Name: 単一の膜タンパク質生きた哺乳類細胞の細胞内小器官のマルチカラー ローカリゼーション顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 学ぶ単一膜タンパク質のマルチカラー局在顕微鏡法。生きた哺乳類細胞で約18nmの分解能を達成し、細胞小器官内のタンパク質動態と空間的組織化を可視化する。ミトコンドリアなど多様な細胞小器官に応用可能。

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著者は、生物物理学グループと継続的な支援、技術支援や、材料の準備のため Wladislaw コール用顕微鏡を提供する CellNanOs ボードにオスナブリュック大学でヤコブ Piehler に感謝したいと思います。SFB 944 によって資金が供給されたプロジェクト。

<ol><li>Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+organization+of+mitochondrial+microcompartments+revealed+by+combining+tracking+and+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy.</a> Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).</li>
<li>Appelhans, T., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Tracking+and+Localization+of+Mitochondrial+Protein+Complexes+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Tracking and Localization of Mitochondrial Protein Complexes in Live Cells.</a> Methods Mol Biol. 1567, 273-291 (2017).</li>
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<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat Protoc. 4 (3), 291-308 (2009).</li>
<li>Pennacchietti, F., Gould, T. J., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Probe+Photophysics+in+Localization-Based+Superresolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Role of Probe Photophysics in Localization-Based Superresolution Microscopy.</a> Biophys J. 113 (9), 2037-2054 (2017).</li>
<li>Wegel, E., Göhler, A., Lagerholm, B. C., Wainman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM%2C+STED+and+Localisation+Microscopy%3A+A+practical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific reports. , Available from: 
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<li>Pellett, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+STED+microscopy+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Two-color STED microscopy in living cells.</a> Biomedical Optics Express. 2 (8), (2011).</li>
<li>Ishigaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+super-resolution+imaging+of+mitochondria+labeled+with+TMRM+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells.</a> Mitochondrion. 28, 79(2016).</li>
<li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy%2C+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740(2015).</li>
<li>Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nat Methods. 5 (8), (2008).</li>
<li>Appelhans, T., Busch, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+mitochondrial+membrane+proteins+in+specific+sub-organelle+membrane+locations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+reviews%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of mitochondrial membrane proteins in specific sub-organelle membrane locations.</a> Biophysical reviews. 9 (4), 345-352 (2017).</li>
<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-color+super-resolution+imaging+of+live+cells%3A+resolving+submicroscopic+receptor+organization+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Triple-color super-resolution imaging of live cells: resolving submicroscopic receptor organization in the plasma membrane.</a> Angewandte Chemie. 51 (20), 4868-4871 (2012).</li>
<li>Niewidok, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+reveals+dynamic+biphasic+partition+of+RNA-binding+proteins+in+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging reveals dynamic biphasic partition of RNA-binding proteins in stress granules.</a> J Cell Biol. , (2018).</li>
<li>Wurm, C. A., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+distributions+define+two+sub-compartments+of+the+mitochondrial+inner+membrane+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential protein distributions define two sub-compartments of the mitochondrial inner membrane in yeast.</a> FEBS Lett. 580 (24), 5628-5634 (2006).</li>
<li>Schmidt, R., Wurm, C. A., Punge, A., Egner, A., Jakobs, S., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+cristae+revealed+with+focused+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial cristae revealed with focused light.</a> Nano Lett. 9 (6), 2508-2510 (2009).</li>
