単一の膜タンパク質生きた哺乳類細胞の細胞内小器官のマルチカラー ローカリゼーション顕微鏡

この手法は、タンパク質のダイナミクスと組織が機能的適応においてどのような役割を果たすかなど、制御プロセスにおける重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、生細胞で行うことができるため、単一分子レベルでのタンパク質動態を明らかにすることができることです。この方法はもともと、ミトコンドリア膜タンパク質の時空間組織に関する洞察を提供するために実装されましたが、他のオルガネラや他の膜タンパク質にも適用できます。

このテクニックを実演するのは、私の研究室の大学院生であるTimo Appelhansです。テキストプロトコールに従って細胞サンプルと顕微鏡をトランスフェクションして調製した後、調製したサンプルを蛍光ビーズでPTFEリングと赤色ゴムリングの間のサンプルホルダーにマウントします。顕微鏡、すべてのハードウェアコンポーネント、および顕微鏡検査に必要なすべてのソフトウェアを起動します。

イソプロパノールをスプレーした糸くずの出ない新鮮なティッシュを使用して、対物レンズとカバースリップの底を清掃します。次に、対物レンズの瞳孔に液浸油を液滴で置きます。次に、ビーズサンプルを入れたサンプルホルダーを顕微鏡ステージに置き、カバースリップの底がオイルに接触するようにします。

次に、透過光またはレーザーラインを使用してビーズに焦点を合わせます。2つの励起レーザーの出力を調整して、2つの蛍光チャネルで同様の信号密度を達成します。次に、多くの異なる蛍光シグナルがある領域を検索します。

カメラ制御ソフトウェアを使用して、蛍光チャネルのマージビューを生成します。次に、イメージスプリッターのネジを使用して、内部の光学イメージスプリッターを手動で傾け、2つの蛍光チャンネルからのシグナルを最適に重ね合わせます。TIRF顕微鏡制御ソフトウェアを起動し、ライブストリームモードで個々のチャンネルを表示することを選択します。

スナップショット画像を撮影し、すべてのチャネルで蛍光灯を励起します。次に、このイメージを使用して変換行列を生成します。ソフトウェア解析プラグインを起動し、以前に記録した蛍光ビーズの2色画像をソフトウェアにロードします。

蛍光チャネルの使用向きを選択します。画像の調整を求められたら [はい] をクリックし、以前に撮影したスナップショットを選択します。ユニット・マネージャーを開いて単位変換係数を定義してから、ローカリゼーション・マネージャーを開きます。

ポイントスプレッド機能(PSF)を確認するには、PSF半径ボタンを押します。開いたPSF Estimatorウィンドウで、開口数と最大放出を定義します。次に、「PSF 半径の推定」をクリックします。

次に、得られた実験的なPSFを受け入れ、評価ボックス、デフレーションループの数、および計算に使用するコンピューターのコア数を定義します。次に、[ローカライズ]を押して、2D 対称ガウス関数を使用して、単一パーティクルの強度分布のフィッティングを開始します。

キャリブレーションマネージャーを開きます。レンダリングされ、マージされた 2 つのチャンネルの画像には、元の信号とローカライズされた中心が表示されます。アフィンモードを選択します。

次に、接続線を引いて、同じ蛍光ビーズに由来する2つのチャネル内の局所中心の対応するペアを手動で接続します。視野全体に分布している対応する信号を接続します。次に、[承認] を押して、変換行列を保存します。

ミトコンドリア膜タンパク質の単一分子イメージングを行うには、試料カバースリップをゴムとPTFEリングの間に取り付けます。次に、チャンバーに0.5〜0.8ミリリットルのイメージング媒体を充填します。対物レンズとカバーの底面をスリップして清掃します。

次に、透過光またはレーザーラインを使用して、レンズにオイルを一滴加えた後、細胞に焦点を合わせます。次に、2つの励起レーザーの出力を調整して同様の強度を達成し、蛍光信号が多い領域を探します。TIRF顕微鏡制御ソフトウェアで照明角度を調整して、臨界角よりも小さい入射角を作成するか、HILOシートを介して特定の関心領域を励起するTIRモードを作成します。

