮な幹細胞培地を追加します。48時間後、ウイルス含有培地を、ピューロマイシン1ミリリットルあたり1マイクログラムを補充した200マイクロリットルの新鮮な幹細胞培地と交換します。毎日、新鮮な200マイクロリットルの幹細胞培地に1ミリリットルあたり1マイクログラムのピューロマイシンを補充して、培地を交換し続けます。0日目に、幹細胞培地を1.5ミリリットルの誘導培地と12ウェルプレートのアクチビンAに交換して、分化のプロセスを開始します。分化が始まってから24時間後、Activin A.On 3日目に、Activin A.Onなしで誘導媒体の2ミリリットルと取り替える 5日目に、FHF-L CPsを含む井戸から全体の培地を吸引し、その後すぐに井戸に温かい酵素含有解離試薬の1ミリリットルを加えて、 次に、培養プレートを摂氏37度でインキュベートします。1分後、インキュベーター内のプレートを振って2分後にインキュベーターから取り出し、ウェルに1ミリリットルの10%胎児ウシ血清含有培地を追加します。細胞を静かにピペッティングして、細胞をプレートから取り外します。次に、細胞懸濁液を遠心チューブに移し、遠心分離にかけます。遠心分離後、細胞ペレットを2ミリリットルの凍結保存試薬に溶解し、細胞数をカウントします。次に、凍結保存バイアル内の細胞を移し、バイアルを冷却装置に残します。次に、デバイスを摂氏マイナス80度で一晩転送します。24時間後、バイアルを液体窒素に移して長期保存します。FHF-L CPを解凍する直前に、12ウェルプレートのウェルに2ミリリットルのコーティング試薬をコーティングします。次に、ドライアイス容器内の液体窒素から5日経過したFHF-L CPを移します。ドライアイスから、バイアルを摂氏37度の水浴に2分間移し、完全に解凍します。細胞が完全に解凍された後、細胞を遠心チューブに移し、次に予め温めた心原性培地を30秒ごとに10滴細胞溶液にピペットで移します。凍結保存と心原性培地の比率が1〜3に達するまで、心原性培地を追加し続けます。次に、細胞を遠心分離にかけます。遠心分離後、上清を取り除き、チューブを慎重にフリックしてから、細胞ペレットを2マイクロモルのRHO/ROCk経路阻害剤を添加した心原性培地に溶解します。細胞懸濁液を心原性培地でさらに希釈して、目的の細胞濃度を達成します。次に、2ミリリットルの心原性培地を含む培養プレートに細胞を播種します。プレートを組織培養フードに20分間置いてから、インキュベーターに移します。分化の6日目に細胞の付着をモニターします。7日目に、心原性培地の半分を吸引し、新しい培地と交換します。これ以降、心原性培地の50%を隔日で交換し、15日目に心臓の分化を定量化します。ここでは、Id1 mRNAの発現レベルをhESC細胞株とhPSC細胞株で定量化します。0.005倍GAPDHを超えるレベルでId1 mRNAを発現するhPSC系統のみを分化に使用します。ここに示されているのは、0日目の最適hPSCs、サブコンフルエントhPSCs、およびオーバーコンフルエントhPSCの分化後の明視野画像です。さらに分化すると、細胞の密度は24時間後に75%に達します。3日目には、分化している細胞はクラスターを形成し、5日目には、細胞は均質な形態で密接に接続されたクラスターに残ります。6日目には、FHF-L CPはウェルの表面積の90%以上をカバーしています。実際、12日目までに、心筋細胞は鼓動を開始し、心臓の収縮を示します。分化プロセスをさらに進めると、15日目以降にMYL2およびIRX4のmRNA発現レベルが増加します。どちらのタンパク質も、心筋細胞内の心室特異的マーカーを表しています。ここで、活動電位トレースは、急速なアップストロークとダウンストロークの速度、および心室プラトーを表しています。これらの率は、分化の25日目の心室様心筋細胞の特徴でした。要約すると、Id1を過剰発現するヒト多能性幹細胞を生成するのに約2週間かかり、その後、最初の心野様前駆細胞を生成するのに約5日、鼓動する心室様心筋細胞を生成するのに約10日かかります。

generation-first-heart-field-like-cardiac-progenitors-ventricular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