<li>Kukat, C., Wurm, C. A., Spahr, H., Falkenberg, M., Larsson, N. G., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+that+mammalian+mitochondrial+nucleoids+have+a+uniform+size+and+frequently+contain+a+single+copy+of+mtDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).</li>
<li>Beinlich, F., Drees, C., Piehler, J., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shuttling+of+PINK1+between+Mitochondrial+Microcompartments+Resolved+by+Triple-Color+Superresolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Shuttling of PINK1 between Mitochondrial Microcompartments Resolved by Triple-Color Superresolution Microscopy.</a> ACS chemical biology. 10 (9), 1970-1976 (2015).</li>
<li>Shim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
<li>Sbalzarini, I., Mezzacasa, A., Helenius, A., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Organelle+Shape+on+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effects of Organelle Shape on Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Biophysical Journal. 89 (3), 1482-1492 (2005).</li>
<li>Reits, E., Neefjes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+fixed+to+FRAP%3A+measuring+protein+mobility+and+activity+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells.</a> Nature Cell Biology. 3 (6), E145-E147 (2001).</li>
<li>Goehring, N., Chowdhury, D., Hyman, A., Grill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+Analysis+of+Membrane-Associated+Proteins%3A+Lateral+Diffusion+and+Membrane-Cytoplasmic+Exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">FRAP Analysis of Membrane-Associated Proteins: Lateral Diffusion and Membrane-Cytoplasmic Exchange.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2443-2452 (2010).</li>
<li>Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2014 (7), 709-725 (2014).</li>
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<li>Poot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+morphology+and+function+with+novel+fixable+fluorescent+stains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains.</a> J Histochem Cytochem. 44 (12), 1363-1372 (1996).</li>
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<li>Barlag, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+super-resolution+imaging+of+proteins+in+living+Salmonella+enterica+using+self-labelling+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Single molecule super-resolution imaging of proteins in living Salmonella enterica using self-labelling enzymes.</a> Sci Rep. 6, 31601(2016).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
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<li>Jin, S., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-+and+Parkin-Mediated+Mitophagy+at+a+Glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">PINK1- and Parkin-Mediated Mitophagy at a Glance.</a> Journal of Cell Science. 125, 795-799 (2013).</li>
<li>Yamano, K., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+is+degraded+through+the+N-end+rule+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">PINK1 is degraded through the N-end rule pathway.</a> Autophagy. 9 (11), 1758-1758 (2013).</li>
<li>Wiedemann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machinery+for+protein+sorting+and+assembly+in+the+mitochondrial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Machinery for protein sorting and assembly in the mitochondrial outer membrane.</a> Nature. 424 (6948), 565-571 (2003).</li>
<li>Thompson, R., Larson, D., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
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ここでは、モバイルの膜タンパク質のデュアル カラー単一分子局在法が発表されました。次のプロトコル、膜タンパク質を自己分類 TMR と彼らのそれぞれの基板に共役サー ローダミン色素と反応する蛋白質に溶けます。ローダミンは染料は明るく、あるでき繰り返し画像1。成功したパフォーマンスのいくつかの条件や重要なトピックは、留意する必要があります。
まず、適切なフィルターと TMR とサーからの信号を明確に分離するスプリッターを選択することが重要です。セルの外側から背景を減らすためには、precleaning と PLL ペグ RGD とカバーガラスのコーティングに立ちました。染料基板の最終濃度は、その基質の自己ラベリング酵素の親和性と細胞内酵素のアクセシビリティを考慮したテストする必要があります。分からなかった濃度ナノ ミトコンドリア蛋白質17ストレス顆粒13のために十分だった。他の細胞内小器官、必要な濃度をテストする必要があります。染色録音の初めに...