HILO照明を使用してTIRF顕微鏡の照明を適応させ、細胞小器官を励起するには、シグナルバックグラウンド比の迅速な判断とTIRF顕微鏡の経験、および細胞形態に関する知識が必要です。EMゲインを設定し、フレームごとに十分な光子を収集する実験に適した露光時間を選択します。次に、高い信号対雑音比を達成するためにレーザー出力を調整します。この比率はローカリゼーション精度に直接対応します。

細胞周辺に、重なり合わない細長いミトコンドリアと単一分子のシグナルを持つ領域を見つけます。一方または両方のチャネルに単一のシグナルが見られない場合は、漂白によって単一分子のシグナルが現れるまで待ちます。1つのチャンネルのみを漂白する必要がある場合は、このチャンネルを記録する前に、漂白を避けるために、他のチャンネルのレーザーをオフにしてください。

信号の数が少なすぎて妥当な継続ができなくなるまで記録します。イメージング処理ソフトウェアを起動し、少なくとも1, 000フレームの記録されたフレームの累積レンダリング合計画像を生成することにより、ミトコンドリア構造を確認します。ソフトウェア分析プラグインを起動します。

ローカリゼーションとトラッキングのためのデータ処理を実行するには、生データを読み込みます。マルチカラーを確認してください。両方のチャネルの正しい向きを選択します。

[画像のキャリブレーション] を求められたら、変換マトリックスを読み込みます。チャンネルは別々に表示されます。「表示」をクリックして、画像コンテナから生データを開きます。

次に、上部のタブでユニットマネージャーを開き、各チャネルの単位変換係数を定義します。上部のタブでローカライゼーションマネージャーを開き、評価ボックスとデフレーションループの数を定義します。PSF Radiusをクリックして、PSF推定器を開きます。

開口数と最大放出数を設定して、理論上のPSF値を取得します。[同意する] を押します。これをすべてのチャネルで繰り返します。

次に、[Localize]を押して、両方のチャンネルで記録された信号の単一粒子のローカリゼーションを開始します。ソフトウェアが終了するのを待ちます。これで、各チャネルの超解像画像がソフトウェア解析プラグインの画像コンテナで取得されます。

PINK1は、ミトコンドリアの機能を保証する重要な要素です。機能的および機能不全のミトコンドリアにおけるTom20に対するPINK1の局在を決定するために、1, 000フレームの時系列が記録されました。1つのチャネルからのすべてのシグナルの経時的な累積画像は、PINK1が通常の条件下では細胞質、外膜、およびミトコンドリア内に局在しているが、脱分極したミトコンドリアの外膜に優先的に局在していることを示しました。

局在化粒子の総計画像が示すように、PINK1は主に分極したミトコンドリア内に分布し、Tom20はミトコンドリア外膜に局在しています。このことは、局在したTom20粒子とPINK1粒子の合体画像でさらに明確になり、外膜タンパク質Tom20の分布がはるかに広いことを示しています。ミトコンドリア内でのPINK1の局在を確認するために、呼吸複合体の30キロダルトンのサブユニットを光活性化性GFPに融合させ、蛍光光活性化局在顕微鏡で記録しました。

累積トリプルカラー画像と断面分布は、複素数1とPINK1の重ね合わせを示しており、全長PINK1のインポートを確認しています。これらのデータは、PINK1の亜集団がいくつかのミトコンドリアのマイクロコンパートメントを占めていることを示しています。この手法を習得すると、適切に行われれば、データの記録や後処理を含めて20時間で完了できます。

この手順を試みるときは、オルガネラの動きをテストすることを忘れないでください。この手順に続いて、タンパク質の相対的な局在を決定することができます。その開発後、この技術は、ミトコンドリアタンパク質の単一粒子追跡の分野の研究者が、Z2、さまざまな代謝条件、およびストレス下でのミトコンドリアタンパク質の挙動を観察するための道を開きました。

このビデオを見れば、ミトコンドリアタンパク質のデュアルカラム顕微鏡検査を行い、そのサブオルガネラの位置と輸送を明らかにする方法について十分に理解できるはずです。