私たちは、人間の心臓前駆細胞の大量供給と心血管修復のための機能的な心筋細胞の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接cardioblastsの誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

多能性幹細胞は、胚又は人工多能性幹細胞（iPS細胞）のいずれかで、心筋細胞を含むヒト分化細胞の貴重な情報源を構成する。ここでは、胚様体ベースのプロトコルを介して機能的なヒト心筋細胞を得るためにそれらを使用する方法を示す、iPS細胞の心筋誘導に焦点を当てます。...

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

物品を効率よく選択的に集団の均質性および同一性を評価するための基準マーカーのフローサイトメトリー分析を行っWnt経路を変調することにより、心筋細胞へのヒト多能性幹細胞を分化するための詳細な方法論を記載している。...

フローサイトメトリーによる高効率心筋細胞へのヒト多能性幹細胞の分化と特性

このプロトコルでは、マウスとヒトの胚性幹細胞の両方からの心前駆細胞の誘導が説明されます。このプロトコールの主な戦略は、胚性幹細胞株に改変された蛍光レポーターを使用して、フローサイトメトリーで心前駆細胞を濃縮することです。...

胚性幹細胞から心臓前駆細胞の誘導

我々は、心筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞およびパッチ媒介性サイトカインの送達と細胞注射を組み合わせることにより、移植細胞の生着を改善する配送方法に、ヒト人工多能性幹細胞を分化するための3つの新規かつより効率的なプロトコルを提示します。...

多能性幹細胞は、心筋の修復のための心臓細胞を派生します

ヒト多能性幹細胞（hPSC-CM）に由来する心筋細胞の電気生理学的特徴付けは、心臓疾患のモデル化および薬物応答の決定に重要である。このプロトコールは、多電極アレイ上のhPSC-CMを分離してプレートし、それらの電場電位を測定し、QTおよびRR間隔を分析するための方法を提供するのに必要な情報を提供する。...

多電極アレイ（MEA）を用いたヒト多能性幹細胞由来心筋細胞（hPSC-CM）の電気生理学的解析

この方法の目的は、前駆細胞の仕様および機能性を研究するためにインビトロで心臓界特異的心臓前駆細胞を生成し、心臓病モデリングのためのチャンバー特異的心臓細胞を生成することである。...

マウス心臓分野特異的心臓前駆細胞のインビトロ生成

ここでは、患者末梢血単核細胞からヒト心筋細胞を強固に生成・拡張するプロトコルを提示する。...

患者末梢血単核細胞からのヒト心筋細胞の発生と拡大

ここでは、自己組織化によってヒト多能性幹細胞を用いて、発達的に関連するヒト心臓オルガノイド(hH)を効率的に作成するためのプロトコルについて述べた。このプロトコルは、発達的手がかりの逐次活性化に依存し、非常に複雑で機能的に関連するヒト心臓組織を生成する。...

多能性幹細胞由来の自己組織化ヒト心臓オルガノイドの生成

ここでは、ハイスループットの多次元フォーマットで培養されたヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞からの心臓スフェロイド(CS)の生成と凍結保存のための一連のプロトコルを紹介します。この3次元モデルは、疾患モデリング、ハイスループットスクリーニングのための堅牢なプラットフォームとして機能し、凍結保存後もその機能を維持します。...

ヒト誘起多能性幹細胞由来心臓スフェロイドの作製、ハイスループットスクリーニング、バイオバンキング

学ぶ：Activin AとId1過発現を用いて、人間多能性幹細胞から心臓前駆細胞と心室様心筋細胞を効率的に作製するスケーラブルな手法。この方法は、発生生物学研究や疾患モデリングに応用可能です。

最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞およびひと多能性幹細胞からのような心室心筋細胞の生成

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