このプロトコルの目標は、ローカライズし、生きた細胞内の単一の膜タンパク質を追跡するイメージング法を提供することです。このメソッドの追跡およびローカリゼーション顕微鏡 (TALM) の1,2と呼びます。確率光再建顕微鏡 (嵐)3など蛍光光局在顕微鏡 ((F) パーム)4、5TALM、単一分子蛍光ローカリゼーション手法です。ただし、同じ反復法を用いた膜タンパク質の組み合わせの移動はモバイルの蛋白質にアクセス microcompartment の明らかに異なる位置で分子をラベル方法で明瞭です。つまり、タンパク質の可能な限りのローカライズは、細胞小器官の構造、蛋白質1の移動に設定されています。メソッドは、ローカリゼーションおよび軌道イメージング モバイル蛋白質によってマップを明らかにするために様々 な他超解像技術6,7、8を補完するものです。ラベルは、それ自体非蛍光性は、遺伝子組み換えの融合蛋白質を使用してに基づいています。これらの融合蛋白質を染料に共役基板と反応して共有結合酵素自己ラベリングします。この手順ラベリング度ことができる利点があります追加基板の量によって制御されます。さらに、選択した共役系色素によって蛍光の色が変化することができます。自主表示タグ酵素がいくつかは、使用可能な9です。彼らは漂白まで正確に酵素タグを自己ラベリングは、共役系色素が通常より安定し、蛍光タンパク質1と個々 の蛋白質従って記録できるもはやより明るいなどを使用して別の利点。これにより、モバイルの蛋白質の軌跡の記録と拡散係数10,11の抽出。
ここでは、ミトコンドリア膜タンパク質と TALM の可能性を示すが、別のセル型12,13を含む、他の内極細胞膜タンパク質も適用できます。マルチカラー TALM さらに既存超解像蛍光顕微鏡技術14,15,に補完の別の間で蛋白質の同時の区別のためにことを示す16. ライブセル イメージング17と互換性のある TALM。光物理 Tetramethylrhodamine (TMR) とシリコン Rhodamien (SiR) の選ばれた rhodamines の特に明るさと安定性、そのすることができますレコードの単一膜タンパク質局在 (および軌道) のマップを提供する複数のフレームを。しかし、TALM は、モーション ブラーが高すぎると、フレームごと収集した光子が適切なローカライズの低すぎるので高拡散係数を持つ可溶性タンパク質の局在化のため制限されます。以外にも、TALM は、光毒性の影響を減らすよりも、たとえば嵐または誘導放出の枯渇 (STED) 顕微鏡6,7励振電力を必要とします。核形態18およびこうして移動解析19光毒性ストレスにしばしば影響を与えるので、これは重要です。合計では、ローカリゼーション顕微鏡方法嵐/STED の間のギャップを埋める手法として生きている細胞のマルチカラー TALM を提示 (F) パームと退色後蛍光回復など蛋白質の移動性を分析する手法 (FRAP)20/蛍光、蛍光相関分光法 (FCS)22, ,21クロス相関分光法 (FCCS)11,23。

