スクラッチのアッセイの in Vitro細胞遊走の自動光学カメラのテストのために最適化されました。
August 8th, 2018
ここで自動光学カメラ顕微鏡を用いた細胞移行、生体外でテストする手順をについて説明します。スクラッチのアッセイは、傷の閉鎖が一定期間続いている広く使用されています。光学顕微鏡は細胞遊走の信頼性の高い、格安の検出を可能にします。
この手法の主な利点は、自動光学顕微鏡で細胞をリアルタイムで見ることができることです。この治療の意味は、移動がこれらの疾患で重要な役割を果たす慢性創傷または癌の治療にまで及びます。まず、HaCaT細胞のコンフルエント培養物を、洗浄ごとに5ミリリットルの滅菌マグネシウムおよびカルシウムを含まないPBSで2回洗浄します。
次に、細胞を1ミリリットルのトリプシンとともに摂氏37度のインキュベーターで5〜8分間インキュベートします。光学顕微鏡で剥離を確認した後、FBSを添加した9ミリリットルの培地で酵素反応を停止します。そして、細胞を培地とFBS濃度の250マイクロリットルあたり4番目の細胞の7.5倍に希釈します。
次に、丸底の48ウェル組織培養プレートの各ウェルに250マイクロリットルの細胞を播種し、プレートを左右にゆっくりとスライドさせて、細胞がウェル底全体に均等に分布するようにします。次に、プレートを細胞培養インキュベーターに移します。培養物が90〜95%のコンフルエントに達したら、各ウェルの上清を、1ミリリットルあたり10マイクログラムのマイトマイシンCを補充した250マイクロリットルの新たに調製した培地に交換し、プレートをさらに2時間インキュベーターに戻します。
インキュベーションの終わりに、細胞を250マイクロリットルのPBSで洗浄し、250マイクロリットルの新鮮なPBSを各ウェルに加えます。次に、200マイクロリットルのマイクロピペットチップを使用して、各セル単層に1つの垂直スクラッチを作成します。すべての単層に傷がついたら、各ウェルのPBSを目的のペプチド刺激物で250マイクロリットルに交換し、蓋をそのままにしてプレートを光学カメラシステムに取り付けます。
光学カメラを設定するには、取得ウィンドウを開き、創傷治癒を選択します。プレートタイプを選択し、使用していないウェルの選択を解除します。次に、イネーブルをクリックし、ウェルの1つを右クリックして、細胞の位置に合うようにフォーカスを調整します。
画像間隔の下の画像の期間を設定し、希望の期間に合わせて繰り返し回数を設定します。次に、適切な解析タイプを選択します。次に、[開始]をクリックして細胞のイメージングを開始します。
創傷が発生すると、皮膚細胞は増殖し始め、創傷床を横切って移動して創傷を閉じますが、その過程は光学カメラを通して観察することができます。48時間のインキュベーション後、内皮増殖因子治療は、未処理のコントロールウェルで38%、ラクトフェリンおよびラクトフェリシン培養でそれぞれ33および62%の閉鎖と比較して、創傷のほぼ95%の閉鎖を誘発します。最初のスクラッチからのギャップ幅の変化から決定された創傷閉鎖の割合も、各成長刺激についてプロットできます。
このビデオでは、健康な細胞の単層に作られた傷を横切るケラチノサイトの移動を研究するための簡単で効率的なプロトコルについて説明します。このアッセイで使用される細胞はHaCaT細胞ですが、マイクロタイタープレートの底部に付着している限り、他の細胞株、真菌、さらには細菌にもこの方法を適用できます。
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概要
この記事では、自動化された光学カメラ顕微鏡を使用して、インビトロで細胞移動をテストする手順について説明します。スクラッチアッセイは、時間の経過とともに細胞移動を観察するための信頼性の高い方法として強調されています。
主要な研究コンポーネント
科学の領域
- 細胞生物学
- 顕微鏡
- インビトロ技術
背景
- スクラッチアッセイは、細胞移動を研究するための広く使用されている技術です。
- 自動化された光学顕微鏡は、細胞のリアルタイム観察を提供します。
- 細胞移動の理解は、慢性創傷およびがんの治療において重要です。
- この方法は、細胞移動を検出するための費用効果が高く、信頼性の高い手段です。
研究目的
- 細胞移動を評価するための信頼性の高い方法を示す。
- 慢性創傷治療およびがん治療における細胞移動の意味を探る。
- リアルタイム分析のために自動化された光学顕微鏡を利用する。
使用した方法
- HaCaT細胞のコンフルエント培養をPBSで洗浄する。
- 細胞をトリプシンで処理して剥離させる。
- 培養液で酵素反応を停止させる。
- 分析のために細胞を特定の濃度に希釈する。
主要な結果
- 細胞移動のリアルタイム観察が可能でした。
- この方法はスクラッチ閉鎖のモニタリングに効果的であることが証明されました。
- 結果は慢性創傷とがんの治療戦略に情報を提供できます。
- 自動化された顕微鏡は移動評価の信頼性を向上させます。
結論
- 自動化された光学顕微鏡は細胞移動を研究するための貴重なツールです。
- この技術は慢性創傷治癒とがん治療の研究を進めることができます。
- さらなる研究により、さまざまな生物学的文脈での応用が拡大される可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Cell migration assays are critical for evaluating therapeutic candidates in wound healing and oncology, yet traditional scratch assays suffer from edge artifacts and manual analysis bottlenecks. This optimized protocol addresses reproducibility challenges by eliminating cation-mediated cell accumulation and integrating automated imaging, enabling consistent, quantitative migration readouts. The approach supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by providing reliable, real-time data on pro- and anti-migratory compounds.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying migration changes in response to stimuli like lactoferrin or growth factors.
- Operational Value: Reduces variability from manual scratch analysis and temperature fluctuations through automated optical imaging.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, quantitative wound closure metrics from identical scratch sections over time.
- Operational Value: Eliminates labor-intensive image cycling and analysis, improving throughput for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant HaCaT keratinocytes to model epithelial migration, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Ensures assay continuity from discovery to preclinical evaluation via reproducible, automated workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting hypothesis testing in early discovery and enabling quantitative lead identification through measurable migration inhibition or stimulation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating migration as a dependent variable in response to peptide or cytokine treatments.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (e.g., % wound closure) that allow comparison across compound libraries or protein variants.
- Analytics: Generates time-series migration data suitable for statistical comparison and dose-response modeling.
- Translational Research: Connects to preclinical relevance through use of human keratinocyte cells and wound-healing context.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, automated platform for migration assays across multiple projects and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in migration assays.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through automated imaging and consistent scratch preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable, quantitative migration data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on validated migration effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture and sterile technique for monolayer preparation.
- Dependent on automated optical camera systems with time-lapse and analysis capabilities.
- Necessitates standardization of scratch width and timing across wells for comparable data.
- Involves optimization of PBS washing steps to prevent edge artifacts in different cell lines.
- Limited to adherent cells compatible with microtiter plate bottom attachment.