<table><tbody><tr><td>(2-(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル)-エタンスルホン酸、1 M) (HEPES)</td><td>Biochrom</td> <td>#1104E</td><td></td></tr><tr><td>DC1:ジクロイドビームスプリッター&nbsp;</td><td>Chroma</td><td>640 dcxr</td><td>NC506031</td></tr><tr><td>DC2: Polychroic Mirror, beamsplitter</td><td>Chroma</td><td>zt405/488/561/640rpc</td><td>製造中止</td></tr><tr><td>Dulbecco&acute;リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1x(CaおよびCaなし)Mg)</td><td>シグマ・アルドリッチ・アンド・カンパニー</td><td></td><td></td>#RNBF8311</tr><tr><td>アール&acute;フェノールレッドを含まないMEM、L-グルタミンを含まないMEM、および1%FBS、0.1%HEPES、0.1%NEAA、0.1%アラニル-L-グルタミン、34.78%炭酸ナトリウムを含むNaHCO3を含まない(NaHCO3 0.75g / l)</td><td></td><td></td><td>イメージングメディウム</td></tr><tr><td>Earle&acute;フェノールレッドを含む最小必須培地(MEM)、1%のウシ胎児血清スーペリア(FBS)、0.1%HEPES(2-(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル)-エタンスルホン酸、1 M)、および0.1%の非必須アミノ酸(NEAA)</td><td></td><td></td><td>成長培地</td></tr><tr><td>EF:エミッションフィルタークワッドバンドパス</td><td>AHF分析技術</td><td>F72-866</td>ブ<td>ライトラインHC 446 nm / 523 nm / 600 nm / 677</td></tr><tr><td>nm EMCCDカメラ</td><td>Andor</td><td>Andor iXON 897</td><td>EMCCDカメラ</td></tr><tr><td>蛍光フィルターQuadViewフィルターキューブ、オレンジ</td><td>AHF analysentechnik</td><td>F39-637</td>バンド<td>パス582 - 619 nm</td></tr><tr><td>蛍光フィルターQuadViewフィルターキューブ、赤</td><td>クロマ</td><td></td><td>バンドパス655 - 725 nm(HQ 690/70)</td></tr><tr><td>FBS(ウシ胎児血清)優れた</td><td>バイオクロム</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>蛍光ビーズ:TetraSpeck&trade;ミクロスフェア、0.1 &micro;m、蛍光ブルー/グリーン/オレンジ/ダークレッド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>T7279</td><td>蛍光マイクロスフェア</td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>バイオクロム</td> <td>#0951C</td><td></td></tr><tr><td>HeLa細胞&nbsp;</td><td>DSMZ</td><td>ACC-57</td><td>Cervical carcinoma cells from patient Henrietta Lacks</td></tr><tr><td>Hela cells CI::p aGFP, stable</td><td>Muster et al., PLOSOne 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable</td><td>Appelhans et al., NanoLett 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable</td><td>Appelhans et al., NanoLett 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image splitter</td><td>Photometrics</td><td>Dual-ViewQV2</td><td>イメージスプリッター エミッション</td></tr><tr><td>イメージング処理ソフトウェア&nbsp;</td><td>ImageJ2 / フィジー</td><td>フリーウェア</td><td></td></tr><tr><td>イマージョンオイル - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45)</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>倒立脱射蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス IX-71/73/83</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レーザー 561 nm, 200 mW</td><td>クリスタレーザー</td><td>CL-561-200</td><td>561 nm 発光</td></tr><tr><td>レーザー 642 nm, 140 mW</td><td>オミクロン</td><td>Luxx-642-140</td><td>642 nm 発光</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>バージョン R2013a</td><td></td></tr><tr><td>MEM と Earle's Balanced Salt Solution 2.2 g/L NaHCO3、安定グルタミン w/o PR</td><td>Biochrom</td><td>FG-0385</td><td></td></tr><tr><td>MEM と Earle's Balanced Salt Solution with 2.2 g/L NaHCO3、安定グルタミン、フェノールレッド</td><td>バイオクロム</td><td>FG-0325</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker&reg;深紅FM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>M22426</td><td>染料</td></tr><tr><td>MitoTracker&reg;グリーンFM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>M7514</td><td>色素</td></tr><tr><td>モノモードファイバーを維持するマルチモード光偏光</td><td>Pointsource/Qioptiq</td><td></td><td>KineFLEX</td></tr><tr><td>NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer&nbsp;</td><td>ラップポリマールGmbH T&uuml;bingen</td><td></td><td>coverslip coating</td></tr><tr><td>non-essential amino acids (NEAA)</td><td>Biochrom</td> <td>#0802E</td><td></td></tr><tr><td>PEG 800 (Polyethylene glycol) 10 %</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Art No. 0263.1</td><td>coverslip coating</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Biochrom</td> <td>#0122E</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid for PINK1-Halo7-Tag expression</td><td>Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン (1.2 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich & Co.</td><td>猫。No.P9155</td><td>カバースリップコーティング</td></tr><tr><td>RGDペプチド (Ac-CGRGDS-COOH)</td><td>コアリングシステム Diagnostix GmbH, Gernsheim</td><td>カバースリップ</td><td></td>コーティング / インターグリン受容体モチーフ</tr><tr><td>シリコンローダミン linked to HaloTag&reg;-Ligand (SiRHTL)&nbsp;</td><td>カイジョンソン</td><td></td><td>染料</td></tr><tr><td>ソフトウェア分析プラグイン</td><td>自筆のCPリヒター、Biophysik Osnabr&uumlからの個人的な贈り物。ck</td><td>スリムファスト 16g</td><td></td></tr><tr><td>テトラメチルローダミン / SNAPセル&reg;SNAP-Ligand(TMRstar)にリンクされたTMR-Star&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ&reg;</td><td>S9105S</td><td>色素</td></tr><tr><td>テトラメチルローダミンとHaloTag&reg;-Ligand(TMRHTL)&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8251</td><td>染料</td></tr><tr><td>TIRF コンデンサ</td><td>オリンパス</td><td>Cell^TIRF MITICO システム</td><td>TIRF コンデンサ</td></tr><tr><td>TIRF 顕微鏡制御ソフトウェア</td><td>オリンパス cellSens 1.12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TIRF 対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>150x オイル対物レンズ (N.A. 1.45;オリンパスUAPO)</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン/ EDTA 10x</td><td>Biochrom</td><td>#0266</td><td></td></tr><tr><td>水H2O 99,5%Rotipuran&reg;低オーガニック&nbsp;</td><td>カールロスGmbH</td><td>アート。いいえ。HN57.1</td><td></td></tr></tbody></table>

単一の膜タンパク質生きた哺乳類細胞の細胞内小器官のマルチカラー ローカリゼーション顕微鏡

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

特定の機能を理解する細胞間のタンパク質の局在についての知識は欠かせません。ローカリゼーションを生成し、これらのタンパク質のマップを追跡によって蛋白質のためアクセスされる microcompartments の定量では、超解像技術を紹介します。また、マルチカラー ローカリゼーション顕微鏡による局在と別の間の蛋白質のプロファイルを追跡ができた。技術は生きているセルの特定、単一のモバイル膜タンパク質の反復的なイメージングに基づきます。興味の蛋白質遺伝子特定、いわゆる自主表示のタグが付いています。これらのタグは、共有結合に基質と反応する酵素です。蛍光染料は、これらの基板に活用されます。蛍光とタグ付きの酵素タンパク質の反応は、分類された蛋白質の基板結果をラベル付けします。ここでは、Tetramethylrhodamine (TMR) とシリコン ローダミン (SiR) は、酵素の基板に接続されている蛍光色素として使用されます。NM の範囲に午後の基質濃度を使用して、亜化学量論的ラベリングを実現、明確なシグナル。これらの信号は 〜 15-27 でローカライズされた nm 精度。テクニックが利用可能な膜透過性染料と酵素を自己ラベリングのレパートリーによって色の数を制限するという単一の分子のマルチカラー イメージングできます。品質管理酵素 (Pten) の局在を決定することにより技術の実現可能性を示す-他の膜タンパク質に関連して処理中に別のミトコンドリア コンパートメントにキナーゼ 1 (PINK1) を誘発します。1 分子 FRET または共同追跡によって異なるラベルの単一蛋白質の物理的な相互作用真のテストは、低ラベル度同時にラベルの付いた 2 つの隣接する蛋白質を持っていることの確率を減少するため、しかし制限です。テクニックは膜コンパートメントに蛋白質のイメージングのために強いが、ほとんどの場合じゃない機動性の高い水溶性タンパク質の局在を決定する適切です。

マルチカラー イメージングと共局在解析は、タンパク質のサブ核の局在を決定する助けることができます。我々 は、ゾル性細胞質ホスファターゼと張力同族体、PINK1 ミトコンドリア プロテアーゼ17での処理のための別のサブ ミトコンドリア場所を持つ前にこれを示した。PINK1 ミトコンドリア機能34,35を保証する重要な要因であります。生きているセルと複数色超解像顕微鏡法 (図 4 a)、処理の過程で異なるミトコンドリア コンパートメント PINK1 のローカライズが行われたを決定します。したがって、PINK1 は自主表示タグ (HaloTag) に融解する遺伝子.ミトコンドリアの機能と機能不全で他の蛋白質を基準にして局在化を決定するには、Tom20、ミトコンドリア外膜 (トム)36translocase の...

生きた細胞の細胞内小器官のマルチカラー単一膜蛋白質のローカリゼーションのためのプロトコルを紹介します。蛍光物質を添付、自己ラベリング タンパク質を使用します。~ 18 の精度と同じ細胞小器官の異なる膜コンパートメントに位置するタンパク質をローカライズできる nm。

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

この手法は、タンパク質のダイナミクスと組織が機能的適応においてどのような役割を果たすかなど、制御プロセスにおける重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、生細胞で行うことができるため、単一分子レベルでのタンパク質動態を明らかにすることができることです。この方法はもともと、ミトコンドリア膜タンパク質の時空間組織に関する洞察を提供するために実装されましたが、他のオルガネラや他の膜タンパク質にも適用できます。このテクニックを実演するのは、私の研究室の大学院生であるTimo Appelhansです。テキストプロトコールに従って細胞サンプルと顕微鏡をトランスフェクションして調製した後、調製したサンプルを蛍光ビーズでPTFEリングと赤色ゴムリングの間のサンプルホルダーにマウントします。顕微鏡、すべてのハードウェアコンポーネント、および顕微鏡検査に必要なすべてのソフトウェアを起動します。イソプロパノールをスプレーした糸くずの出ない新鮮なティッシュを使用して、対物レンズとカバースリップの底を清掃します。次に、対物レンズの瞳孔に液浸油を液滴で置きます。次に、ビーズサンプルを入れたサンプルホルダーを顕微鏡ステージに置き、カバースリップの底がオイルに接触するようにします。次に、透過光またはレーザーラインを使用してビーズに焦点を合わせます。2つの励起レーザーの出力を調整して、2つの蛍光チャネルで同様の信号密度を達成します。次に、多くの異なる蛍光シグナルがある領域を検索します。カメラ制御ソフトウェアを使用して、蛍光チャネルのマージビューを生成します。次に、イメージスプリッターのネジを使用して、内部の光学イメージスプリッターを手動で傾け、2つの蛍光チャンネルからのシグナルを最適に重ね合わせます。TIRF顕微鏡制御ソフトウェアを起動し、ライブストリームモードで個々のチャンネルを表示することを選択します。スナップショット画像を撮影し、すべてのチャネルで蛍光灯を励起します。次に、このイメージを使用して変換行列を生成します。ソフトウェア解析プラグインを起動し、以前に記録した蛍光ビーズの2色画像をソフトウェアにロードします。蛍光チャネルの使用向きを選択します。画像の調整を求められたら [はい] をクリックし、以前に撮影したスナップショットを選択します。ユニット・マネージャーを開いて単位変換係数を定義してから、ローカリゼーション・マネージャーを開きます。ポイントスプレッド機能(PSF)を確認するには、PSF半径ボタンを押します。開いたPSF Estimatorウィンドウで、開口数と最大放出を定義します。次に、「PSF 半径の推定」をクリックします。次に、得られた実験的なPSFを受け入れ、評価ボックス、デフレーションループの数、および計算に使用するコンピューターのコア数を定義します。次に、[ローカライズ]を押して、2D 対称ガウス関数を使用して、単一パーティクルの強度分布のフィッティングを開始します。キャリブレーションマネージャーを開きます。レンダリングされ、マージされた 2 つのチャンネルの画像には、元の信号とローカライズされた中心が表示されます。アフィンモードを選択します。次に、接続線を引いて、同じ蛍光ビーズに由来する2つのチャネル内の局所中心の対応するペアを手動で接続します。視野全体に分布している対応する信号を接続します。次に、[承認] を押して、変換行列を保存します。ミトコンドリア膜タンパク質の単一分子イメージングを行うには、試料カバースリップをゴムとPTFEリングの間に取り付けます。次に、チャンバーに0.5〜0.8ミリリットルのイメージング媒体を充填します。対物レンズとカバーの底面をスリップして清掃します。次に、透過光またはレーザーラインを使用して、レンズにオイルを一滴加えた後、細胞に焦点を合わせます。次に、2つの励起レーザーの出力を調整して同様の強度を達成し、蛍光信号が多い領域を探します。TIRF顕微鏡制御ソフトウェアで照明角度を調整して、臨界角よりも小さい入射角を作成するか、HILOシートを介して特定の関心領域を励起するTIRモードを作成します。HILO照明を使用してTIRF顕微鏡の照明を適応させ、細胞小器官を励起するには、シグナルバックグラウンド比の迅速な判断とTIRF顕微鏡の経験、および細胞形態に関する知識が必要です。EMゲインを設定し、フレームごとに十分な光子を収集する実験に適した露光時間を選択します。次に、高い信号対雑音比を達成するためにレーザー出力を調整します。この比率はローカリゼーション精度に直接対応します。細胞周辺に、重なり合わない細長いミトコンドリアと単一分子のシグナルを持つ領域を見つけます。一方または両方のチャネルに単一のシグナルが見られない場合は、漂白によって単一分子のシグナルが現れるまで待ちます。1つのチャンネルのみを漂白する必要がある場合は、このチャンネルを記録する前に、漂白を避けるために、他のチャンネルのレーザーをオフにしてください。信号の数が少なすぎて妥当な継続ができなくなるまで記録します。イメージング処理ソフトウェアを起動し、少なくとも1, 000フレームの記録されたフレームの累積レンダリング合計画像を生成することにより、ミトコンドリア構造を確認します。ソフトウェア分析プラグインを起動します。ローカリゼーションとトラッキングのためのデータ処理を実行するには、生データを読み込みます。マルチカラーを確認してください。両方のチャネルの正しい向きを選択します。[画像のキャリブレーション] を求められたら、変換マトリックスを読み込みます。チャンネルは別々に表示されます。「表示」をクリックして、画像コンテナから生データを開きます。次に、上部のタブでユニットマネージャーを開き、各チャネルの単位変換係数を定義します。上部のタブでローカライゼーションマネージャーを開き、評価ボックスとデフレーションループの数を定義します。PSF Radiusをクリックして、PSF推定器を開きます。開口数と最大放出数を設定して、理論上のPSF値を取得します。[同意する] を押します。これをすべてのチャネルで繰り返します。次に、[Localize]を押して、両方のチャンネルで記録された信号の単一粒子のローカリゼーションを開始します。ソフトウェアが終了するのを待ちます。これで、各チャネルの超解像画像がソフトウェア解析プラグインの画像コンテナで取得されます。PINK1は、ミトコンドリアの機能を保証する重要な要素です。機能的および機能不全のミトコンドリアにおけるTom20に対するPINK1の局在を決定するために、1, 000フレームの時系列が記録されました。1つのチャネルからのすべてのシグナルの経時的な累積画像は、PINK1が通常の条件下では細胞質、外膜、およびミトコンドリア内に局在しているが、脱分極したミトコンドリアの外膜に優先的に局在していることを示しました。局在化粒子の総計画像が示すように、PINK1は主に分極したミトコンドリア内に分布し、Tom20はミトコンドリア外膜に局在しています。このことは、局在したTom20粒子とPINK1粒子の合体画像でさらに明確になり、外膜タンパク質Tom20の分布がはるかに広いことを示しています。ミトコンドリア内でのPINK1の局在を確認するために、呼吸複合体の30キロダルトンのサブユニットを光活性化性GFPに融合させ、蛍光光活性化局在顕微鏡で記録しました。累積トリプルカラー画像と断面分布は、複素数1とPINK1の重ね合わせを示しており、全長PINK1のインポートを確認しています。これらのデータは、PINK1の亜集団がいくつかのミトコンドリアのマイクロコンパートメントを占めていることを示しています。この手法を習得すると、適切に行われれば、データの記録や後処理を含めて20時間で完了できます。この手順を試みるときは、オルガネラの動きをテストすることを忘れないでください。この手順に続いて、タンパク質の相対的な局在を決定することができます。その開発後、この技術は、ミトコンドリアタンパク質の単一粒子追跡の分野の研究者が、Z2、さまざまな代謝条件、およびストレス下でのミトコンドリアタンパク質の挙動を観察するための道を開きました。このビデオを見れば、ミトコンドリアタンパク質のデュアルカラム顕微鏡検査を行い、そのサブオルガネラの位置と輸送を明らかにする方法について十分に理解できるはずです。

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生物学

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単一の膜タンパク質生きた哺乳類細胞の細胞内小器官のマルチカラーローカリゼーション顕微鏡

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